Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken
7 mei 2020
Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.
Dit protocol is belangrijk omdat het een aanpasbaar, stereotactisch proces is dat zowel bij muizen als ratten kan worden gebruikt en kan worden toegepast op veel nieuwe neurowetenschappelijke technieken. Het grootste voordeel van deze aanpasbare stereotactische procedure is het vermogen om het te gebruiken om uitdagende en moeilijk te bereiken delen van de hersenen te targeten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chelsea Faber, een jonge, getalenteerde post-doctorale onderzoeksmedewerker in het laboratorium.
Na te hebben bevestigd dat de frame en micromanipulator zijn gekalibreerd, plaats de middelste hoogtemeter in de aansluiting van de basisplaat van de hoofdhouder. Bevestig de centreerrichting in de gereedschapshouder en kijk door de richting. Pas de positie van de micromanipulator aan tot de kruislijnen zijn uitgelijnd en scherp staan op de kruislijnen van de meter, en plaats de oorbeugels in de houders zodat de indicatorlijnen aan beide kanten op nul staan.
Gebruik de mediaal-lateraal en anterieure-posterieure knoppen op de hoofdhouder om de oorbeugels in het X- en Y-vlak boven de kruislijnen van de middelste hoogtemeter te centreren. Om de positie van de oorbeugel in de Z-as te richten, verwijder de oorbeugels uit de houder en verwijder de middelste hoogtemeter. Vervolgens de oorbeugels weer plaatsen en de beugel op nul centreren.
Kijk vervolgens weer door de richting en gebruik respectievelijk de verticale verschuiving en coronale kantelnop om de oorbeugels te verlagen en te draaien tot de kruislijnen van de richting gecentreerd blijven tussen de oorbeugels tijdens coronale rotatie. Om de centrale rotatie-as voor hoekige coördinaten uit te lijnen, bevestig de centreerrichting in de gereedschapshouder en plaats de micromanipulator op de berekende coördinaat. Merk op dat de rechter/linker coördinaat voor de hoekige implantatie overeenkomt met de lengte van zij A. Kijk door de richting en markeer deze coördinaat om het punt te vertegenwoordigen waarop de cannula de hersenen zal binnenkomen, zodra het hoofd is geroteerd.
Plaats de micromanipulator opnieuw boven de middellijn en gebruik de coronale kantelnop om het hoofd te draaien naar de berekende hoek. Als de kruislijnen van de richting niet overeenkomen met het referentiemerk, gebruik de verticale verschuivingsknop om de hoofdpositie in de Z-as aan te passen tot de kruislijnen zo dicht mogelijk bij het merk liggen. Op dit punt moet het willekeurige draaipunt worden uitgelijnd met het draaipunt van de stereotax.
Draai het hoofd terug naar de nulgraad coronale positie voordat u doorgaat naar de volgende boor- en micro-injectiestappen. Na het uitvoeren van de micro-injectie, brengt u het hoofd terug naar de nulgraad niveaupositie en gebruikt u een handboor om twee gaten vooraan en twee gaten achteraan te plaatsen, ver genoeg van de hoekige coördinatenboorgaten om de ferrule-gedeelte van de lichtgeleider te plaatsen die boven de schedel zit. Wanneer alle gaten zijn geboord, gebruikt u een kleine kruiskopschroevendraaier om de botschroeven zo voorzichtig mogelijk in te brengen, zodat ze stevig in de schedel zitten zonder de hersenen te penetreren.
Klem een lichtgeleider-cannula in de cannula-houder en plaats de cannula-houder in de gereedschapshouder. Draai het hoofd naar de berekende hoek, waarbij wordt opgemerkt dat de coördinaten van de micromanipulator niet van toepassing zijn op het nieuwe gereedschap. Gebruik het centrum van de hoekige boorgaten als het doelwit voor de implantatie.
Laat de lichtgeleider zakken tot deze net de duura binnen het centrum van het boorgat raakt en nullen de micromanipulator in de Z-as. Laat de lichtgeleider langzaam zakken naar de dorsale ventrale hoekige coördinaat en gebruik cyanoacrylaatgel om de lichtgeleider-ferrule te verbinden met de ipsilaterale ankerschroeven. Gebruik een micropipettip om een versneller aan te brengen.
Zodra de gel volledig is uitgehard, verlaagt u voorzichtig en tilt u de cannula-houder op totdat deze vrij komt van de ferrule. Implanteer de tweede lichtgeleider naar de contralaterale hoekige coördinaat en niveau het hoofd. Voor extra veiligheid gebruikt u de cyanoacrylaatgel en versneller om een extra verbinding te maken tussen de twee hoekige lichtgeleider-cannulas en brengt u een kleine, relatief dunne hoeveelheid tandcement aan op het oppervlak van de schedel, waarbij u ervoor zorgt dat de ankerschroeven en de basis van de lichtgeleider-cannulas volledig worden bedekt.
Om de rol van hypothalamus ventromedial nucleus neuronen in glycemische controle te onderzoeken, werd in deze representatieve analyse een standaard, niet-hoekige, stereotactische aanpak gebruikt voor de bilaterale micro-injectie van een remmend kanaal rho-dopsin-virus naar de ventromedial nucleus. Gezien de nabijheid van de ventromedial nucleus aan de middellijn, lieten ruimtebeperkingen geen niet-hoekige implantatie van bilaterale lichtgeleiders toe, waardoor de ontwikkeling van een chirurgische strategie noodzakelijk was voor het nauwkeurig implanteren van lichtgeleiders onder een hoek. De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om gewoon geduldig te zijn en je tijd te nemen, omdat consistent en nauwkeurig zijn met je coördinaattoewijzingen cruciaal is voor succes.
Deze procedure kan worden aangepast en toegepast op elke neurowetenschappelijke methode die micro-injectie of implantatie in de hersenen van knaagdieren vereist, inclusief chemogenetica, optogenetica en fiber fotometrie benaderingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een stereotactische procedure die een hoekige coronale benadering gebruikt om moeilijk bereikbare hersengebieden te targeten in zowel muis- als ratmodellen. Dit aanpasbare protocol kan worden toegepast op verschillende neurowetenschappelijke toepassingen, inclusief canule-implantatie en micro-injecties van virale constructen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurochirurgische technieken
- Experimentele interventies in diermodellen
Achtergrond
- De procedure maakt nauwkeurig targeten van uitdagende hersengebieden mogelijk.
- Kan worden aangepast voor verschillende technieken in de neurowetenschappen.
- Geschikt voor zowel muis- als ratmodellen, wat de toepasbaarheid verhoogt.
- Ondersteunt ontwikkelingen in technieken die micro-injectie of implantatie vereisen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor toegang tot en manipulatie van moeilijke hersengebieden.
- Om verschillende toepassingen in de neurowetenschappen te vergemakkelijken, zoals optogenetica en chemogenetica.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers die soortgelijke technieken willen implementeren.
Gebruikte methoden
- De methode omvat stereotactische chirurgie voor gerichte hersprocedures.
- Zowel muis- als ratmodellen worden gebruikt voor procedures zoals canule-implantatie.
- Geen multiomics workflows worden genoemd.
- Belangrijke stappen omvatten het kalibreren van de micromanipulator en het uitlijnen van coördinaten voor nauwkeurige implantatie.
- Het protocol benadrukt nauwkeurige coördinaattoewijzingen voor succesvolle resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol schetst succesvol de stappen die nodig zijn voor hoekige implantatie en micro-injectie.
- Belangrijke proceduredetails zorgen voor nauwkeurigheid bij het targeten van specifieke hersengebieden.
- Toont de mogelijkheid om bilaterale lichtgeleidende implantaten uit te voeren ondanks ruimtelijke beperkingen.
- Benadrukt het belang van zorgvuldige planning en uitvoering bij neurochirurgische interventies.
Conclusies
- Dit protocol toont een methode voor het implanteren van apparaten in moeilijk bereikbare hersengebieden.
- Vacilitteert verschillende neurowetenschappelijke methoden en verbetert onderzoeksmogelijkheden.
- De implicaties strekken zich uit tot het begrijpen van gedrags- en fysiologische reacties binnen doelgerichte regio's.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Targeting deep brain structures with precision remains a critical bottleneck in neuroscience-driven target validation, particularly for midline-adjacent nuclei where conventional stereotactic approaches fail due to vascular and ventricular constraints. This adaptable angled approach enables reliable access to otherwise inaccessible regions, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in preclinical models. By facilitating consistent hardware implantation for optogenetics, chemogenetics, and fiber photometry, it enhances predictive confidence in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutically relevant nuclei such as the hypothalamic ventromedial nucleus in glucose homeostasis models.
- Operational Value: Supports bilateral viral vector delivery and fiberoptic implantation in spatially constrained brain regions.
- Strategic Value: Reduces failure rates in target modulation experiments due to inaccurate targeting.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible surgical platforms for downstream neuromodulation assays.
- Operational Value: Ensures consistent electrode or cannula placement across animals, reducing variability in readouts.
- Strategic Value: Enables scalable implementation of intracranial techniques in discovery screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains anatomical fidelity when modeling human brain circuits in rodent systems.
- Operational Value: Supports longitudinal studies requiring stable intracranial hardware.
- Strategic Value: Improves reproducibility of behavioral and physiological endpoints in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery biology phase, enabling precise target engagement before progressing to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via targeted neuronal inhibition or activation in disease-relevant circuits.
- Screening: Delivers assay-ready models with verified intracranial targeting for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable neural activity or behavioral outputs linked to precise anatomical targeting.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation through consistent target modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable surgical framework applicable across multiple neuroscience techniques and brain targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by minimizing off-target effects from misplaced implants.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinate systems and angle-adjusted implantation.
- Strategic Value: Reduces resource waste from failed experiments due to inaccurate targeting.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on reliable target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and coordinate system calibration.
- Dependent on precise micromanipulator alignment and angle adjustment capabilities.
- Necessitates validation of implantation accuracy via histological or imaging confirmation.
- Must account for species-specific brain anatomy when adapting between mouse and rat models.
- Relies on meticulous procedural execution to avoid tissue damage during angled tract insertion.
