Name: Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer een HDX-MS workflow voor het bestuderen van conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetasen. Deze methode identificeert functioneel belangrijke eiwitregio's zonder labelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, het Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, de Canadian Foundation for Innovation en mcgill university start-up fondsen.

<ol><li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li>
<li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamism+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522(1993).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS%2C+CXMS%2C+and+disulfide+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+performing%2C+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+%28HDX-MS%29+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883(2015).</li>
<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
<li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li>
<li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li>
<li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li>
<li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li>
<li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li>
<li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).</li>
<li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).</li>
<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

We hebben niets bekend te maken.

De IN dit protocol gepresenteerde HDX-MS workflow biedt een opmerkelijk robuust platform voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van structureel dynamische elementen in eiwitten en voor het onderzoeken hoe deze dynamiek verandert als reactie op verstoring (ligandbinding, enzym mutagenese, etc.). HDX-MS heeft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere structurele biologiebenaderingen die vaak worden gebruikt om conformatiedynamiek te onderzoeken. Het meest in het bijzonder zijn slechts klein...

Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden1. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, het afschermen van reactieve tussenproducten van de omgeving, of door het moduleren van de enzymfunctie via allosterische netwerken. Recente studies hebben ook aangetoond dat conformationele dynamica gedurende de gehele evolutie kan worden behouden en dat verstoringen van geconserveerde moleculaire bewegingen kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in substraatspecifiekheid en de opkomst van nieuwe enzymfuncties2,3.
In de afgelopen jaren is waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) snel naar voren gekomen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe eiwitconforme landschappen reageren op verstoringen zoals ligandbinding of mutagenese4,5,6,7. In een typisch HDX-MS-experiment(figuur 1)wordt een interessant eiwit in een buffer geplaatst die is bereid in D2O, waardoor protonen die oplosmiddelen kunnen worden uitgewisseld, worden vervangen door deuteria. De wisselkoers van de amidemoiety van de peptidebindingen hangt sterk af van de pH, de lokale aminozuursequentie en van de lokale structurele omgeving van de amide8. Amiden die zich bezighouden met waterstofbindingsinteracties (zoals die aanwezig zijn in α-helices en β-sheets) wisselen langzamer uit dan amides in ongestructureerde gebieden van het eiwit die worden blootgesteld aan bulkoplosmiddel. De omvang van de deuteriumopname is dus een weerspiegeling van de structuur van het enzym. Enzymen die conformationeel dynamisch zijn, of die structurele overgangen ondergaan bij ligandbinding, zouden naar verwachting een meetbare HDX-respons opleveren.
De mechanistische basis voor de trage wisselkoers van een gestructureerdeamide is weergegeven in figuur 25,8,9. Om HDX te ondergaan, moet het gestructureerde gebied eerst een uitgevouwen conformatie tijdelijk bemonsteren, zodat de oplosmiddelmoleculen die hdx-uitwisseling katalyseren via een specifiek zuur/base chemisch mechanisme, toegang hebben tot het verwisselbareamide. Uiteindelijk bepalen de relatieve omvang van de chemische wisselkoers (kchem) en de vouw - en vouwkoersen (kopen en ksluiten) de HDX-koers gemeten in het experiment5,8. Vanuit dit eenvoudige kinetische model is het duidelijk dat de mate van deuteriumopname de onderliggende conformationele dynamiek weerspiegelt (zoals gedefinieerd door kopen en kclose). De meeste HDX-MS-experimenten worden uitgevoerd in een bottom-up workflow waarbij, na de uitwisselingsreactie, het eiwit van belang wordt verteerd in peptiden en de deuteriumopname door elk peptide wordt gemeten als een toename van massa7. Op deze manier maakt HDX-MS het mogelijk om verstoringen van enzymconformatiedynamiek in kaart te brengen op de lokale ruimtelijke schaal van peptiden, waardoor de onderzoeker kan beoordelen hoe de verstoring de dynamiek in verschillende regio's van het enzym van belang verandert.
De voordelen van de HDX-MS-aanpak voor het ophelderen van de structurele dynamiek van eiwitten zijn talrijk. Ten eerste kan de methode worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden inheems eiwit of op eiwitcomplexen in systemen met quaternaire structuur10. Het is zelfs niet nodig dat het enzympreparaat dat in de test wordt gebruikt, sterk wordt gezuiverd11,12, zolang de bottom-up HDX-MS-workflow een voldoende aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden biedt die de eiwitsequentie van belang dekken. Bovendien kan HDX-MS informatie verstrekken over conformatiedynamiek onder bijna inheemse omstandigheden zonder dat locatiespecifieke eiwitetikettering nodig is, zoals zou worden gebruikt in fluorescentiestudies met één molecuul13, en er is geen groottelimiet voor het eiwit - of eiwitcomplex dat kan worden onderzocht (waardoor benaderingen zoals nucleaire magnetische resonantie [NMR] spectroscopie uitdagend zijn)7,14. Ten slotte kunnen tijd-opgeloste HDX-MS-methoden worden gebruikt om intrinsiek verstoorde eiwitten te bestuderen, die moeilijk te bestuderen zijn met röntgenkristallografie15,16,17,18. De belangrijkste beperking van HDX-MS is dat de gegevens een lage structurele resolutie hebben. HDX-MS-gegevens zijn nuttig om aan te geven waar de conformatiedynamiek verandert en om gekoppelde conformationele veranderingen te onthullen, maar ze geven vaak niet veel inzicht in het precieze moleculaire mechanisme dat de waargenomen verandering aanstuurt. Recente vooruitgang in de combinatie van elektronenafvangdissociatiemethoden met eiwit HDX-MS-gegevens heeft veelbelovend aangetoond voor het in kaart brengen van uitwisselingslocaties naar enkelvoudige aminozuurresiduen19, maar follow-up biochemische en structurele studies zijn nog steeds vaak nodig om duidelijkheid te verschaffen aan structurele modellen die worden doorgestuurd door HDX-MS-gegevens.
Hieronder wordt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van een HDX-MS-test gepresenteerd20. De onderstaande monstervoorbereidingsprotocollen moeten algemeen toepasbaar zijn op elk eiwit dat een goede oplosbaarheid vertoont in waterige buffers. Er zijn meer gespecialiseerde monsterbereidingsmethoden en HDX-MS-workflows beschikbaar voor eiwitten dan in aanwezigheid van detergentia of fosfolipiden21,22,23,24. Instrumentele instellingen voor HDX-MS-gegevensverzameling worden beschreven voor een quadrupole-tijd-of-flight massaspectrometer met hoge resolutie gekoppeld aan een vloeistofchromatografiesysteem. Gegevens over vergelijkbare complexiteit en resolutie kunnen worden verzameld op een van een aantal in de handel verkrijgbare lc-ms-systemen (liquid chromatography-mass spectrometry). Belangrijke aspecten van de gegevensverwerking met behulp van een commercieel beschikbaar softwarepakket worden ook verstrekt. We presenteren ook richtlijnen voor het verzamelen en analyseren van gegevens die in overeenstemming zijn met aanbevelingen van de bredere HDX-MS-gemeenschap12. Het beschreven protocol wordt gebruikt om de dynamische structurele eigenschappen van HalM2 te bestuderen, een lanthipeptide synthetase dat de multistep rijping van een antimicrobieel peptide natuurlijk product katalyseert20. We illustreren hoe HDX-MS kan worden gebruikt om substraatbindingssites en allosterische eigenschappen te onthullen die eerdere karakterisering hebben ontweken. Verschillende andere protocollen inzake eiwit HDX-MS zijn de afgelopen jaren gepubliceerd25,26. Samen met het huidige werk moeten deze eerdere bijdragen de lezer enige flexibiliteit bieden in experimenteel ontwerp.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugale filtratie-inrichting (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>mierenzuur</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidine-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>kaliumfosfaat</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Hydrochloride</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>peptide werd op verzoek gesynthetiseerd</td></tr><tr><td>Naam van materiaal/apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>versie 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>versie 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>versie 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>versie 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml;dinger</td><td>versie 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Naam van materiaal/apparatuur</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>Instrument en apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytische kolom</td><td>Waters</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-kolom</td><td>Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX-systeem</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microtip pH-elektrode</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH-kolom of Pepsin-solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G2-Si</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform voor het onderzoeken van peptide biosynthetische enzymen

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) is een krachtige methode voor de biofysische karakterisering van enzym conformationele veranderingen en enzym-substraat interacties. Een van de vele voordelen, HDX-MS verbruikt slechts kleine hoeveelheden materiaal, kan worden uitgevoerd onder bijna inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van enzym / substraat etikettering, en kan ruimtelijk opgeloste informatie over enzym conformationele dynamiek - zelfs voor grote enzymen en multiproteïne complexen. De methode wordt geïnitieerd door de verdunning van het enzym van belang in de in D2O bereide buffer. Dit activeert de uitwisseling van protium in peptide bond amides (N-H) met deuterium (N-D). Op de gewenste uitwisselingstijdpunten worden reactie aliquots gedoofd, wordt het enzym geprotelyseerd tot peptiden, worden de peptiden gescheiden door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) en wordt de verandering in massa van elk peptide (als gevolg van de uitwisseling van waterstof voor deuterium) geregistreerd door MS. De hoeveelheid deuteriumopname door elk peptide is sterk afhankelijk van de lokale waterstofbindingsomgeving van dat peptide. Peptiden aanwezig in zeer dynamische gebieden van het enzym uitwisseling deuterium zeer snel, terwijl peptiden afgeleid van goed geordende regio's ondergaan uitwisseling veel langzamer. Op deze manier rapporteert de HDX-rate over lokale enzymconformatiedynamiek. Verstoringen van de deuteriumopnameniveaus in aanwezigheid van verschillende liganden kunnen vervolgens worden gebruikt om ligandbindende locaties in kaart te brengen, allosterische netwerken te identificeren en de rol van conformationele dynamiek in de enzymfunctie te begrijpen. Hier illustreren we hoe we HDX-MS hebben gebruikt om de biosynthese van een type peptide natuurlijke producten genaamd lanthipeptiden beter te begrijpen. Lanthipeptiden zijn genetisch gecodeerde peptiden die post-translationeel worden gewijzigd door grote, multifunctionele, conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele structurele biologiebenaderingen. HDX-MS biedt een ideaal en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van de mechanistische eigenschappen van dit soort enzymen.

Het is noodzakelijk om de kwaliteit van de proteolytische spijsvertering en de reproduceerbaarheid van de workflow voor elke set monsterinjecties te beoordelen. Dus, voorafgaand aan het uitvoeren van HDX-MS-assays, is het essentieel om effectieve voorwaarden vast te stellen voor de proteolyse van het eiwit van belang, voor de scheiding van peptiden met behulp van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en gasfase ionenmobiliteit, en voor de detectie van peptiden met behulp van MS. Hiertoe moeten eerst de referentiemonste...

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Dit protocol kan speciaal opgeloste informatie verstrekken over dynamische eiwitconformatie. Dat kan helpen om functioneel belangrijke gebieden in het eiwit van belang te identificeren. Deze techniek onderzoekt dynamische eiwitconformatie onder bijna-natuurlijke omstandigheden.Zonder de noodzaak voor eiwitlabeling met nanomolare hoeveelheden materiaal voor elke reactie. Begin met het voorbereiden van niet-gedeuteriseerde referentiemonsters voor het eiwit van belang in drievoudige exemplaren, in buisjes van 500 microliter. Kwets de monsters met het juiste volume dempingsbuffer per buisje om een pH-meter lezing van 2,5 te bereiken.Vries de monsters snel in vloeibare stikstof in voor opslag bij min 80 graden Celsius tot hun analyse. Analyseer vervolgens de geprotoneerde enzymreferentiemonsters met behulp van een bottom-up vloeistofchromatografie massaspectrometrie werkstroom volgens standaardprotocollen. Om de ruwe massaspectrometrie gegevens in het juiste Proteomics Software Programma te analyseren.Navigeer naar Bibliotheken en Eiwitsequentie Databanken om de aminozuursequentie van het eiwit van belang te importeren. Voer een naam in voor de eiwitsequentie van belang en importeer de eiwitsequentie in FASTA-formaat. Om de verwerkingsparameters te definiëren onder het Bibliotheek menu, selecteer Electrospray MSE als het type gegevensverwerving.In het Lock Mass voor Lading 2 veld, voer 785.8426 in voor de master ladingsverhouding voor de twee plus ion van glucaan één vezel geen peptide B en klik op Voltooien. Om de werkstroomparameters te definiëren, selecteer Electrospray MSE voor het zoektype. Onder de kop Werkstroom en Database zoekopdracht, selecteer het database-eiwit dat in het Databank veld is gemaakt en verander de primaire verteringsreagens in non-specifiek.Om het veld voor het vaste modificatie reagens te wissen, houd de controle knop ingedrukt terwijl je op Carbamidomethyl C klikt. Om de uitvoermap te specificeren, selecteer Opties, Automatiseringsinstellingen en Identificeer E. Controleer vervolgens de apex 3D en peptide 3D uitvoer en ion accounting uitvoer vakjes. En specificeer de gewenste map. Om de verwijzende steekproefgegevens te verwerken, klik je met de rechtermuisknop op de microplaat om een nieuwe plaat te maken.Klik links in één putje en sleep naar drie andere putjes om één putje voor elke verwijzende steekproef te markeren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Rauwe Gegevens Toevoegen. In het venster, navigeer naar de map met de drie verwijzende bestanden en selecteer alle drie de bestanden tegelijkertijd.Klik op Volgende en selecteer de gedefinieerde verwerkingsparameters. Klik opnieuw op Volgende en selecteer de gedefinieerde werkstroomparameters. Klik vervolgens op Voltooien.Zodra de ruwe gegevens, verwerkingsparameters en werkstroomparameters aan elke put op de plaat zijn toegewezen, zullen de putten blauw worden. Selecteer de putten, klik met de rechtermuisknop en selecteer Laatste Rauwe Gegevens Verwerken. Om de verwerking van de gegevens bij te houden, klik je op de rechteronderhoek van het venster.Wanneer er geen taak om uit te voeren verschijnt, is de verwerking voltooid en zullen de putten in de microplaat groen worden. Klik met de rechtermuisknop op de putten en selecteer Workflow Resultaten Bekijken. Voor elk verwijzend gegevensbestand zal een apart venster worden geopend.Controleer de gegevens om er zeker van te zijn dat de meeste massaspectrometrie signalen in de verwijzende steekproefgegevens succesvol zijn toegewezen aan de peptiden die zijn voorspeld uit de in silico vertering van het eiwit van belang. Overeenkomende peptiden zullen blauw verschijnen in het uitvoergesprek. Dubbelklik op de oké-filter en controleer of het percentage dekking groter is dan 99% Importeer de Proteomics Software uitvoer in de Hydrogen Deuterium Exchange Processing Software voor aanvullende drempelwaarden.En klik op Gegevens en importeer PLGS-resultaten. Klik op de Toevoegen icoon en navigeer naar de juiste map om de verwerkte gegevensbestanden te selecteren. Klik op Volgende en stel de minimale opeenvolgende ionen in op groter dan of gelijk aan twee.De massa fout tot vijf delen per miljoen. En de bestandsdrempel tot drie, klik vervolgens op Voltooien. Om waterstof-deuterium uitwisselingsreacties uit te voeren, doseer dempingsbuffer in buisjes van 500 microliter.En centrifugeer kort om alle dempingsbuffer naar de bodem van elke buis te brengen. Plaats de buisjes met de gekwelde oplossing op ijs. Meng vervolgens alle gedeuteriseerde reactiecomponenten in een aparte buis van 1,5 milliliter.Breng vervolgens het reactiemengsel over naar een waterbad met temperatuurregeling van 25 graden Celsius voor een incubatie van 10 minuten. Voeg enzym toe aan de gedeuteriseerde reactiecomponenten om de uitwisselingsreactie te starten. Meng de reactie inhoud grondig door omhoog en omlaag te pipetten.Verwijder op de juiste experimentele uitwisselingstijdstippen 50 microliter aliquots uit elke waterstof-deuterium uitwisselingsreactie. En meng de reacties snel en gelijkmatig met één aliquot ijskoud dempingsbuffer in individuele buisjes van 500 microliter. Dek vervolgens de buisjes onmiddellijk af voor snel invriezen in vloeibare stikstof.Bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor analyse. Na het ontdooien van de bevroren monsters, analyseer de gedeuteriseerde enzymreferentiemonsters met behulp van dezelfde bottom-up vloeistofchromatografie massaspectrometrie werkstroom die is ontwikkeld voor de niet-gedeuteriseerde referentiemonsters. Na het verzamelen van de LCMS gegevens voor de gedeuteriseerde monsters, importeer de gegevens in het eerder gemaakte waterstof-deuterium uitwisselingsproject voor gegevensverwerking.En klik op Nieuwe Staat en Nieuwe Blootstelling om de biochemische toestanden en deuteriumblootstellingstijden respectievelijk relevant voor de analyse te definiëren. Klik op Nieuw Rauw om de waterstof-deuterium uitwisselingsgegevensbestanden te selecteren die worden geanalyseerd. En wijs de juiste uitwisselingstijden en biochemische toestand toe aan elk rauwe gegevensbestand dat wordt geïmporteerd.Voor analyse en visualisatie van de gegevens, selecteer

a-hydrogen-deuterium-exchange-mass-spectrometry-hdx-ms-platform-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

MALDI-TOF massaspectrometrie werd met succes gebruikt om de amide waterstof / deuterium uitwisseling in proteïne kinase Pak2 activatie te controleren.

Amide waterstof / deuterium Exchange en MALDI-TOF-massaspectrometrie Analyse van de Pak2 Activering

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Leer een HDX-MS workflow voor het bestuderen van conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetasen. Deze methode identificeert functioneel belangrijke eiwitregio's zonder labelen.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Meer video's verkennen