Scheiding van bioactieve kleine moleculen, peptiden uit natuurlijke bronnen en eiwitten uit microben door preparative isoelectric Focus (IEF) Methode

Ons protocol beschrijft de nieuwe bevindingen over de scheiding en zuivering van actieve moleculen uit een plantenextract. Wetenschappers kunnen deze methoden gebruiken om kleine moleculen en peptiden te isoleren van natuurlijke productbronnen voor therapeutische gebruikers. Maak kennis met de instrumentonderdelen en hun montagemethoden.

Het is belangrijk om er zeker van te zijn, dat de te scheiden monster wordt voorbereid door de voorgestelde richtlijnen. Deze methode omvat meerdere assemblageprocessen van het instrument. En de visuele demonstratie zal gebruikers helpen om ze te volgen en met succes toe te passen op het onderzoek.

Na het monteren van de vloeibare fase, IEF-eenheid zoals beschreven in de handleiding, equilibrate de anion uitwisseling membranen met 0.1 molaire natriumhydroxide en de kation uitwisseling membranen met 0.1 molaire fosforzuur. Lijn de rubberen pakkingen zo uit dat de drie grote langwerpige gaten door het rubber gedeblokkeerd blijven. Dit zal helpen bij het uitwisselen van de ionen tussen de elektrode en de monstercompartimenten via het membraan tijdens elektroforese.

Monteer het binnenste en buitenste gedeelte van de elektrode door de drie langwerpige gaten in de ionenuitwisselingspakkingen uit te lijnen. Vul vervolgens de elektroden met hun respectieve elektrolyten om te voorkomen dat hun membranen uitdrogen. Draai vervolgens de kunststof schroefhouder aan om een lekvrije montage te garanderen.

Bedek de monsterafhaalplanken met afdichtingstape. Monteer vervolgens de delen van de scherpstelkamer over de keramische koelvinger in de volgende volgorde: anodelektrode, nylon membraankern, scherpstelkamer en kathodeelektrode. Vul met een spuit van 50 milliliter de scherpstelkamer met voorgekoeld gedestilleerd water.

Voeg voor een standaard IEF-cel 60 milliliter water toe. Sluit de IEF-eenheid aan op circulerend koelwater bij vier graden Celsius. Bedien het apparaat op 15 watt en 3000 volt tot de spanning stabiliseert, ongeveer drie tot vijf minuten.

Schakel vervolgens de stroombron uit. Verwijder met behulp van de fractiecollector het water uit de cel. Sluit de afhaalborden opnieuw af met afdichtingstape.

Voeg 0,6 gram Gymnema sylvestre plantenextract toe, tot 60 milliliter gedestilleerd water. Los het plantenextract op door vijf minuten in een rolbuis te mengen. Om de onoplosbare deeltjes te verwijderen, centrifugeer deze oplossing vijf minuten lang op 10.000 keer G.

Breng de supernatant over op een glazen bekerglas van 150 milliliter en voeg ampholyt toe om een volumeoplossing van 1%, ongeveer 0,6 milliliter, te creëren. Met behulp van een 50 milliliter spuit met een 1,5 inch 19 meter stompe eindnaald, laad deze oplossing in de IEF-cel via de monster verzameling boards. Verwijder vervolgens de cel van de standaard en tik op de elektrodekamer, om eventuele bellen los te maken en te verwijderen.

Sluit het apparaat aan op het koelwater. Met de voeding tot constante 15 Watt beginnen fractionering. Voer de IEF-eenheid uit totdat de spanning een constante waarde bereikt, ongeveer drie uur.

Na het indrukken van de oogst op de knop lijnen de fractiecollector pinnen met de collectie planken. Duw de pinnen door de afdichtingstape om te beginnen met het verzamelen van de Gymnema sylvestre fracties. Kweek een enkele kolonie van C.albicans en gist pepitone dextrose bouillon 's nachts op 30 graden Celsius met schudden.

Breng de cultuur over op een centrifugebuis en verzamel de gistcellen door centrifugatie op 10.000 keer G gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van de supernatant, schort de gistcellen in buffer en draai de suspensie in een rolbuis voor een uur op vijf graden Celsius. Om de gistcellen te verwijderen, centrifugeren de suspensie op 10.000 keer G gedurende vijf minuten.

Vervolgens filter het eiwitextract door een filter van 0,45 micrometer. Breng het eiwitextract over op dialysebuis en dialyseren 15 uur tegen water bij vier graden Celsius. Na het schatten van de eiwitconcentratie, verzamel een volume eiwitextract met 500 milligram totale eiwit.

Verdun de 500 milligram eiwit in 60 milliliter water dat 1%ampholyt volume bevat. Laad met behulp van een spuit het verdunde eiwitextract in de IEF-cel en bedien het apparaat vier uur lang met een constante 15 Watt. Aangezien dit instrument gebruik maakt van hoogspanningselektra toevoer, moet de gebruiker alle voorzorgsmaatregelen nemen om direct contact met de levende elektroden te voorkomen.

De fractieverzamelaar bevat 20 plastic buizen, elk 12 millimeter bij 75 millimeter. En het is aangesloten op de vacuümpomp. Bereid je voor om de fracties te verzamelen door op de oogst op de knop te drukken.

Vervolgens lijnen de 20 collectie pinnen op de fractie collector met de 20 collectie boord, zodat de verzegelde scherpstelcel. Duw de verzamelpennen door de afdichtingstape en zet tegelijkertijd de vacuümpomp aan. Elke buis verzamelt een eiwitfractie van ongeveer drie milliliter.

Na het verminderen en koken van de eiwitfracties, analyseren ze op een 12,5% SDS pagina gel. Bevlek de gel met Coomassie Blue kleurstof en plaats deze op een rocker bij kamertemperatuur. Na twee tot drie uur destain de gel.

Neem vervolgens de gelafbeelding op met behulp van een gelafbeelding. Bereid een gistcel suspensie door het verdunnen van een nachtelijke cultuur van C.albicans op een 1:1000 verhouding in RPMI cel cultuur medium aangevuld met 50 millimolar glucose. Voeg 90 microliter van de cel suspensie toe aan elke put van een 96 putplaat.

Voeg vervolgens 10 microliter van elke G.sylvestre-fractie toe om putten te scheiden. Als een negatieve controle, voeg 10 microliter water met 1%ampholyte in afzonderlijke putten. Na het uitbroeden van de 96 put plaat op 37 graden Celsius gedurende 12 uur, observeer de plaat onder een microscoop.

Het gebrek aan filamenteuze groei duidt op de remming van C.albicans gist-naar-hypha conversie. Twintig fracties G.sylvestre-extract werden verkregen door vloeibare fase IEF. Donkergekleurde moleculen, de gymnemic zuren, migreerden naar en werden verrijkt aan het anode einde van de eenheid.

Doorschijnende lichtgele fracties werden waargenomen aan het uiteinde van de kathode. Aliquots van elke G.sylvestre breking werden verminderd, gekookt en opgelost door SDS pagina. Een Coomassie Blauwe vlek toonde een verschillende polypeptide band op ongeveer vijf kilodaltons, verrijkt in fracties 16 tot en met 19.

De Gymnemic zuren in fractie een, en de volgende paar fracties werden niet gedetecteerd, omdat ze niet eiwithoudend. Deze moleculen kunnen echter worden gescheiden door TLC en gedetecteerd onder UV-licht. Fractie 10 bevatte geen detecteerbare hoeveelheid van deze kleine moleculen die suggereerden dat de meeste organische kleine moleculen werden verrijkt in fracties één tot en met drie.

Alle 20 G.sylvestre fracties werden onderzocht voor remming van gist-naar-hypha conversie en hyphal groei in C.albicans. De grootste remming werd waargenomen in fractie één en weinig tot geen remming werd waargenomen in fracties 10 en hoger. Celoppervlakte-eiwitten van C.albicans werden gefractioneerd met behulp van vloeibare fase IEF.

En aliquots van 18 fracties werden geanalyseerd door SDS pagina. Verrijkte eiwitten waren zichtbaar in verschillende fracties. Het begin, kleine moleculen kon niet worden gescheiden door isoelectrische scherpstellen, omdat ze worden verondersteld niet-ambulante.

Onze studies tonen aan dat ze ambulante, ten minste wekelijks, en deze methode kan verder worden onderzocht voor andere kleine moleculen.