Opstelling van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS) voor kwantificering van ijzerrederoxsoorten (Fe(II), Fe(III))
4 mei 2020
Deze ijzerrorox speciatie methode is gebaseerd op capillaire elektroforese-inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie met monster stapelen in combinatie met korte analyse in een run. De methode analyseert en biedt snel lage limieten van kwantificering voor ijzerredoxsoorten in een breed scala van weefsels en biofluïde monsters.
Overmatig ijzer resulteert in gratis redox-actieve ijzer twee-plus die verwoestende effecten in de cel kan veroorzaken, zoals oxidatieve stress en celsterfgevallen door lipideperoxidatie bekend als ferroptose. Kwantitatieve metingen van ijzer en ijzer zijn de sleutel tot een beter inzicht in deze schadelijke processen. Deze CE-ICP-Ms-techniek biedt zowel:snelle analyse als lage kwantificeringslimieten, die beide nodig zijn voor het kwantificeren van ijzer-redoxsoorten.
Begin met het selecteren van een vernevelaar met een laag zelfpiratievolume en het voorbereiden van de juiste onderdelen om de zelfgemaakte interface te monteren. Sluit twee drie-weg vrouwelijke luer connectors met een mannelijke kegel luer connector door het aansluiten van de linkerkant van de onderste drie-weg luer bar aan de mannelijke connector en de mannelijke connector aan de middelste verbinding van de bovenste drie-weg luer. Plaats vervolgens een buis van één centimeter over de platinadraad en gebruik een siliconen buis van één centimeter om de eerste buis en het mondstuk van een mannelijke luerconnector aan te sluiten.
Bevestig de montage op de middelste verbinding van de onderste drieweg-luerconnector door schroefrotatie. Duw een buis van één centimeter over de uitlaat van de CE-capillaire en plaats op acht tot negen centimeter van het einde en sluit deze vervolgens aan op het mondstuk van de mannelijke luerconnector met een siliconen buis. Zet de hele montage door de bar van de bovenste drie-weg T-connector en bevestig de mannelijke luer connector en het linkerkant van de vrouwelijke drie-weg luer connector door schroef rotatie.
Bevestig vervolgens de siliconen buis van 25 centimeter aan het mondstuk van een mannelijke luerconnector en bevestig de hele montage aan de onderkant van de bar van de onderste drieweg lure connector. Duw de siliconen buis van één centimeter stevig, vijf millimeter over het einde van de vernevelaar. Terwijl de tweede mannelijke luer kegel connector is aangesloten op het uitstekende deel van de buis.
Verplaats het interfacedeel met de uitstekende CE-capillaire naar de mannelijke kegel bij de vernevelaar en steek het capillaire voorzichtig door de mannelijke kegel en het bredere deel van de vernevelmdot. Pas indien nodig de lengte van het uitstekende capillair aan door de linker mannelijke luer los te schroeven, de luer met bijgevoegde buizen in de gewenste positie te bewegen en opnieuw te installeren. De bovenste vrouwelijke drie-weg luer connectoren moeten strak passen op de mannelijke kegel.
Wanneer klaar met de setup gaan met ICP-Ms. Kalibratiecurven werden gemaakt voor ijzer drie en ijzer twee redox soorten. De detectiegrenzen waren 3,1 microgram per liter voor ijzer twee en 3,2 microgram per liter voor ijzer drie en lineariteit werd aangetoond tot 150 microgram per liter.
De analyse van de SH-SY5Y Cell Lysate toonde een iets tragere migratie voor ijzerredoxsoorten als gevolg van de iets hogere geleidbaarheid. De gemeten concentraties van ijzer drie en ijzer twee waren respectievelijk 330 microgram per liter en 84 microgram per liter. Resulterend in een ijzeren twee tot drie verhouding van 0,25.
De belangrijkste stap van dit protocol is het zorgvuldig inbrengen van de uitstekende CE-capillaire door de gemonteerde interface en de geschikte positionering met betrekking tot de vernevelaarcapillaire. De hier gepresenteerde methoden kunnen een veelbelovend instrument worden om het inzicht in ijzerafhankelijke moleculaire processen te verdiepen. Zorgvuldig ontworpen studies zijn nodig om te valideren of ijzer twee-plus, ijzer drie-plus kwantificering kan dienen als een potentiële biomarker om weefsel te lokaliseren in gevaar voor ijzer-gemedieerde dodelijke schade in de context van neurodegeneratieve en kankerziekten.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor ijzer-redoxspeciatie met behulp van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS). Deze techniek maakt een snelle analyse en lage kwantificeringsgrenzen mogelijk voor ijzer-redoxsoorten in diverse weefsels en biofluïda.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biochemie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Overmatig ijzer kan leiden tot oxidatieve stress en celdood.
- Kwantitatieve meting van ferro- en ferri-ijzer is cruciaal voor het begrijpen van deze processen.
- Ferroptose is een vorm van celdood die gerelateerd is aan ijzeroverbelasting.
- Bestaande methoden bieden mogelijk niet de benodigde snelheid en gevoeligheid voor ijzerkwantificatie.
Doel van de studie
- Om een snelle en gevoelige methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van ijzer-redoxsoorten.
- Om de implicaties van ijzerkwantificering bij neurodegeneratieve ziekten en kanker te onderzoeken.
- Om het potentieel van ijzerkwantificering als biomarker voor weefselschade te valideren.
Gebruikte methoden
- Capillaire elektroforese-inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (CE-ICP-MS).
- Monsterpreparatie met gebruik van een zelfgeconstrueerde interface-assemblage.
- Kalibratiecurves voor ijzer(II)- en ijzer(III)-redoxsoorten.
- Analyse van SH-SY5Y cellysaat voor de meting van de ijzerconcentratie.
Belangrijkste resultaten
- De detectielimieten waren 3,1 µg/L voor ijzer(II) en 3,2 µg/L voor ijzer(III).
- Een lineaire respons werd waargenomen tot 150 µg/L.
- De gemeten concentraties waren 330 µg/L voor ijzer(III) en 84 µg/L voor ijzer(II).
- De verhouding tussen ijzer(II) en ijzer(III) bleek 0,25 te zijn.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is veelbelovend voor het bestuderen van ijzerafhankelijke moleculaire processen.
- Een zorgvuldige opstelling is cruciaal voor nauwkeurige metingen.
- Verdere studies zijn nodig om de rol van ijzerkwantificatie in ziektecontexten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige kwantificering van ijzer-redoxsoorten (Fe(II)/Fe(III)) is cruciaal voor het begrijpen van ijzer-gemedieerde cellulaire schade in neurodegeneratieve en oncologische contexten. De CE-ICP-MS-methode maakt snelle, gevoelige detectie van deze soorten in complexe biologische matrices mogelijk, wat bijdraagt aan een vroege mechanistische risicoanalyse van therapeutische hypothesen waarbij oxidatieve stress en ferroptose-paden betrokken zijn. Deze mogelijkheid verbetert de targetvalidatie door kwantitatieve, redox-specifieke biomarkers te leveren voor portfoliotriage in programma's in de ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de ijzer-redoxhomeostase te onderzoeken als therapeutische hypothese in ziektemodellen.
- Operationele waarde: Biedt redox-specifieke kwantitatieve read-outs om de mechanistische pathways van ijzer-geïnduceerde celdood te verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de betrouwbaarheid van biomarker-gestuurde targets door Fe(II)/Fe(III)-ratio's te correleren met oxidatieve stress en ferroptose-uitkomsten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert lage detectielimieten (3,1–3,2 µg/L) en een lineaire respons tot 150 µg/L, waardoor betrouwbare kwantificering in verdunde lysaten en biovloeistoffen mogelijk is.
- Reproduceerbaarheid: Toont een precisie van de migratietijd <3% en een meetprecisie van 2,2–3,5%, wat zorgt voor consistente resultaten bij het screenen van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Conductivity-pH-stacking maakt hogere injectievolumes mogelijk zonder de scheiding in gevaar te brengen, wat de doorvoer voor assayvalidatie verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt meting van ijzer-redoxsoorten in SH-SY5Y lysaten en liquor possible, waardoor ontdekkingen worden gekoppeld aan ziekterelevante systemen.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: De nauwkeurigheid van het herstel (97–105%) en bevestiging via standaardtoevoeging ondersteunen betrouwbare biomarkerkwantificering voor go/no-go-criteria.
- Mechanistische risicovermindering: Faciliteert de evaluatie van ijzermodulatiestrategieën door directe read-outs van Fe(II)- en Fe(III)-soorten in preklinische modellen te bieden.
Integratie van pipeline en workflow
De CE-ICP-MS-methode integreert in vroege discovery-workflows door redox-specifieke kwantitatieve gegevens te leveren die informeren naar de stadia van targetvalidatie en leadidentificatie, in het bijzonder voor pathways die betrokken zijn bij ijzerafhankelijke oxidatieve stress.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests voor ijzerdysregulatie in neurodegeneratieve en kankermodellen via speciatie-opgeloste kwantificering.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk met een lage LOQ en hoge precisie, wat een betrouwbare beoordeling van het effect van verbindingen op ijzer-redoxstadia faciliteert.
- Analytics: Genereert kwantitatieve outputs op basis van piekareaal en metrieken voor migratietijd, waardoor vergelijkingen tussen condities en trendanalyses mogelijk worden.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie via meetbare ijzersoorten in cellulaire lysaten en biovloeistoffen, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Platform-agnostische detectie via ICP-MS maakt hergebruik mogelijk voor meerdere elementaire doelen buiten ijzer, waardoor het nut op lange termijn toeneemt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door onderscheid te maken tussen de bijdragen van Fe(II) en Fe(III) aan oxidatieve stress en ferroptose.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door scheiding met stapelingversterking en vermindering van interferentie in DRC-modus.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve redoxbiomarkers te leveren die gekoppeld zijn aan pathologische ijzertoestanden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van hun effect op ijzerspeciatie in ziekterelevante modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de opstelling van capillaire elektroforese en de optimalisatie van ICP-MS, in het bijzonder voor de DRC-modus met NH3 als reactiegas.
- Is afhankelijk van een stabiele interface-assemblage tussen de CE-capillair en de vernevelaar om de signaalintegriteit te behouden en redoxverschuivingen te voorkomen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de achtergrondelektrolyt (20 mM HCl) en spanningsparameters (+25 kV) om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Vereist aanpassing voor monsters met een variabele geleidbaarheid (bijv. CSF) door gebruik van standaardadditie voor de bevestiging van piekidentificatie.
- Praktische beperking: De gevoeligheid van de methode voor matrixeffecten van het monster vereist verdunning of standaardisatie voor een nauwkeurige kwantificering in complexe biofluïda.
