Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Dit protocol maakt gebruik van een multi-filter microscoop voor live beeldvorming van de gehele structuur van de muis oculaire oppervlak in de dubbele fluorescerende transgene muis model. De combinatie van een aangepaste multifoton microscopisch platform en dubbele fluorescerende transgene muizen maakt de real-time visualisatie van de en de structuur van het oculaire oppervlak. Om de multiphoton microscoop in te stellen, selecteert u de wateronderdompeling 20X, 1.00 NA doelstelling en stel de Titanium Sapphire laser als de excitatiebron op een rechtopstaande microscoop.

Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nanometer voor EGFP en 940 nanometer voor tdTomato. Neem twee dichroic spiegels voor de scheiding van SHG EGFP en EGFP tdTomato en gebruik 434-17, 510-84 en 585-40 nanometer bandpass filters om spectraal scheiden de SHG EGFP en tdTomato signalen. Om de ooghouder op te zetten, plaatst u de muis op het verwarmde microscoopstadium en voegt u een temperatuurbewakingssonde in na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in een verdoofde 8-12 weken oude muis.

Plaats de muis in een aangepaste stereotaxic muishouder en steek oorbalken in de externe auditieve meatus. Gebruik driepuntfixatie om de hoofdhouder te beveiligen en breng een 0,4%Oxybuprocaine Hydrochloride en zoutoplossing aan op het oculaire oppervlak. Bedek de uiteinden van een paar van nummer vijf Dumont tang met de PE buis lus.

Na drie minuten een handmatige ooglid intrekking uit te voeren om oogbal uitsteeksel te bevestigen en zorgvuldig plaats een PE houder buis lus langs het ooglid marge om het ooglid oppervlak bloot te leggen. En gebruik de knop van de houder om de oogbol te stabiliseren met de tangen. Bedek vervolgens het hoornvliesoppervlak met een ooggel met een brekingsindex van 1.338.

Voor Z seriële beeldvorming van het hoornvliesoppervlak, gebruik een kwiklichtbron om het richtveld in beeld te brengen en de microscoopsoftware te openen. Selecteer de juiste fotomultiplier en digitale winsten voor het visualiseren van de cellulaire structuur in het oculaire oppervlak en stel de eerste en laatste dia in om de aankoop van een afbeeldingsstapel mogelijk te maken. Stel de beeldresolutie in op 512 bij 512 pixels en de Z-stap op één micrometer.

Klik vervolgens op start om Z-seriële afbeeldingen te verzamelen die één live-afbeelding verwerven met een 880 nanometer-excitatie voor SHG EGFP-signaalverzameling en één live-beeld bij een excitatie van 940 nanometer voor EGFP tdTomato-signaalverzameling binnen elk gebied. Gebruik de stepper gemotoriseerde podiumhouder om de oogbol te draaien om beeldvorming over het gehele hoornvliesoppervlak mogelijk te maken. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, laadt u de Z-seriële afbeeldingen in Fiji en selecteert u de Mediane 3D-filterplug-in.

Nadat u het achtergrondgeluid hebt verwijderd, selecteert u het onscherpe filterpakket Fiji om de afbeeldingen te verscherpen en op het contrast van de automatische helderheid te klikken om automatisch de kwaliteit van de afbeeldingen te optimaliseren. Sla na verwerking de afbeeldingen op als een seriële beeldreeks en exporteer de beeldreeks naar een geschikt 3D-reconstructiesoftwareprogramma. In alle multifoton microscopie beelden, presenteren de EGFP tdTomato en SHG signalen in pseudo groen, rood en cyaan respectievelijk voor het vastleggen van de 3D-structuur beelden door momentopname.

Multiphoton microscopie maakt de visualisatie van oppervlakkige vleugel- en basale cellen in het hoornvlieseptheel van dubbele fluorescerende transgene muizen mogelijk. Enkele cellen uit de basale laag kunnen worden toegewezen aan de oppervlakkige laag en enkele zeshoekige gevormde oppervlakkige cellen. Zoals blijkt uit de cytoplastische expressie van het tdTomato-signaal, wordt het membraanrijke intracellulaire vesiculaire systeem, inclusief het golgi-apparaat en het endoplasmische reticulum, verspreid in de vleugelcellen.

Binnen de collageenachtige stroma worden de stellatische gevormde coratesites geschetst door het membraan gericht op EGFP-fluorescerende stoffen in deze muizen. De in de collegen stroma ingebedde co-locaties zijn losser verdeeld dan in de endotheelcellen. Bovendien kunnen dunne vertakkingszenuwen in de hoornvliesstroma ook worden gevisualiseerd door membraan gericht op tdTomato-signalen en hoornvlies endotheelcelmonopolies tonen een relatief homogene zeshoekige vorm verbonden in een honinggekamd patroon.

Het Limbale epitheel bestaat uit één tot twee lagen epitheliale cellen. De dubbele fluorescerende reporter transgene stam maakt ook de beeldvorming van haarvaten binnen het bindvlies, het vergemakkelijken van de reconstructie van de 3D-architectuur van de haarvaten waarin de vasculaire endotheel. Het stabiliseren van de oogbol met matige druk zonder letsel is van cruciaal belang voor het verwerven van beelden van goede kwaliteit, omdat onvoldoende of overmatige druk de beeldkwaliteit in gevaar kan brengen.

Dit NVivo beeldbeeldvormingsplatform kan worden aangepast voor visualisatie van structuren onder het oculaire oppervlak en kan worden toegepast op in-situ studies van verschillende oogheelkundige ziekten.