Name: Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer een femtoliter druppelarray voor cell-free eiwitsynthese met enkele DNA-moleculen. Deze methode maakt snelle, kwantitatieve enzymactiviteitsmetingen mogelijk zonder complexe eiwitexpressie en zuivering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI subsidienummer JP18K14260 en het budget van Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Wij danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) en Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) voor het leveren van de karakteriseringsfaciliteiten. Wij danken Ken Takai (JAMSTEC) voor commerciële software ondersteuning. De microfabricage werd uitgevoerd op Takeda Sentanchi Supercleanroom, de Universiteit van Tokio, ondersteund door "Nanotechnology Platform Program" van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPP09F19UT0087.

<ol><li>Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplets+for+ultrasmall-volume+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplets for ultrasmall-volume analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).</li>
<li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Zhu, P. A., Wang, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+droplet+generation+with+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive and active droplet generation with microfluidics: a review.</a> Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tubes+to+drops%3A+droplet-based+microfluidics+for+ultrahigh-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004(2013).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22DNA+Nanotechnology%22">DNA Nanotechnology</a>. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).</li>
<li>Dubuc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microcompartmentalised+transcription-translation+for+the+prototyping+of+synthetic+communication+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).</li>
<li>Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+approaches+in+synthetic+biology+utilizing+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics.</a> Genes. 9 (3), (2018).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell-free+protein+synthesis+in+synthetic+biology%3A+Interfacing+bio-machinery+with+synthetic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments.</a> Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).</li>
<li>Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+artificial+life%3A+techniques+for+bottom-up+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology.</a> Micromachines. 10 (5), (2019).</li>
<li>Bowman, E. K., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplet-assisted+screening+of+biomolecule+production+for+metabolic+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications.</a> Trends in Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+high-throughput+screening+based+on+digital+protein+synthesis+in+a+massively+parallel+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array.</a> Science Advances. 5 (8), 8185(2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+high-performance+perfluorinated+polymer+electret+and+its+application+to+micro+power+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011(2008).</li>
<li>Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+enzymatic+assay+in+a+directly+accessible+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array.</a> Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nature Communications. 5, 4519(2014).</li>
<li>Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+plasmon+waveguides+and+devices+in+Cytop+with+integrated+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).</li>
<li>Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+using+straight+long-range+surface+plasmon+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides.</a> Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).</li>
<li>Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+invisible+visible%3A+a+microfluidic+chip+using+a+low+refractive+index+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer.</a> Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).</li>
<li>Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting+using+thin+fluoroploymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting-on-dielectric+platform+using+multi-layer+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+system+for+long-term+perfusion+culture+and+on-line+monitoring+of+intestinal+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models.</a> Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).</li>
<li>Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoropolymer-coated+PDMS+microfluidic+devices+for+application+in+organic+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry-a+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis.</a> Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).</li>
<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wetting%3A+statics+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Wetting: statics and dynamics.</a> Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Wagner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+fluorinated+polyglycerols+for+droplet+microfluidics+as+an+alternative+to+PEG-based+copolymer+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants.</a> Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).</li>
<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%3A+a+tool+for+biology%2C+chemistry+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidic+systems+for+high-throughput+single+DNA+molecule+isothermal+amplification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).</li>
<li>Galinis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanoparticles+for+improved+protein+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+bioassays%3A+theory%2C+applications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital bioassays: theory, applications, and perspectives.</a> Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Courtois, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+device+for+monitoring+time-dependent+in+vitro+expression+from+single+genes+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets.</a> ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).</li>
<li>Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding%3A+tracking+mobile+micro-reactors+for+high-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+PDMS+isn%27t+the+best%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">When PDMS isn't the best.</a> Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Bradshaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+of+Escherichia+coli+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMantilla%2C+CB+%22Techniques+in+Confocal+Microscopy%22">Techniques in Confocal Microscopy</a>. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).</li>
<li>Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+counting+of+biomolecules+with+femtoliter+dropret+chamber+array%5BTitle%5D)+AND+%22The+17th+International+Conference+on+Solid-State+Sensors%2C+Actuators+and+Microsystems+%28TRANSDUCERS+%26+EUROSENSORS+XXVII%22%5BJournal%5D)">Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array.</a> The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-localization+for+fast+analysis+of+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays.</a> Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+barcode-inspired+automatic+analysis+for+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays.</a> Biomicrofluidics. 7 (3), 034110(2013).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+processing%22">Digital image processing</a>. , Pearson. New York, NY. (2018).</li>
<li>Cohen, L., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+arrays+for+protein+and+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De zeer kwantitatieve meting op basis van de zeer uniforme, stabiele en biocompatibele druppels in FemDA maakte de discrete distributie mogelijk, het unieke kenmerk van onze studie die verschilt van andere. We hebben de processen voor microfabricage en druppelvorming systematisch geoptimaliseerd en gedetailleerd in dit document. Er zijn verschillende kritieke stappen in het vastgestelde protocol.
Ten eerste bepaalt de uniforme coating van zeer viskeuze CYTOP-polymeer op het rechthoekige dunne ...

Onderzoekers gebruiken reactoren om bio/chemische reacties uit te voeren. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de omvang van de reactor te verkleinen en de experimentele doorvoer te verhogen om het reagensverbruik te verlagen en tegelijkertijd de werkefficiëntie te verbeteren. Beide aspecten zijn erop gericht onderzoekers te bevrijden van een zware werkdruk, de kosten te verlagen en onderzoek en ontwikkeling te versnellen. We hebben een duidelijke historische routekaart over de ontwikkeling van de reactortechnologieën vanuit het oogpunt van reactievolumes en doorvoer: enkele bekers/kolf/reageerbuizen, milliliterbuizen, microliterbuizen, microliter 8-buisstrips, microliter 96/384/1536-putplaat en microfluïde nanoliter/picoliter/femtoliterreactoren1,2,3,4,5,6,7. Analoog aan het verkleinen van de functiegrootte van transistors op geïntegreerde circuitchips in de halfgeleiderindustrie in de afgelopen decennia, bio/ chemische microreactoren gaan door volumereductie en systeemintegratie. Dergelijke kleinschalige instrumenten hebben een diepgaande impact gehad op celgebaseerde of celvrije synthetische biologie, biomanufacturing en prototyping en screening met hoge doorvoer8,9,10,11,12. Dit document beschrijft onze recente inspanningen op de ontwikkeling van een unieke druppel array technologie en toont de toepassing ervan in CFPS13, een fundamentele technologie voor synthetische biologie en moleculaire screening gemeenschappen14. In het bijzonder bieden we bewust een geoptimaliseerd en goedkoop protocol om het FemDA-apparaat voor iedereen toegankelijk te maken. Het goedkope en gemakkelijk te hanteren protocol voor het geminiaturiseerde apparaat zou bijdragen aan de educatieve doeleinden van universiteiten en de technologie helpen verspreiden.
FemDA bereidt femtoliterdruppels met een ultrahoge dichtheid van 106 per 1 cm2 op een vlakke glazen substraat. We hebben een hydrofoob polymeer, CYTOP15,op het glazen substraat gecoat en selectief geëtst (verwijderd) CYTOP op vooraf gedefinieerde posities om een microkamerarray op het substraat te genereren. Zo bestaat de resulterende microkamer uit een hydrofobe zijwand (CYTOP) en een hydrofiele bodem (glas). Wanneer achtereenvolgens stromend water en olie over het patroonoppervlak stromen, kan het water worden gevangen en verzegeld in de microkamers. De hydrofiele hydrofiele structuur is van vitaal belang voor het afweren van water buiten de microkamers, het isoleren van individuele microreactoren en het behouden van een kleine waterige oplossing in de femtoliterruimte. De unieke eigenschap werd met succes toegepast voor de bereiding van water-in-olie druppels en lipide bilayer microcompartimenten16,17. Vergeleken met het prototype apparaat16,hebben we eerst geoptimaliseerd de microfabricage proces om een volledige verwijdering van de CYTOP polymeer en een volledige blootstelling van de glazen bodem te realiseren. CYTOP is een speciaal fluorpolymeer met een extreem lage oppervlaktespanning (19 mN/m) lager dan die van conventionele microreactormaterialen zoals glas, kunststoffen en siliconen. De goede optische, elektrische en chemische prestaties zijn reeds gebruikt bij de oppervlaktebehandeling van microfluïde apparaten18,19,20,21,22,23,24. In het FemDA-systeem moet, om een goede bevochtiging van de olie op het CYTOP-oppervlak te bereiken, de oppervlaktespanning van de olie lager zijn dan die van het vaste oppervlak25. Anders, de vloeibare olie in contact met het vaste oppervlak heeft de neiging om bolvormig te worden in plaats van zich te verspreiden over het oppervlak. Bovendien vonden we dat sommige populaire perfluorkoolwaterstofoliën (bijvoorbeeld 3M FC-40)16 en hydrofluoroether oliën (bijvoorbeeld 3M Novec-serie) CYTOP kunnen oplossen als gevolg van de amorfe morfologie van CYTOP, wat dodelijk is voor kwantitatieve metingen en twijfelachtig zou zijn in termen van kruisbesmetting tussen druppels. Gelukkig hebben we een biocompatibele en milieuvriendelijke olie geïdentificeerd die een lagere (< 19 mN/m) oppervlaktespanningvertoont 13. We vonden ook een nieuwe oppervlakteactieve stof die kan oplossen in de geselecteerde olie en functie in een lage concentratie (0,1%, ten minste 10 keer lager dan eerder gemeld populaire degenen26,27)13. De resulterende water/olie-interface kan worden gestabiliseerd door de oppervlakteactieve. Vanwege de hoge verdampingssnelheid van de olie, na de spoeling met de olie, hebben we een andere biocompatibele en milieuvriendelijke olie aangebracht om de eerste te vervangen om de microkamers te verzegelen. We noemen de eerste olie (ASAHIKLIN AE-3000 met 0,1 wt % SURFLON S-386) de "spoelolie" en de tweede olie (Fomblin Y25) de "afdichtingsolie", respectievelijk.
De twee-staps olie-afdichting strategie kan een robuuste vorming van de femtoliter druppel array te realiseren binnen enkele minuten en zonder geavanceerde instrumentatie. Als gevolg van de verdamping probleem, is het beschouwd als een uitdaging om microreactoren kleiner dan picoliter volumes28genereren . FemDA heeft dit probleem aangepakt door de materialen en processen die worden gebruikt voor de bereiding van microreactoren/druppels systematisch te optimaliseren. Verschillende opmerkelijke kenmerken van de resulterende druppels zijn de hoge uniformiteit (of monodispersity), stabiliteit, en biocompatibiliteit op de femtoliter schaal. De variatiecoëfficiënt (CV) van het druppelvolume is slechts 3% (zonder vignetteringscorrectie voor de microscopische beelden), het kleinste CV onder druppelplatforms ter wereld, wat zorgt voor een zeer parallelle en kwantitatieve meting. De femtoliter druppel is stabiel voor ten minste 24 uur zonder kruisbesmetting tussen druppels bij kamertemperatuur, wat waardevol is voor een betrouwbare tijd-cursus meting. Wat de biocompatibiliteit betreft, zijn we erin geslaagd om verschillende eiwitten te synthetiseren uit een enkelkopiesjabloon-DNA in de druppel van de femtoliter, die voorheen als moeilijk of inefficiënt29,30werd beschouwd . Het zou het waard zijn om te verduidelijken waarom sommige eiwitten die in staat zijn om gesynthetiseerd te worden in de FemDA niet kunnen worden gesynthetiseerd in andere druppelsystemen. FemDA was niet alleen een technische vooruitgang, maar realiseerde ook een ongekend kwantitatieve meting die de eiwitopbrengst (zoals weerspiegeld door de fluorescentieintensiteit van de druppel) kan correleren met het aantal sjabloon-DNA-moleculen in elke druppel. Als gevolg hiervan toonde het histogram van de fluorescentieintensiteit van druppels van femda-gebaseerde CFPS een discrete verdeling die mooi kan worden gemonteerd door een som Gaussische verdelingen van gelijke piek-naar-piekintervallen. Bovendien was de waarschijnlijkheid van het optreden van druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen een perfecte pasvorm voor een Poisson-distributie31. Zo kan de verschillende eiwitopbrengst in elke druppel worden genormaliseerd op basis van de discrete verdeling. Deze kritieke eigenschap stelt ons in staat om de enzymatische activiteitsinformatie te scheiden van de schijnbare intensiteit, die nog niet beschikbaar is met andere microreactorplatforms. Bestaande microfluïde cel/druppelsorteersystemen zijn bedreven in volautomatisch sorteren en zijn goed in het concentreren van monsters, maar kunnen soms alleen een relatief breed of langstaart histogram produceren in het analytische aspect32,33. Ons zeer kwantitatieve en biocompatibel FemDA-systeem zet een nieuwe maatstaf en een hoge analytische standaard op het gebied van microreactorontwikkeling.
De oliën en oppervlakteactieve stoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van druppels zijn nog steeds zeer beperkt34. De combinatie van ASAHIKLIN AE-3000 en SURFLON S-386 gevestigd in FemDA is een nieuw lid van het groeiende arsenaal van de fysiochemische interface tussen de waterige fase en de oliefase13. De nieuwe interface in FemDA is fysiek stabiel, chemisch inert en biologisch compatibel met de complexe transcriptie-, vertaal- en post-translationele modificatiemachines voor vele soorten eiwitten13. Het zou eerder aantrekkelijk zijn om een eiwit te vinden dat niet in plaats daarvan in de druppelinstellingen kan worden gesynthetiseerd. Bovendien is de kostenbesparing van reagentia meer zichtbaar in het femtoliter druppelsysteem dan in nanoliter- en picoliterreactorsystemen35,36. In het bijzonder zou er vaak een groot dood volume, dat voornamelijk wordt veroorzaakt door buizen of externe leveringen, in microfluïde druppelgeneratie systemen, maar niet in onze FemDA. Het arrayformaat wordt ook begunstigd door herhaalde en gedetailleerde microscopische karakterisering (vergelijkbaar met de zogenaamde high-content analyse) voor elke reactor37,in plaats van slechts een enkele momentopname voor een snel bewegend object. De femtoliter schaal maakte de integratie van meer dan een miljoen reactoren op een vinger-sized gebied, terwijl hetzelfde aantal nanoliter reactoren (indien het bestaat) vereist meer dan vierkante meter gebied, die ongetwijfeld onpraktisch zou zijn voor de vervaardiging of het gebruik van een dergelijk systeem.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-spuit</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL-kwaliteit</td><td>EL: voor elektronisch gebruik.</td></tr><tr><td>3D laser scanning confocal microscoop</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>Andere vergelijkbare microscopen (bijv. Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) zijn ook toepasbaar.</td></tr><tr><td>50 mL-spuit</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>6,8-difluoro-4-methylumbelliferylfosfaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>Bereid een 5 mM-voorraadoplossing in dimethylsulfoxide</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL-kwaliteit</td><td>EL: voor elektronisch gebruik. Zuiverheid 99,8%.</td></tr><tr><td>Luchtblazer</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumblok</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium microbuisjestandaard</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td><td>(Testmonster)</td><td>Gratis testmonster is beschikbaar op aanvraag bij AGC.</td></tr><tr><td>BEMCOT PS-2-doek</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>Biopsiepunch met plunjer</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Matsunami Glass</td><td>Nr. 1 (24 mm × 32 mm, 0,13~0,17 mm dikte)</td><td>Op maat gemaakte grootte.</td></tr><tr><td>Dekglas-klem</td><td>Nakayama</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe schone doek</td><td>Nippon Paper Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>Snijmat</td><td>GE Healthcare</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>Ontluchtmixer</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>Desktop cutter</td><td>Roland</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>Ontwikkelaar</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>AZ Electronic Materials is nu overgenomen door Merck. Andere alkalische ontwikkelaars zijn ook toepasbaar, maar vereisen mogelijk optimalisatie van ontwikkelingscondities (tijd, temperatuur, enz.)</td></tr><tr><td>Dubbellaags zelfklevend Kapton-folietape</td><td>Teraoka Seisakusho</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL-kwaliteit</td><td>EL: voor elektronisch gebruik. Zuiverheid 99,5%.</td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Versie: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>Flat-kabelsnijder</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Fomblin olie</td><td>Solvay</td><td>Y25 of Y25/6</td><td>Gratis testmonster is beschikbaar op aanvraag bij Solvay. Fomblin Y25/6 is een alternatief als Y25 niet direct beschikbaar is.</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>AS ONE</td><td>TH-900</td><td></td></tr><tr><td>Injectienaald</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G × 70 mm</td></tr><tr><td>Inverteerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Epifluorescentiespecificatie, CCD- of sCMOS-camera, gemotoriseerde stage, autofocus-systeem en hoog NA-objectief zijn vereist.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>Versie: 4.5</td></tr><tr><td>Maskeraligner</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>Andere maskeraligners zijn ook toepasbaar zolang de vacuümcontactmodus beschikbaar is.</td></tr><tr><td>MICROMAN-pipet</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>Capillaire zuigertip: CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Versie: 16.16.15</td></tr><tr><td>Mini vacuümkamer</td><td>AS ONE</td><td>MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR-buis</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>Diameter 90 mm, hoogte 15 mm.</td></tr><tr><td>Fotoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>AZ Electronic Materials is nu overgenomen door Merck. AZ P4620 is een alternatief.</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen handschoenen</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>Handelsnaam: Saniment.</td></tr><tr><td>PURExpress in vitro-eiwitsynthesekit</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S of E6800L</td><td>Voor celvrije eiwitsynthesereactie.</td></tr><tr><td>Reactieve-ion-etssysteem</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>Andere RIE-systemen zijn ook toepasbaar, maar vereisen mogelijk optimalisatie van RIE-condities (gasstroomsnelheid, kamerdruk, RF-vermogen, etchtijd, enz.)</td></tr><tr><td>RNase-remmer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Scotchtape</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide-oplossing</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>8 M concentratie; gevaar.</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Oshigane</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386-oppervlakteactieve stof</td><td>AGC</td><td>(Testmonster)</td><td>Gratis testmonster is beschikbaar op aanvraag bij AGC.</td></tr><tr><td>SYLGARD 184-siliconenelastomeer</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>Chemische samenstelling: polydimethylsiloxaan. De standaard mengverhouding is base : hardener = 10 : 1 (m/m).</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF.SA.1 2A</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoonreiniger</td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumklem</td><td>Oshigane</td><td>(Op maat gemaakt)</td><td>Materiaal: delrin; rechthoekige monsterstandaard met meerdere gaten (48 gaten, elk met 1 mm diameter); de grootte is op maat gemaakt om te passen op de grootte van het dekglas (24 mm × 32 mm).</td></tr></tbody></table>

een femtoliter droplet array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele dna-moleculen

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

De vooruitgang in ruimtelijke resolutie en detectiegevoeligheid van wetenschappelijke instrumentatie maakt het mogelijk om kleine reactoren toe te passen voor biologisch en chemisch onderzoek. Om aan de vraag naar hoogwaardige microreactoren te voldoen, ontwikkelden we een femtoliter druppelarray (FemDA) apparaat en illustreerden we de toepassing ervan in massaal parallelle celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties. Meer dan een miljoen uniforme druppels werden gemakkelijk gegenereerd binnen een vinger-sized gebied met behulp van een twee-staps olie-afdichting protocol. Elke druppel was verankerd in een femtoliter microkamer bestaande uit een hydrofiele bodem en een hydrofobe zijwand. De hybride hydrofiele hydrofiele structuur en de speciale afdichtingsoliën en oppervlakteactieve stoffen zijn cruciaal voor het stabiel vasthouden van de femtoliter waterige oplossing in de femtoliter ruimte zonder verdampingsverlies. De femtoliter configuratie en de eenvoudige structuur van het FemDA apparaat maakten een minimaal reagensverbruik mogelijk. De uniforme dimensie van de druppelreactoren maakte grootschalige kwantitatieve en tijdsmetingen overtuigend en betrouwbaar. De FemDA-technologie correleerde de eiwitopbrengst van de CFPS-reactie met het aantal DNA-moleculen in elke druppel. We hebben de procedures over de microfabricage van het apparaat, de vorming van de femtoliterdruppels en de verwerving en analyse van de microscopische beeldgegevens gestroomlijnd. Het gedetailleerde protocol met de geoptimaliseerde lage bedrijfskosten maakt de FemDA-technologie toegankelijk voor iedereen die standaard cleanroomfaciliteiten en een conventionele fluorescentiemicroscoop op zijn eigen plaats heeft.

Het microfabricageproces bestaat uit substraatreiniging, oppervlaktefunctionalisatie, CYTOP-coating, fotolithografie, droge etsen, fotoresisten strippen en uiteindelijke reiniging. Belangrijk is dat het gepresenteerde protocol volledige verwijdering van het hydrofobe CYTOP-polymeer in de microkamers figuur 3Amogelijk liet , waardoor een zeer parallelle hydrofiele hydrofiele-in-hydrofobe structuur op een standaard afdekglassubstraat werd geproduceerd. Met behulp van het olieafdichtingsprotoco...

Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Meer dan een miljoen uniform van de druppels worden geproduceerd op de vinger-sized substraat. En enkele DNA-moleculen worden willekeurig verdeeld in elke druppel. De eiwitopbrengst is evenredig aan het aantal moleculen in een druppel.Onze techniek kan worden gebruikt voor een snelle en kwantitatieve meting van enzymactiviteit zonder ingewikkelde eiwitexpressie en zuivering. Om te beginnen, zet een deksel glas op een kleuring rek en plaats het rek in acht molaire natriumhydroxide. Soniceer het afdekglas en het kleurrek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Haal het kleurrek uit natriumhydroxide en spoel het afdekglas 10 keer af met water. Droog het afdekglas met een luchtbuks. Bak en droog het afdekglas vervolgens vijf minuten op een hete plaat op 200 graden Celsius.Bereid 0,05% aminosilane oplossing. Dompel het afdekglas in deze oplossing en broed het een uur lang in bij kamertemperatuur. Spoel het dekglas vijf keer in zuiver water.Droog vervolgens het afdekglas met een luchtbuks. Bak het op de hete plaat op 80 graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats het afdekglas substraat op een aangepaste vacuüm chuck voor de spin coater.Doe 70 tot 90 microliter type-A CYTOP polymeer in het midden van het glazen substraat. Dan onmiddellijk spin-coat het polymeer. De eerste polymeercoating beschadigt de kwaliteit van de uiteindelijke microkamerarray.Doseer het polymeer op het midden van het afdekglas zonder luchtbellen in te voeren. Pak het gecoate glas door het op de hoeken te houden en plaats het op een aluminiumfolie. Bak het gedurende 30 minuten op 80 graden Celsius en dan voor nog een uur op 200 graden Celsius.Doe 0,2 tot 0,3 milliliter fotoresist in het midden van het substraat. Draai de fotoresist onmiddellijk 60 seconden op 6.000 tpm. Gebruik een met ethanol doordrenkte doekje om de overtollige fotoresist van de randen van het substraat te verwijderen.Bak het substraat op 110 graden Celsius gedurende vijf minuten. Om de fotoresist te rehydrateren, laat het substraat 30 minuten staan bij een relatieve vochtigheid van 42 tot 60%Laad het substraat in de masker aligner en stel het gedurende 25 seconden bloot in een vacuümcontactmodus. Dompel het substraat vervolgens vijf minuten onder in de ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist op te lossen.Spoel het substraat 10 keer af met zuiver water. Droog vervolgens het substraat grondig met behulp van het luchtbuks. Plaats het substraat in de reactiekamer van de reactieve ionenetsmachine en etsen de fotoresist bedekt CYTOP met het zuurstofplasma.Na het etsen, verwijder de resterende fotoresist door sonicating het substraat in aceton gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens sonicate het substraat in propanol gedurende vijf minuten. Spoel, sonisch en spoel het substraat opnieuw af met zuiver water zoals beschreven in het manuscript.Droog vervolgens het substraat met een luchtbuks. Met behulp van een desktop cutter, gesneden dubbelgecoate lijm Kapton film tape in de gedefinieerde microchannel vormen. Plak de gesneden stukjes tape in de bodem van een platte petrischaal om te dienen als een meester voor het vormen van de PDMS.Giet het PDMS-mengsel in de petrischaal met tapepatroon. Plaats vervolgens de petrischaal in een mini vacuümkamer en deaerate het PDMS mengsel voor een tot drie uur. Plaats vervolgens de petrischaal in een oven op 60 graden Celsius en laat het 's nachts om de PDMS te genezen.Nadat de PDMS is uitgehard, pel je het geharde elastomeer uit de petrischaal en gebruik je een platte kabelsnijder om de PDMS-microkanaalblokken uit te snijden. Sla vervolgens een gat aan elk uiteinde van elk microkanaal. Het eerder geprepareerde substraat heeft een ruimte voor de microkamerarray.Plaats de PDMS microchannel op dit deel van het substraat. Steek vervolgens een 200 microliter pipetpunt in een van de gaten in de PDMS microchannel. Bereid eerst de CFPS-reactieoplossing voor in een PCR-buis.Dan, met behulp van een 200 microliter niet-filter pipet tip, opstellen 10 microliter van de oplossing. Steek de pipetpunt in het inlaatgat van de PDMS-microkanaal en duw de pipetzuiger naar beneden totdat de oplossing overstroomt van het microkanaaluitlaat. Breng het FemDA-apparaat over naar een vooraf gekoeld aluminiumblok.Bevestig dat het arraygebied voor microkamers snel verandert van doorschijnend naar transparant. Teken 300 microliters voorgekoelde spoelolie en breng de olie onmiddellijk over in de pipetpunt van het microkanaalinlaatgat. De spoelolie beweegt zich in het microkanaal en extrudeert de overtollige reactieoplossing buiten de microkamers.Verwijder tegelijkertijd de twee ingebrachte pipettips van het apparaat. Verplaats het apparaat onmiddellijk van het aluminiumblok naar paraffinefilm. Steek de voorbereide pipetpunt met de afdichtingsolie in de inlaat van het PDMS-microkanaal en injecteer de olie totdat deze uit de uitlaat overstroomt.De femtoliter druppels worden in individuele microkamers verzegeld door de olie. Open de gedefocuste BF-afbeelding. Als u vloeiende doorlopende achtergronden uit elk frame wilt verwijderen, selecteert u Achtergrond aftrekken in het menu Proces.Voer 20 in voor de rolbalstraal. Schakel het selectievakje Voorbeeld in en schakel Oke in. Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd of alle afbeeldingen moeten worden verwerkt.Selecteer vervolgens Proces, Filters, Mediaan om het geluid te verminderen. Voer 2.0 in voor de straal in pixels. Schakel het selectievakje Voorbeeld in en schakel Oke in.Selecteer Ja wanneer u wordt gevraagd of alle afbeeldingen moeten worden verwerkt. Selecteer vervolgens Afbeelding, Aanpassen, Drempel om de afbeeldingen van de microkamers te scheiden van de achtergrond van de afbeelding. Selecteer FemDA, FemDA Analysis in het menu Plug-ins.Voer het geschatte minimum- en maximumaantal pixels van één microkamer in. De verwachte minimale en maximale circulariteit van de microkamers en de start- en eindframenummers en selecteert vervolgens ROI genereren om de microkamers te detecteren. De met succes gedetecteerde ROI's worden weergegeven in het pop-upmenu ROITable.Selecteer ROI-masker toepassen in het venster FemDA-analyse. Bestudeer de afbeelding om te zien of de microkamers goed zijn gedetecteerd. Open het fluorescentiebeeld en breng het naar voren.Klik nogmaals op ROI-masker toepassen om de ROI's toe te voegen aan de fluorescentieafbeelding. Selecteer in het venster FemDA-analyse One-Shot om eindpuntgegevens van afbeeldingen te analyseren. Voer N in voor het aantal toppixels om de toppixels van elke ROI te gebruiken om de gemiddelde intensiteit van de overeenkomstige druppel te berekenen.Klik vervolgens op Intensiteit meten om de gemiddelde intensiteit van alle gedetecteerde druppels te berekenen. De ROITable wordt bijgewerkt met de nieuwe gegevens van de fluorescentieafbeelding en het histogram wordt weergegeven in een nieuw venster. Exporteer de gegevens door op de knop Opslaan als tekst te klikken.Fluorescerende oplossing werd ingekapseld in FemDA microkamers en de fluorescentie intensiteit, die is gecorreleerd met druppelgrootte werd gemeten met behulp van microscopie. De druppels bleken een smalle verdeling te hebben. Het gereconstrueerde 3D-beeld van de confocale microscopie toonde ook de consistente druppelgrootte in de tijd.De druppels waren stabiel bij kamertemperatuur zonder verdampingsverlies of kruisbesmetting tussen druppels gedurende ten minste 24 uur. Het fluorescerende eiwit mNeonGreen werd gesynthetiseerd in FemDA. En de stack beeldgegevens werden geanalyseerd met behulp van de gelijktijdige onscherpe heldere veld beeld.Omdat de fluorescentieintensiteit van elke druppel wordt gemeten van de eiwitopbrengst, suggereert het histogram sterk ongelijke aantallen DNA-moleculen per druppel. De kans dat druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen perfect pasten bij een Poisson-verdeling. Synthese van het enzym alkalische fosforfosfatase werd ook uitgevoerd in FemDA met beelden die elke vijf minuten worden vastgelegd.De reactie toonde een vergelijkbare discrete verdeling van de fluorescentie intensiteit van de druppels op een eerder tijdstip en het histogram resultaten geverifieerd dat de ongelijke aantallen van de DNA-moleculen in de druppels. Enkele DNA-molecuul ingekapseld in individuele druppels kan verder worden teruggewonnen, versterkt, en gesequenced maken het hoogste eiwitten screening mogelijk. Een druppeltechniek met een klein volume en een hoge stabiliteit zorgt voor een snelle en nauwkeurige moleculaire diagnose van kankerziekten met specifieke biomarkers.

a-femtoliter-droplet-array-for-massively-parallel-protein-synthesis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.

Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.

DNA-gebonden RNA-polymerase voor programmeerbare in vitro transcriptie en moleculaire berekening

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Leer een femtoliter druppelarray voor cell-free eiwitsynthese met enkele DNA-moleculen. Deze methode maakt snelle, kwantitatieve enzymactiviteitsmetingen mogelijk zonder complexe eiwitexpressie en zuivering.

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Meer video's verkennen