Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva
17 mei 2020
Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.
Dit protocol maakt gebruik van een multi-filter microscoop voor live beeldvorming van de gehele structuur van de muis oculaire oppervlak in de dubbele fluorescerende transgene muis model. De combinatie van een aangepaste multifoton microscopisch platform en dubbele fluorescerende transgene muizen maakt de real-time visualisatie van de en de structuur van het oculaire oppervlak. Om de multiphoton microscoop in te stellen, selecteert u de wateronderdompeling 20X, 1.00 NA doelstelling en stel de Titanium Sapphire laser als de excitatiebron op een rechtopstaande microscoop.
Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nanometer voor EGFP en 940 nanometer voor tdTomato. Neem twee dichroic spiegels voor de scheiding van SHG EGFP en EGFP tdTomato en gebruik 434-17, 510-84 en 585-40 nanometer bandpass filters om spectraal scheiden de SHG EGFP en tdTomato signalen. Om de ooghouder op te zetten, plaatst u de muis op het verwarmde microscoopstadium en voegt u een temperatuurbewakingssonde in na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in een verdoofde 8-12 weken oude muis.
Plaats de muis in een aangepaste stereotaxic muishouder en steek oorbalken in de externe auditieve meatus. Gebruik driepuntfixatie om de hoofdhouder te beveiligen en breng een 0,4%Oxybuprocaine Hydrochloride en zoutoplossing aan op het oculaire oppervlak. Bedek de uiteinden van een paar van nummer vijf Dumont tang met de PE buis lus.
Na drie minuten een handmatige ooglid intrekking uit te voeren om oogbal uitsteeksel te bevestigen en zorgvuldig plaats een PE houder buis lus langs het ooglid marge om het ooglid oppervlak bloot te leggen. En gebruik de knop van de houder om de oogbol te stabiliseren met de tangen. Bedek vervolgens het hoornvliesoppervlak met een ooggel met een brekingsindex van 1.338.
Voor Z seriële beeldvorming van het hoornvliesoppervlak, gebruik een kwiklichtbron om het richtveld in beeld te brengen en de microscoopsoftware te openen. Selecteer de juiste fotomultiplier en digitale winsten voor het visualiseren van de cellulaire structuur in het oculaire oppervlak en stel de eerste en laatste dia in om de aankoop van een afbeeldingsstapel mogelijk te maken. Stel de beeldresolutie in op 512 bij 512 pixels en de Z-stap op één micrometer.
Klik vervolgens op start om Z-seriële afbeeldingen te verzamelen die één live-afbeelding verwerven met een 880 nanometer-excitatie voor SHG EGFP-signaalverzameling en één live-beeld bij een excitatie van 940 nanometer voor EGFP tdTomato-signaalverzameling binnen elk gebied. Gebruik de stepper gemotoriseerde podiumhouder om de oogbol te draaien om beeldvorming over het gehele hoornvliesoppervlak mogelijk te maken. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, laadt u de Z-seriële afbeeldingen in Fiji en selecteert u de Mediane 3D-filterplug-in.
Nadat u het achtergrondgeluid hebt verwijderd, selecteert u het onscherpe filterpakket Fiji om de afbeeldingen te verscherpen en op het contrast van de automatische helderheid te klikken om automatisch de kwaliteit van de afbeeldingen te optimaliseren. Sla na verwerking de afbeeldingen op als een seriële beeldreeks en exporteer de beeldreeks naar een geschikt 3D-reconstructiesoftwareprogramma. In alle multifoton microscopie beelden, presenteren de EGFP tdTomato en SHG signalen in pseudo groen, rood en cyaan respectievelijk voor het vastleggen van de 3D-structuur beelden door momentopname.
Multiphoton microscopie maakt de visualisatie van oppervlakkige vleugel- en basale cellen in het hoornvlieseptheel van dubbele fluorescerende transgene muizen mogelijk. Enkele cellen uit de basale laag kunnen worden toegewezen aan de oppervlakkige laag en enkele zeshoekige gevormde oppervlakkige cellen. Zoals blijkt uit de cytoplastische expressie van het tdTomato-signaal, wordt het membraanrijke intracellulaire vesiculaire systeem, inclusief het golgi-apparaat en het endoplasmische reticulum, verspreid in de vleugelcellen.
Binnen de collageenachtige stroma worden de stellatische gevormde coratesites geschetst door het membraan gericht op EGFP-fluorescerende stoffen in deze muizen. De in de collegen stroma ingebedde co-locaties zijn losser verdeeld dan in de endotheelcellen. Bovendien kunnen dunne vertakkingszenuwen in de hoornvliesstroma ook worden gevisualiseerd door membraan gericht op tdTomato-signalen en hoornvlies endotheelcelmonopolies tonen een relatief homogene zeshoekige vorm verbonden in een honinggekamd patroon.
Het Limbale epitheel bestaat uit één tot twee lagen epitheliale cellen. De dubbele fluorescerende reporter transgene stam maakt ook de beeldvorming van haarvaten binnen het bindvlies, het vergemakkelijken van de reconstructie van de 3D-architectuur van de haarvaten waarin de vasculaire endotheel. Het stabiliseren van de oogbol met matige druk zonder letsel is van cruciaal belang voor het verwerven van beelden van goede kwaliteit, omdat onvoldoende of overmatige druk de beeldkwaliteit in gevaar kan brengen.
Dit NVivo beeldbeeldvormingsplatform kan worden aangepast voor visualisatie van structuren onder het oculaire oppervlak en kan worden toegepast op in-situ studies van verschillende oogheelkundige ziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een multiphoton-microscopisch platform voor live imaging van het oogoppervlak van de muis met behulp van een duaal fluorescent transgeen muismodel. Het systeem maakt real-time visualisatie mogelijk van diverse cellulaire structuren binnen het oogoppervlak.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ophthalmologie
- Microscopie
Achtergrond
- Multiphotonmicroscopie is een krachtige beeldvormingstechniek.
- Fluorescerende transgene muizen zorgen voor een verbeterde visualisatie van cellulaire componenten.
- Het begrijpen van de structuur van het oogoppervlak is cruciaal voor diverse onderzoekstoepassingen.
- Labelvrije beeldvormingstechnieken kunnen fluorescerende methoden aanvullen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor live-imaging van het oogoppervlak van de muis.
- Het gebruik van een op maat gemaakte multifotonmicroscoop voor verbeterde visualisatie.
- Het demonstreren van de mogelijkheden van dubbel fluorescente transgene muizen bij imaging.
Gebruikte methoden
- Configuratie van een multifotonmicroscoop met specifieke objectieven en laserinstellingen.
- Gebruik van dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters voor signaalscheiding.
- Live-imaging van geanestheseerde muizen op een verwarmde microscooptafel.
- Realtime visualisatie van structuren van het oogoppervlak.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van celkernen, membranen en zenuwvezels.
- Labelvrije beeldvorming van stromale architecturen met behulp van tweede harmonische generatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van het multifotonplatform.
- De mogelijkheden voor real-time visualisatie zijn gevalideerd.
Conclusies
- Het multifoton-microscopieplatform is effectief voor beeldvorming van het oog.
- Duaal fluorescerende transgene muizen verbeteren de visualisatie van oogstructuren.
- Deze methode kan het onderzoek in de oogbiologie en aanverwante vakgebieden bevorderen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit multiphoton-microscopieplatform maakt labelvrije live-beeldvorming van structuren op het oogoppervlak van muizen mogelijk, wat cruciale inzichten verschaft in de biologie van het hoornvlies en het bindvlies voor de ontdekking van oftalmologische geneesmiddelen. Door cellulaire dynamiek, stromale architectuur en vasculaire netwerken in vivo te visualiseren, ondersteunt de methode het mechanische de-risking van therapeutische targets in preklinische modellen van oogziekten. Het vermogen van het platform om het gehele oogoppervlak met nauwkeurige positionering in beeld te brengen, vergroot het voorspellend vertrouwen bij target-validatie en in pipelines voor assay-ontwikkeling.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de visualisatie van celkernen, membranen, zenuwvezels en capillairen in levend oogweefsel.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets door real-time observatie van de stromale architectuur via second harmonic generation en cellulaire dynamiek in duale fluorescente reporters.
- Voorspellende waarde: Verbetert de triage van portfolio's door het leveren van kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van structurele en cellulaire veranderingen in ziekterelevante oogmodellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door hoge-resolutie beeldvorming van epitheliale, stromale, endotheliale en vasculaire compartimenten mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via nauwkeurige Z-stack acquisitie, spectrale scheiding van SHG- en fluorescentiesignalen en gestabiliseerde positionering van de oogbol.
- Strategische waarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening en het hergebruik van het platform door beeldvorming over het gehele hoornvlies- en conjunctiva-oppervlak mogelijk te maken met minimale fototoxiciteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door de reconstructie van de 3D-capillaire architectuur in de conjunctiva en de visualisatie van de limbal epitheellaag mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door intravitale beeldvorming te ondersteunen met nauwkeurige positionering over verschillende regio's van het botoppervlak.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door labelvrije stromale beeldvorming en cellulaire mapping te bieden, wat bijdraagt aan het mechanistische begrip van oculaire pathologie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische beeldvorming, ter ondersteuning van hypothesetesten en mechanistische risicoreductie in het oogheelkundig onderzoek.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt door live imaging van cellulaire en structurele dynamiek in het oogoppervlak mogelijk te maken.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve output via Z-seriële imaging, spectrale signaalscheiding en gestabiliseerde imaging-condities.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken, waaronder SHG voor collageenarchitectuur en tdTomato/EGFP voor membraan- en nucleaire lokalisatie.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door 3D-reconstructie van capillairen en mapping van de epitheellaag in ziekterelevante modellen mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, aanpasbaar aan diverse oftalmologische ziekte-modellen en imaging-eindpunten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de biologie van het oogoppervlak.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door middel van een op maat gemaakte ooghouder, stereotaxische positionering en gecontroleerde beeldvormingsparameters.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege visualisatie van target-engagement en weefselrespons mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling via kwantitatieve, labelvrije en fluorescente read-outs in de corneale en conjunctivale compartimenten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in multifotonmicroscopie, ooganatomie en de omgang met transgene modellen.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een titanium-saffierlaser, dichroïsche spiegels, banddoorlaatfilters, een gemotoriseerde tafel en software voor 3D-reconstructie.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor beeldgevingsprotocollen, instellingen voor signaaldetectie en pijplijnen voor beeldverwerking (bijv. Fiji-plugins voor ruisonderdrukking en contrastverbetering).
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, inclusief aanpassing van de ooglidstabilisatie, koppelingsgel voor het oogoppervlak en excitatiegolflengten voor verschillende fluorescente reporters.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: het stabiliseren van de oogbol met matige druk zonder letsel toe te brengen is cruciaal, aangezien onvoldoende of overmatige druk de beeldkwaliteit verslechtert.
