Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Meer dan een miljoen uniform van de druppels worden geproduceerd op de vinger-sized substraat. En enkele DNA-moleculen worden willekeurig verdeeld in elke druppel. De eiwitopbrengst is evenredig aan het aantal moleculen in een druppel.

Onze techniek kan worden gebruikt voor een snelle en kwantitatieve meting van enzymactiviteit zonder ingewikkelde eiwitexpressie en zuivering. Om te beginnen, zet een deksel glas op een kleuring rek en plaats het rek in acht molaire natriumhydroxide. Soniceer het afdekglas en het kleurrek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Haal het kleurrek uit natriumhydroxide en spoel het afdekglas 10 keer af met water. Droog het afdekglas met een luchtbuks. Bak en droog het afdekglas vervolgens vijf minuten op een hete plaat op 200 graden Celsius.

Bereid 0,05% aminosilane oplossing. Dompel het afdekglas in deze oplossing en broed het een uur lang in bij kamertemperatuur. Spoel het dekglas vijf keer in zuiver water.

Droog vervolgens het afdekglas met een luchtbuks. Bak het op de hete plaat op 80 graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats het afdekglas substraat op een aangepaste vacuüm chuck voor de spin coater.

Doe 70 tot 90 microliter type-A CYTOP polymeer in het midden van het glazen substraat. Dan onmiddellijk spin-coat het polymeer. De eerste polymeercoating beschadigt de kwaliteit van de uiteindelijke microkamerarray.

Doseer het polymeer op het midden van het afdekglas zonder luchtbellen in te voeren. Pak het gecoate glas door het op de hoeken te houden en plaats het op een aluminiumfolie. Bak het gedurende 30 minuten op 80 graden Celsius en dan voor nog een uur op 200 graden Celsius.

Doe 0,2 tot 0,3 milliliter fotoresist in het midden van het substraat. Draai de fotoresist onmiddellijk 60 seconden op 6.000 tpm. Gebruik een met ethanol doordrenkte doekje om de overtollige fotoresist van de randen van het substraat te verwijderen.

Bak het substraat op 110 graden Celsius gedurende vijf minuten. Om de fotoresist te rehydrateren, laat het substraat 30 minuten staan bij een relatieve vochtigheid van 42 tot 60%Laad het substraat in de masker aligner en stel het gedurende 25 seconden bloot in een vacuümcontactmodus. Dompel het substraat vervolgens vijf minuten onder in de ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist op te lossen.

Spoel het substraat 10 keer af met zuiver water. Droog vervolgens het substraat grondig met behulp van het luchtbuks. Plaats het substraat in de reactiekamer van de reactieve ionenetsmachine en etsen de fotoresist bedekt CYTOP met het zuurstofplasma.

Na het etsen, verwijder de resterende fotoresist door sonicating het substraat in aceton gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens sonicate het substraat in propanol gedurende vijf minuten. Spoel, sonisch en spoel het substraat opnieuw af met zuiver water zoals beschreven in het manuscript.

Droog vervolgens het substraat met een luchtbuks. Met behulp van een desktop cutter, gesneden dubbelgecoate lijm Kapton film tape in de gedefinieerde microchannel vormen. Plak de gesneden stukjes tape in de bodem van een platte petrischaal om te dienen als een meester voor het vormen van de PDMS.

Giet het PDMS-mengsel in de petrischaal met tapepatroon. Plaats vervolgens de petrischaal in een mini vacuümkamer en deaerate het PDMS mengsel voor een tot drie uur. Plaats vervolgens de petrischaal in een oven op 60 graden Celsius en laat het 's nachts om de PDMS te genezen.

Nadat de PDMS is uitgehard, pel je het geharde elastomeer uit de petrischaal en gebruik je een platte kabelsnijder om de PDMS-microkanaalblokken uit te snijden. Sla vervolgens een gat aan elk uiteinde van elk microkanaal. Het eerder geprepareerde substraat heeft een ruimte voor de microkamerarray.

Plaats de PDMS microchannel op dit deel van het substraat. Steek vervolgens een 200 microliter pipetpunt in een van de gaten in de PDMS microchannel. Bereid eerst de CFPS-reactieoplossing voor in een PCR-buis.

Dan, met behulp van een 200 microliter niet-filter pipet tip, opstellen 10 microliter van de oplossing. Steek de pipetpunt in het inlaatgat van de PDMS-microkanaal en duw de pipetzuiger naar beneden totdat de oplossing overstroomt van het microkanaaluitlaat. Breng het FemDA-apparaat over naar een vooraf gekoeld aluminiumblok.

Bevestig dat het arraygebied voor microkamers snel verandert van doorschijnend naar transparant. Teken 300 microliters voorgekoelde spoelolie en breng de olie onmiddellijk over in de pipetpunt van het microkanaalinlaatgat. De spoelolie beweegt zich in het microkanaal en extrudeert de overtollige reactieoplossing buiten de microkamers.

Verwijder tegelijkertijd de twee ingebrachte pipettips van het apparaat. Verplaats het apparaat onmiddellijk van het aluminiumblok naar paraffinefilm. Steek de voorbereide pipetpunt met de afdichtingsolie in de inlaat van het PDMS-microkanaal en injecteer de olie totdat deze uit de uitlaat overstroomt.

De femtoliter druppels worden in individuele microkamers verzegeld door de olie. Open de gedefocuste BF-afbeelding. Als u vloeiende doorlopende achtergronden uit elk frame wilt verwijderen, selecteert u Achtergrond aftrekken in het menu Proces.

Voer 20 in voor de rolbalstraal. Schakel het selectievakje Voorbeeld in en schakel Oke in. Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd of alle afbeeldingen moeten worden verwerkt.

Selecteer vervolgens Proces, Filters, Mediaan om het geluid te verminderen. Voer 2.0 in voor de straal in pixels. Schakel het selectievakje Voorbeeld in en schakel Oke in.

Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd of alle afbeeldingen moeten worden verwerkt. Selecteer vervolgens Afbeelding, Aanpassen, Drempel om de afbeeldingen van de microkamers te scheiden van de achtergrond van de afbeelding. Selecteer FemDA, FemDA Analysis in het menu Plug-ins.

Voer het geschatte minimum- en maximumaantal pixels van één microkamer in. De verwachte minimale en maximale circulariteit van de microkamers en de start- en eindframenummers en selecteert vervolgens ROI genereren om de microkamers te detecteren. De met succes gedetecteerde ROI's worden weergegeven in het pop-upmenu ROITable.

Selecteer ROI-masker toepassen in het venster FemDA-analyse. Bestudeer de afbeelding om te zien of de microkamers goed zijn gedetecteerd. Open het fluorescentiebeeld en breng het naar voren.

Klik nogmaals op ROI-masker toepassen om de ROI's toe te voegen aan de fluorescentieafbeelding. Selecteer in het venster FemDA-analyse One-Shot om eindpuntgegevens van afbeeldingen te analyseren. Voer N in voor het aantal toppixels om de toppixels van elke ROI te gebruiken om de gemiddelde intensiteit van de overeenkomstige druppel te berekenen.

Klik vervolgens op Intensiteit meten om de gemiddelde intensiteit van alle gedetecteerde druppels te berekenen. De ROITable wordt bijgewerkt met de nieuwe gegevens van de fluorescentieafbeelding en het histogram wordt weergegeven in een nieuw venster. Exporteer de gegevens door op de knop Opslaan als tekst te klikken.

Fluorescerende oplossing werd ingekapseld in FemDA microkamers en de fluorescentie intensiteit, die is gecorreleerd met druppelgrootte werd gemeten met behulp van microscopie. De druppels bleken een smalle verdeling te hebben. Het gereconstrueerde 3D-beeld van de confocale microscopie toonde ook de consistente druppelgrootte in de tijd.

De druppels waren stabiel bij kamertemperatuur zonder verdampingsverlies of kruisbesmetting tussen druppels gedurende ten minste 24 uur. Het fluorescerende eiwit mNeonGreen werd gesynthetiseerd in FemDA. En de stack beeldgegevens werden geanalyseerd met behulp van de gelijktijdige onscherpe heldere veld beeld.

Omdat de fluorescentieintensiteit van elke druppel wordt gemeten van de eiwitopbrengst, suggereert het histogram sterk ongelijke aantallen DNA-moleculen per druppel. De kans dat druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen perfect pasten bij een Poisson-verdeling. Synthese van het enzym alkalische fosforfosfatase werd ook uitgevoerd in FemDA met beelden die elke vijf minuten worden vastgelegd.

De reactie toonde een vergelijkbare discrete verdeling van de fluorescentie intensiteit van de druppels op een eerder tijdstip en het histogram resultaten geverifieerd dat de ongelijke aantallen van de DNA-moleculen in de druppels. Enkele DNA-molecuul ingekapseld in individuele druppels kan verder worden teruggewonnen, versterkt, en gesequenced maken het hoogste eiwitten screening mogelijk. Een druppeltechniek met een klein volume en een hoge stabiliteit zorgt voor een snelle en nauwkeurige moleculaire diagnose van kankerziekten met specifieke biomarkers.