Name: Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer retrovirale overexpressie van CXCR4 op murine B-1a cellen en adoptieve overdracht om celmigratie naar het beenmerg en IgM-productie te bestuderen. Deze methode biedt stabiele gendelivery voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 van P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) en R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye werd ondersteund door American Heart Association Pre-doctorale fellowship 16PRE30300002 en 5T32AI007496-20. Wij danken Joanne Lannigan, Mike Solga, en Claude Chew van de Universiteit van Virginia Flow Cytometrie Core voor hun uitstekende technische bijstand.

Alle dierenprotocollen zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Magnetische scheiding en verrijking van buikvlies B-1 cellen
<ol><li>Euthanaseren een 12−14 weken oude, man, CD45.1+ApoE-/- muis met CO2.</li>
	<li>Maak een oppervlakkige snede in de buik met behulp van rechte chirurgische schaar en schil terug huid met behulp van gebogen schaar om de buikvlieswand bloot. Spoel de buikholte met 10 mL van 37 °C RPMI-1640 medium met behulp van een 10 mL spuit en 25 G naald. Schud de muis om cellen los te maken door de staart vast te grijpen en de muis gedurende 15-20 s grondig naar de zijkant te bewegen. OPMERKING: Het masseren van het gespoelde buikvlies kan ook het herstel van de cel maximaliseren.</li>
	<li>Verzamel peritoneale vloeistof met behulp van een 10 mL spuit en 25 G naald door het opstellen van vloeistof aan de rechterbenedenzijde van het buikvlies net boven het niveau van de heup, in de buurt van de darmen. Vermijd het verstoren van epidydimale vetdepots en onderliggende organen. Vermijd het trekken van vloeistof van de linkerkant van de muis als de omental vet kan gemakkelijk worden getrokken in de spuit.</li>
	<li>Zodra ~6−7 mL vloeistof is verzameld, af te zien in een 50 mL conische buis geplaatst op ijs. Verhoog vervolgens de muis verticaal door de buikvlieswand boven het middenrif te houden met behulp van tangen, zodat de resterende vloeistof aan de onderkant van de buikholte blijft. Maak een kleine snede in de buikvlieswand met behulp van chirurgische schaar boven de lever (zorg ervoor dat de lever niet snijden) en verzamel de resterende buikvliesvloeistof met behulp van een glazen pipet en lamp.</li>
	<li>Pool peritoneale washoutcellen van alle CD45.1+ApoE-/- muizen (n = 15−20) in 50 mL conische buizen, en slaan op ijs. OPMERKING: Voor het berekenen van het aantal muizen dat nodig is: B-1a cellen omvatten 5−10% van de totale buikvliespopulatie en leveren ongeveer 2,5−5 x 105 B-1a cellen per muis in de handen van auteurs. De transductie-efficiëntie is ~30−40%, zoals hieronder weergegeven.</li>
	<li>Tel levende cellen met behulp van een levensvatbare kleurstof zoals trypanblauw en een hemocytometer (verdun monsters 1:5 in trypanblauw en laad 10 μL in de hemocytometerkamer). Bundel cellen tot 1 x 108 cellen per buis. Centrifugecellen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C, dan aanzuigen supernatant.</li>
	<li>Tot 1 x 108 cellen in 1 mL anti-CD16/CD32-antilichaam(Tabel van materialen)verdund tot 1:50 in testbuffer (1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS], 0,5% runderserumalbumin [BSA], 2 mM EDTA) om Fc-receptoren te blokkeren. Schaal indien nodig op basis van het aantal cellen. Incubeer 10 minuten op ijs bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid een 2x master mix van de biotinylated antilichamen(Tabel 1) in testbuffer voor uitputting. De 2x master mix is verantwoordelijk voor het volume van de vloeistof waarin de cellen zich al bevinden bij het uitbroeden met anti-CD16/CD32. Als cellen bijvoorbeeld uitbroeden in 500 μL verdunde anti-CD16/CD32, voeg vervolgens 500 μL 2x mastermix toe met 10 μL biotinylated Ter119, Gr-1, CD23 en NK1.1 antilichamen en 25 μL biotinylated F4/80-antilichaam om de in tabel 1vermelde eindconcentraties te bereiken. Voeg 2x master mix toe aan cellen en vlek gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Was cellen met 5 mL testbuffer en centrifuge bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en spoel supernatant aan.</li>
	<li>Resuspend en incubaat cellen met anti-biotine microbeads (Tabel van materialen) verdund in testbuffer volgens de concentratie en het protocol aanbevolen door de fabrikant.</li>
	<li>Was met 5 mL testbuffer en centrifuge op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aanzuigen supernatant en resuspend tot 1 x 108 cellen in 500 μL van testbuffer.</li>
	<li>Eerste magnetische selectiekolommen(Tabel van materialen) met 3 mL testbuffer. Breng cellen over op geprimede magnetische selectiekolommen en verzamel het eluent met verrijkte B-1 cellen in een 15 mL conische buis op ijs. Was de magnetische selectiekolom met extra testbuffer tot het totale verzamelde volume 10 mL is. OPMERKING: Een aliquot van de voorgezuiverde en post-gezuiverde celfracties moet afzonderlijk worden geanalyseerd door stroomcytometrie voor zuiveringsefficiëntie door kleuring voor CD19+ B-cellen, F480+ macrofagen en CD5+ T-cellen zoals weergegeven in figuur 2.</li>
	<li>Tel de post-gezuiverde celfractie (het eluent dat verrijkte B-1 cellen bevat) door levende cellen te tellen als in stap 1.6, en resuspend op 1 x 106 cellen/mL in B-celkweekmedium (RPMI-1640, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum [FBS], 10 mM HEPES, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μg/mL gentamicine, 55 μM β-mercaptoethanol).</li>
</ol>2. Peritoneale B-1 celstimulatie
<ol><li>Gesplitste gepoolde cellen voor de twee getransduceerde omstandigheden (Ctl-GFP en CXCR4-GFP), terwijl ze ten minste 10 x 106 cellen opzij zetten en platingen voor een niet-getransduceerde besturing.</li>
	<li>Plaat tot 150 μL (150.000 cellen) per goed in 96-goed ronde-bodemplaten.</li>
	<li>Voeg 100 nM TLR9 agonist ODN1668 toe aan alle putten om celproliferatie te stimuleren.</li>
	<li>Incubeer voor 16-18 uur bij 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>3. Retrovirale transductie van buikvlies B-cellen
<ol><li>Cenerful-GFP (MigR1) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes genereren met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen14. OPMERKING: Dit zal enkele dagen duren, dus bereid en titer retrovirale voorraden en sla aliquots op -80 °C voorafgaand aan het starten van dit protocol.</li>
	<li>Ontdooi retrovirusvoorraden op ijs. Gebruik onmiddellijk en niet opnieuw bevriezen als virus titer aanzienlijk vermindert tijdens vries-dooi cycli. Voeg Ctl-GFP of CXCR4-GFP retrovirale supernatants toe bij 20:1 veelheid van infectie (MOI) aan cellen, in aanwezigheid van 8 μg/mL polybrene en verse β-mercaptoethanol bij 55 μM eindconcentratie. Voeg geen virale voorraden toe aan de cellen die zijn gereserveerd voor de niet-getransduceerde controle.</li>
	<li>Voer spinfectie uit door middel van centrifugingplaten op 800 x g gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeerplaten met retrovirus bij 37 °C, 5% CO2 voor nog eens 3 uur.</li>
	<li>Oogst en replate cellen in vers B-celmedium en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 's nachts.</li>
</ol>4. Celsorde van getransduceerde buikvlies B-1acellen
<ol><li>Oogst gekweekte cellen en verloop in drie afzonderlijke 50 mL conische buizen voor elke aandoening: niet-getransduceerd, Ctl-GFP getransduceerd, en CXCR4-GFP getransduceerd.</li>
	<li>Tel levende cellen zoals in stap 1.6, dan centrifuge op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en aanzuigen supernatant.</li>
	<li>Resuspend cellen bij 100.000 cellen/μL in sort buffer (PBS + 1% BSA) met 1:50 anti-CD16/CD32 antilichaam (Tabel van materialen) om Fc receptoren te blokkeren. Incubeer 10 minuten op ijs bij 4 °C.</li>
	<li>Aliquot cellen voor compensatie controles (~ 30.000 cellen per compensatie controle): voor niet-bevlekte en enkele vlek controles aliquot van niet-getransduceerde monster en voor GFP enkele vlek controle aliquot van getransduceerde monsters. OPMERKING: Commercieel beschikbare compensatiekralen kunnen ook worden gebruikt voor besturingselementen met één vlek als het niet-getransduceerde celnummer laag is.</li>
	<li>Bereid een 2x antilichaam master mix met de fluorofofoforeren-geconjugeerde antilichamen in sort buffer (Tabel 1). Voeg 2x mastermix toe aan niet-getransduceerde, CTL-GFP-getransduceerde en CXCR4-GFP-getransduceerde monsters. Voeg individuele antilichamen toe aan enkele vlekcontroles. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker. OPMERKING: De 2x master mix is verantwoordelijk voor het volume vloeistof waarin de cellen zich al bevinden bij het uitbroeden met anti-CD16/CD32, zoals in stap 1.8. Een aliquot van cellen van elke voorwaarde kan afzonderlijk worden gekleurd voor CXCR4 om CXCR4 overexpressie te bevestigen.</li>
	<li>Was monsters met 1 mL soortbuffer en zeef door 70 μm filters in polypropyleenbuizen.</li>
	<li>Centrifuge bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en aanzuigen supernatant. Resuspend samples at 50,000 cells/μL in sort buffer.</li>
	<li>Voordat de celsorlingsing gelabeld fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuizen (FACS) voorslepen met 1 mL inzamelmedium (RPMI-1640, 20% warmte-geïnactiveerde FBS, 10 mM HEPES, 1x niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 μg/mL gentamicine, 55 μM β-mercaptoethanol) voor elke te sorteren populatie.</li>
	<li>Voorafgaand aan het uitvoeren van monsters op de celsorteerder voeg 2x DAPI (bereid als 1:5000 verdunning in sorteerbuffer) toe voor dode celdiscriminatie.</li>
	<li>Sorteer GFP+ B-1a cellen in FACS buizen met collectiemedium als DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ cellen uit de CTL-GFP en CXCR4-GFP samples. Gebruik het niet-getransduceerde monster om de GFP+ poort in te stellen en dapi- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ niet-getransduceerde B-1a cellen te sorteren. OPMERKING: Als alternatief kunnen niet-getransduceerde cellen ook worden gesorteerd uit de CTL-GFP- en CXCR4-GFP-monsters door B-1a-cellen afzonderlijk in de GFP-fractie te gating. Getransduceerde of niet-getransduceerde B-1b cellen kunnen ook worden gesorteerd met behulp van dit soort strategie als DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- cellen.</li>
</ol>5. Adoptieoverdracht
<ol><li>Na het sorteren van cellen centrifugeren centrifugecellen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en supernatant voorzichtig aanzuigen.</li>
	<li>Resuspend cellen in koude steriele 1x PBS bij 1.000 cellen/μL.</li>
	<li>Verdoven mannelijke Rag1-/- ApoE-/- muizen die isofluraan gebruiken en injecteren 100 μL (100.000 cellen) per muis via intraveneuze retro-orbitale of staartaderinjectie met behulp van een ultrafijne insulinespuit. Injecteer een paar muizen met 1x PBS als controle.</li>
</ol>6. Kwantificering van donorcellen en plasma IgM
<ol><li>Op het gewenste moment post-adoptieve overdracht, analyseren overgedragen cellen in de ontvanger muizen door beenmerg en milt weefsel oogst4 en flow cytometrie. Kwantificeer de lokalisatie van donorcellen en CXCR4 overexpressie door vlekken op CD45.1, CD45.2 en CXCR4 en analyseer de resultaten van de stroomcytometrie met behulp van een software zoals Flowjo. OPMERKING: Zie tabel 1 voor antilichamen die in deze stap worden gebruikt. Zorg ervoor dat u geen antilichaamconjugaat gebruikt die fluoresceert in het FITC-kanaal, omdat GFP aanwezig zal zijn op getransduceerde donorcellen.</li>
	<li>Isoleer plasma door 10 μL 0,5 M EDTA toe te voegen aan volbloed dat wordt verzameld via hartpunctie op het moment van het offeren van dieren. Centrifuge volbloed bij 7.000 x g en aliquot plasma in afzonderlijke 1,5 mL centrifugebuizen. Bewaar op -80 °C tot het uitvoeren van analyse van gedecretde factoren zoals IgM door ELISA4.</li>
</ol>

<ol><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1a+cell+diversity%3A+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li>
<li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+%28IgH%29+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083(2015).</li>
<li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li>
<li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells%3A+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li>
<li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li>
<li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li>
<li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li>
<li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).</li>
<li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function%3A+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li>
<li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li>
<li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li>
<li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation%2C+cell+survival%2C+and+Ig+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li>
<li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li>
<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double+life+of+a+B-1+cell%3A+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier geboden methode maakt stabiele en relatief efficiënte primaire B-1a-celgenlevering, in vivo adoptieoverdracht en identificatie en lokalisatie van geïnjecteerde cellen mogelijk. Cellen konden worden gedetecteerd 17 weken na de cel overdracht en behouden verhoogde CXCR4 expressie. Retrovirus-gemedieerde levering leverde 30-40% transductie-efficiëntie van primaire murine B-1a cellen met minimale impact op de levensvatbaarheid van de cel in onze handen(figuur 4e). Dit is in lijn met de r...

Recente studies hebben aangetoond aanzienlijke immuuncel, en met name B-cel, fenotypische en functionele heterogeniteit, afhankelijk van cellokalisatie1,2,3,4,5. B-1a cellen zijn een dergelijke populatie met heterogene capaciteit om beschermende IgM-antilichamen te produceren; beenmerg B-1a cellen scheiden IgM constitutief en dragen aanzienlijk bij aan plasma IgM titers6, terwijl peritoneale B-1a cellen hebben low-level IgM secretie op homeostase en in plaats daarvan kan worden geactiveerd door aangeboren tol-achtige receptor (TLR) of cytokine-gemedieerde signalering om snel te vermenigvuldigen, migreren en scheiden IgM7,8,9,10. B-1a-cel IgM-antilichamen herkennen oxidatiespecifieke epitopen (OSE) die aanwezig zijn op pathogenen, apoptotische cellen en geoxideerde LDL, en IgM-binding aan OSE kunnen ontstekings downstream signalering voorkomen bij ziekten zoals atherosclerose11. Daarom kunnen strategieën om de IgM-productie te verhogen via het verhogen van peritoneale B-1a-celmigratie naar sites zoals het beenmerg therapeutisch nuttig zijn. Het is echter belangrijk dat dergelijke strategieën worden gericht en cel-type specifiek, als off-target effecten kunnen een negatieve invloed hebben op de immuunfunctie of gezondheid.
Hier beschrijven we een methode voor gerichte en langdurige overexpressie van CXCR4 in primaire murine B-1a cellen en de daaropvolgende adoptieoverdracht om celmigratie en functionele IgM-antilichaamproductie te visualiseren(figuur 1). Genetische manipulatie van primaire B-cellen wordt beperkt door lage transfectie-efficiëntie in vergelijking met transfectie van getransformeerde cellijnen. Aangezien getransformeerde cellijnen echter aanzienlijk kunnen afwijken van primaire cellen12,13,biedt het gebruik van primaire cellen waarschijnlijk resultaten die beter aansluiten op de normale fysiologie. Er zijn verschillende technieken beschreven voor genoverdracht in primaire murine B-cellen, waaronder retrovirale transductie, adenovirale transductie, lipofection of transporatiegebaseerde transfectie, die verschillende niveaus van efficiëntie, vergankelijkheid en impact hebben op de gezondheid van cellen13,14,15. De volgende methode gebruikt retrovirale transductie als het leverde voldoende genoverdracht efficiëntie van >30% terwijl een minimale invloed op de levensvatbaarheid van cellen. Het CXCR4-uitdrukkende retrovirus werd gegenereerd met behulp van de eerder beschreven retrovirale constructie murine stamcelvirus-interne ribosomale entry site-groene fluorescente eiwit (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, waarin de muis CXCR4 gen was sub-gekloond4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes werden gegenereerd met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen4,14.
Succesvol getransduceerde B-1a cellen werden vervolgens intraveneus overgebracht naar lymfocyten-deficiënte Rag1-/- muizen. Zowel donor- als ontvangermuizen bevatten bovendien knock-out van het apolipoprotein E (ApoE)-gen, wat resulteert in een verhoogde OSE-accumulatie en atherosclerose, waardoor een model wordt voor in vivo B-1 celactivering en IgM-productie. Bovendien verschilden donor- en ontvangermuizen in CD45-allotype; donor B-1 cellen kwamen van CD45.1+ ApoE-/- muizen en werden overgebracht naar Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- ontvangers. Dit toegestaan differentiatie van donor CD45.1 van ontvanger CD45.2 B cellen post-overdracht zonder de noodzaak om bovendien vlek voor B-cel markers tijdens flow cytometrie analyse. De hier verstrekte resultaten tonen aan dat gerichte CXCR4 overexpressie op B-1a cellen associeert met een verhoogd vermogen van B-1a cellen om te migreren naar het beenmerg, die associeert met verhoogde plasma anti-OSE IgM. Daarnaast bieden we een methode voor de verrijking van buikvlies B-1 cellen door negatieve selectie en tonen we de eis van B-1 celactivering voor efficiënte transductie. Deze methode kan worden aangepast voor andere retrovirale constructies om het effect van eiwitoverexpressie op B-1a-celmigratie, fenotype of functie te bestuderen. Bovendien zou het gebruik van CD45.1 versus CD45.2 allotype onderscheid theoretisch overdracht naar andere immuun-voldoende murinemodellen met endogene B-cellen mogelijk kunnen maken.

<table><tbody><tr><td>70 micron filter caps</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>anti-biotin microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td><td>Life Technologies</td><td>MFCR00</td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0452-83</td><td>Clone: RA3-6B2</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APCef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0193-82</td><td>Clone: eBio1D3</td></tr><tr><td>CD23 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0232-81</td><td>Clone: B3B4</td></tr><tr><td>CD23 PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0232-82</td><td>Clone: B3B4</td></tr><tr><td>CD3e biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0033-85</td><td>Clone: eBio500A2</td></tr><tr><td>CD45.1 ApoE-/- muizen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in huis</td></tr><tr><td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560580</td><td>Clone: A20</td></tr><tr><td>CD45.2 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562895</td><td>Clone: 104</td></tr><tr><td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- muizen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in huis</td></tr><tr><td>CD5 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0051-83</td><td>Clone: 53-7.3</td></tr><tr><td>Ctl-GFP retrovirus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in huis met behulp van GFP-expresserend retroviraal plasmid MigR1 verstrekt door Dr. T.P. Bender</td></tr><tr><td>CXCR4 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td>Clone: 2B11</td></tr><tr><td>CXCR4-GFP retrovirus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gekweekt in huis door kloning van muis CXCR4 in MigR1 retroviraal plasmid</td></tr><tr><td>F4/80 biotin</td><td>Life Technologies</td><td>MF48015</td><td>Clone: BM8</td></tr><tr><td>Flowjo Software v. 9.9.6</td><td>Treestar Inc.</td><td>Licentie vereist</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>heat-inactivated foetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IgM PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562565</td><td>Clone: R6-60.2</td></tr><tr><td>Insulien spuiten</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Yellow</td><td>Life Technologies</td><td>L34968</td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553163</td><td>Clone: PK136</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1668</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-1668</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-82</td><td>Clone: Ter119</td></tr></tbody></table>

retrovirale overexpressie van cxcr4 op murine b-1a cellen en adoptieve overdracht voor gerichte b-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Aangezien de celfunctie wordt beïnvloed door nichespecifieke factoren in de cellulaire micro-omgeving, kunnen methoden om cellokalisatie en migratie te ontleden, verder inzicht geven in de celfunctie. B-1a cellen zijn een unieke B-cel subset in muizen die beschermende natuurlijke IgM antilichamen produceren tegen oxidatie-specifieke epitopen die ontstaan tijdens de gezondheid en ziekte. B-1a cel IgM productie verschilt afhankelijk van B-1a cel locatie, en daarom wordt het nuttig vanuit een therapeutisch oogpunt te richten B-1a lokalisatie niches ondersteunen van hoge antilichaam productie. Hier beschrijven we een methode om B-1a celmigratie naar het beenmerg te richten door retrovirale gemedieerde overexpressie van het C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninductie in primaire murine B-cellen kan uitdagend zijn en levert meestal lage transfectie-efficiëntie van 10-20% op, afhankelijk van de techniek. Hier tonen we aan dat retrovirale transductie van primaire murine B-1a cellen resulteert in 30-40% transductie-efficiëntie. Deze methode maakt gebruik van adoptieceloverdracht van getransduceerde B-1a cellen in B-cel-deficiënte ontvangende muizen, zodat donor B-1a celmigratie en lokalisatie kan worden gevisualiseerd. Dit protocol kan worden gewijzigd voor andere retrovirale constructies en kan worden gebruikt in diverse functionele tests post-adoptieve overdracht, met inbegrip van analyse van donorcel of gastheer cel fenotype en functie, of analyse van oplosbare factoren afgescheiden post B-1a cel overdracht. Het gebruik van verschillende donor- en ontvangermuizen, onderscheiden door CD45.1 en CD45.2-allotype en de aanwezigheid van een GFP-verslaggever binnen het retrovirale plasmide, zou ook de detectie van donorcellen in andere, immuun-toereikende muismodellen met endogene B-celpopulaties mogelijk kunnen maken.

Een overzicht van het protocol is te vinden in figuur 1. Figuur 2 toont verrijking van buikvlies B-1a cellen na magnetische uitputting van andere peritoneale celtypen. Levende singlet cellen in de post-uitputting fractie hebben een groter percentage van CD19 + B cellen in vergelijking met F4/80+ macrofagen, gebrek aan CD5hi CD19- T cellen, en bevatten een verhoogde frequentie van CD19+ CD5mid B-1a cellen in ...

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Dit protocol kan evalueren hoe gerichte genlevering b-1a-cellokalisatie en -functie beïnvloedt en kan een nuttige proof of concept-benadering zijn voor het onderzoeken van gentherapeutische potentialen in vivo. Deze methode biedt een stabiele en relatief efficiënte genlevering aan primaire B-1a-cellen en maakt de identificatie van donorcelfenotype en functie na adoptieve overdracht mogelijk. Deze methode kan worden gebruikt om diverse donor- en gastheercelprocessen in vivo te onderzoeken, waaronder celoverleving, proliferatie en functie, en kan worden toegepast op andere adoptiesystemen.Peritoneale vloeistof oogsten kan lastig zijn. Zorg ervoor dat u de cellen grondig losmaakt om het herstel te maximaliseren en om te voorkomen dat de darmen worden doorboren die uw buikcelpopulatie kunnen besmetten. Voor peritoneale B-1 cel collectie, gebruik rechte chirurgische schaar om een oppervlakkige snede in de buik van een 12 tot 14 weken oud, man, CD45.1 + apolipoprotein E knock-out muis te maken, en gebruik gebogen schaar terug te pellen van de huid om de peritoneale muur bloot te stellen.Met behulp van een 10 milliliter spuit uitgerust met een 25-meter naald, spoel de buikvliesholte met 1

retroviral-overexpression-cxcr4-on-murine-b-1a-cells-adoptive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

We beschrijven een protocol om de radiale mobiliteit van niet-aderente immuuncellen in vitro te monitoren met behulp van een celsedimentatie manifold/slide apparaat. Celmigratie wordt gevolgd op monolagen van tumorcellen of op extracellulaire matrix-eiwitten. Onderzoek door licht- en fluorescentiemicroscopie maakt observatie van celmobiliteit en cytotoxische functionaliteit mogelijk.

Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

Leer retrovirale overexpressie van CXCR4 op murine B-1a cellen en adoptieve overdracht om celmigratie naar het beenmerg en IgM-productie te bestuderen. Deze methode biedt stabiele gendelivery voor immunologisch onderzoek.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie (Video) | JoVE Journal

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Meer video's verkennen