Name: Live-Cell Beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële Predator Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van Time-Lapse Fluorescentie Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe je de levenscyclus van het roofbacterie Bdellovibrio bacteriovorus in levende cellen volgt met tijdverloop-fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van predatie-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Science Centre grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 aan J.Z.C.

1. Bereiding van B. bacteriovorus lysaat voor microscopische analyse
<ol><li>In een kolf van 250 mL zet u de cocultuur op door 1 mL verse 24 uur B. bacteriovoruscultuur (bijv. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) en 3 mL nachtelijke prooicultuur (bijv. E. coli S17-1 pZMR100) met 50 mL Ca-HEPES buffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7.6]) aangevuld met antibiotica indien nodig (hier, 50 μg/mL kanamycine).</li>
	<li>Broed de cocultuur 24 uur bij 30 °C met schudden bij 200 tpm.</li>
	<li>Controleer of de prooicellen volledig zijn gelyseerd door vloeistof gemonteerde fasecontrastmicroscopie. Op dit punt moeten talrijke motile aanvalsfase B. bacteriovoruscellen aanwezig zijn en geen E. coli-cel of bdelloplast zichtbaar moet zijn.</li>
	<li>Filtreer de B. bacteriovoruscultuur door een filter van 0,45 μm poriegrootte om de resterende gastheercellen te verwijderen. Roofcellen (0,3–0,5 μm x 0,5–1,4 μm) dringen vrij door tot 0,45 μm poriën, terwijl gastheercellen op het filteroppervlak worden vastgehouden.</li>
	<li>Draai het filtraat gedurende 20 minuten naar beneden bij 2469 x g en 30°C in een conische buis van 50 mL om roofcellen te verzamelen. Resuspend de B. bacteriovorus pellet in 3 mL ca-HEPES buffer (tot een laatste OD600 van ongeveer 0,2) en incubeer bij 30 °C en 200 rpm gedurende 30 min.</li>
</ol>2. Voorbereiding van gastheercellen voor B. bacteriovorus invasie
<ol><li>Gebruik een enkele kolonie van de gastheer stam(E. coli S17-1 pZMR100 wordt aanbevolen vanwege verschillende celgroottes wat resulteert in de vorming van ongelijke grootte bdelloplasten) om 10 mL YT medium in teen (0,8% Bacto tryptone, 0,5% gistextract, 0,5% NaCl [pH = 7,5]) dat is aangevuld met antibiotica, indien nodig (hier, 50 μg/mL kanamycine). Kweekcellen 's nachts bij 37 °C en 180 rpm.</li>
	<li>Breng 2 mL van 's nachts E. coli cultuur (OD600 van ~ 3.0) naar een 2 mL reageerbuis en centrifuge bij kamertemperatuur (RT) en 2469 x g gedurende 5 min. Resuspend de pellet in 200 μL ca-HEPES buffer.</li>
</ol>3. Opstelling van de microscoop (zie Tabel van Materialen)
<ol><li>Verwarm een microscopische kamer voor ten minste 1 uur voor gebruik voor aan 30 °C. Deze stap is vereist om fouten bij het handhaven van de focus tijdens het experiment te voorkomen.</li>
	<li>Schakel zowel de microscoop- als microscopieautomatisering in. Initialiseer de besturingssoftware en selecteer de juiste filters om brightfield/DIC/phase-contrast- en fluorescentiebeelden te verkrijgen, indien nodig (hier: BF-beelden, GFP/mCherry polychromic filter en emissie/excitatie voor mCherry en GFP).</li>
</ol>4. Verzameling van lay-outs voor time-lapse fluorescentie microscopie
<ol><li>Meng 200 mg lage fluorescerende moleculaire graad agarose met 20 mL Ca-HEPES buffer (1% uiteindelijke agarose concentratie) en los de agarose in een magnetron. De batch kan meerdere keren worden hergebruikt nadat deze is stolt, dus herhaal gewoon de verwarmingsstap.</li>
	<li>Giet 3 mL gesmolten agarose in een 35 mm glazen bodemschotel(Tafel van materialen). Laat de agarose stollen.</li>
	<li>Verwijder met behulp van een microspatel in het laboratorium voorzichtig het agarosepad uit de 35 mm schotel zonder de middenstok van het agarosepad te verstoren. Flip de pad onderkant naar boven en plaats het in een petrischaal deksel(Figuur 2).</li>
	<li>Leg 5 μL geconcentreerde E. coli suspensie bovenop het omgedraaide pad en verspreid cellen in de middenpool met behulp van een inentingslus. Voeg 5 μL geconcentreerde B. bacteriovorussuspensie (OD600 van ~0.2) toe aan het oppervlak met E.coli-gecoate laag. Spreid de cellen niet uit.</li>
	<li>Breng de agarosegel snel terug naar de 35 mm glazen bodemschaal (bovenzijde naar beneden gericht) en dek af met een deksel. Verwijder indien nodig luchtbellen door de agar voorzichtig tegen de plaat te drukken.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de experimentele workflow. De agarose pad wordt verwijderd uit de 35 mm schotel en omgedraaid, zodat de onderkant naar boven kijkt. Verse suspensies van roofzuchtige cellen en 's nachts cultuur van prooicellen worden geplaatst op de omgedraaidpad om de "bodem" kant jas. De agarose pad wordt vervolgens omgedraaid naar zijn oorspronkelijke oriëntatie en terug geplaatst in de 35 mm schotel, die is gemonteerd op de omgekeerde microscoop stadium in de microscoopkamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
5. Geleiding van time-lapse fluorescentiemicroscopie
<ol><li>Plaats de 35 mm schotel in de petrischaalhouder zodanig dat deze niet beweegt tijdens het experiment. Plaats een druppel onderdompelingsolie (1.518 brekingsindex) op het doel en de onderkant van de 35 mm schotel.</li>
	<li>Monteer de houder op het podium van de omgekeerde microscoop in de microscoopkamer.</li>
	<li>Stel de opties in de microscoop controle software om meerdere beelden te verzamelen op meerdere fase posities in de tijd.<ol>
<li>Stel de vergroting (100x) en polychromische lens (GFP/mCherry) in. Met behulp van een oogstuk en brightfield (BF) vindt u het brandpuntsvlak en opent u de puntenlijstbeheerder.</li>
		<li>Selecteer ten minste 10 posities van belang door het podium te verplaatsen en de coördinaten voor elke positie in de microscoopsoftware op te slaan door op de knop Markeringspunt te klikken. Vermijd posities die zich dicht bij elkaar bevinden om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen. Draai de cameraklep van het oculair naar de monitor en kalibreer elk punt door het brandpuntsvlak in te stellen en op de knop Punt vervangen in de puntenlijstmanager te klikken.</li>
		<li>Open de ontwerpontwerper van het experiment en stel alle experimentele parameters in elk tabblad als volgt in:<ol>
<li>Markeert de vak met Z-stapelen.</li>
			<li>Kies fluorescerende kanalen en stel de optimale verlichtingsinstellingen in. Hier werden de volgende instellingen gebruikt: voor het mCherry-kanaal, mCherry-filtersets (EX575/25; EM625/45), 50% intensiteit en 200 ms blootstellingstijd; voor het GFP-kanaal, de GFP-filterset (EX475/28; EM525/48), 50% intensiteit en 80 ms; en voor de BF-beelden, POL-kanaal, 5% intensiteit en 50 ms.</li>
			<li>Selecteer intervallen tussen het verkrijgen van afbeeldingen en de totale tijd van het experiment. Hier werden 5 min intervallen uitgevoerd over de 10 uur periode van het experiment.</li>
			<li>Schakel focusonderhoud in voor de gekozen posities (voor het systeem dat hier wordt gebruikt, door het selectievakje Focus onderhouden met UltimateFocus te markeren).</li>
			<li>Selecteer de gegevensmap waarin de afbeeldingsbestanden automatisch moeten worden opgeslagen.</li>
			<li>Controleer alle instellingen in de microscoopsoftwarebesturing opnieuw en start het time-lapse-experiment.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer na het eerste uur van het experiment of alle podiumposities nog steeds scherp zijn. Pas de focus aan tijdens tijdsintervallen tussen het verwerven van afbeeldingen, indien nodig.</li>
	<li>Wanneer het time-lapse-experiment is voltooid, verwijder je de petrischaal en gebruik je de 35 mm schotel met een agarosepad volgens het bioveiligheidsprotocol. LET OP: Alle substappen na stap 5.2 zijn specifiek voor DeltaVision Elite-gebruikers. Onderzoekers die andere systemen gebruiken, moeten de instellingen aanpassen aan individuele systemen.</li>
</ol>6. Verwerking van time-lapse beelden en het genereren van films met behulp van Fiji-software
<ol><li>Breng experimentele gegevens over naar een computer geladen met de Fiji-software. Start het Fiji-programma en open een afbeelding met Bestand | Open of door simpelweg het afbeeldingsbestand naar Fiji te slepen en te laten vallen.</li>
	<li>Kies in Importopties voor bio-opmaakde optie Stapel weergeven met Hyperstack in de weergaveopties voor stapel, Klik op Samengestelde kleurmodus in de kleuropties en markeer Automatisch schalen.</li>
	<li>Door door de beeldstapels te scrollen, beoordeelt u of de cellen en bdelloplasten in de loop van het experiment scherp bleven. Controleer of groene fluorescerende vlekken van DnaN-mNeonGreen aanwezig zijn in B. bacteriovoruscellen in bdelloplasten gedurende de groeifase, en zorg ervoor dat alle stadia van de roofzuchtige levenscyclus kunnen worden gevisualiseerd.</li>
	<li>Als u een bepaalde B. bacteriovoruscel/bdelloplast wilt analyseren, markeert u deze met behulp van de selectiegereedschappen in het Fiji-menu(Rechthoek, Ovaal, Polygon of Vrije hand). Het gekozen gebied dupliceren met afbeelding | Dupliceren of gebruiken met Ctrl + Shift + D.</li>
	<li>Pas de helderheid en het contrast voor elk fluorescentiekanaal als volgt aan:<ol>
<li>Als u één kanaal wilt kiezen, opent u Kanaalgereedschappen door op Afbeelding te klikken | Kleur | Kanalen tools of Ctrl + Shift + Z, en selecteer het kanaal van belang(Channel 1: mCherry, Channel 2: mNeonGreen, Channel 3: brightfield).</li>
		<li>Pas de helderheid en het contrast van beelden in het fluorescentiekanaal aan door het B&C-menu in Afbeelding te openen | Aanpassen | Helderheid/contrast of door op Ctrl + Shift + Cte klikken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schaalbalk toevoegen met Analyseren | Hulpmiddelen | Schaalbalk. Voeg de tijdstempel toe aan de afbeeldingen door op Afbeeldingen te klikken | Stapels | Tijd Stamper.</li>
	<li>Als u gewijzigde afbeeldingen wilt opslaan, gaat u naar Bestand | Opslaan als en kies TIFF om op te slaan als een beeldreeks, AVI om een film te produceren of PNG om één afbeelding van het huidige frame op te slaan.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege de toegenomen interesse in het gebruik van B. bacteriovorus als levend antibioticum, zijn nieuwe instrumenten nodig om de roofzuchtige levenscyclus te observeren, met name interacties tussen roofdieren en pathogenen. Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de gehele B. bacteriovorus levenscyclus te volgen, vooral tijdens de groei in de gastheer, in real-time. Bovendien maakte de toepassing van een stam die fluorescerend getagde bètaklem van DNA polymerase III holoenzym produceert, het moni...

Bdellovibrio bacteriovorus is een kleine (0,3–0,5 μm bij 0,5–1,4 μm) gram-negatieve bacterie die aast op andere gram-negatieve bacteriën, waaronder schadelijke ziekteverwekkers zoals Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, en Shigella flexneri1,2,3. Aangezien B. bacteriovorus ziekteverwekkers doodt, wordt het beschouwd als een potentieel levend antibioticum dat kan worden toegepast om bacteriële infecties te bestrijden, met name die veroorzaakt door multiresistente stammen.
B. bacteriovorus vertoont een eigenaardige levenscyclus bestaande uit twee fasen: een vrijlevende niet-replicanatieve aanvalsfase en een intracellulaire voortplantingsfase (figuur 1). In de vrijlevende fase zoekt deze zeer motile bacterie, die zich beweegt bij snelheden tot 160 μm/s, naar zijn prooi. Na het hechten aan het buitenste membraan van de prooi, komt het in het periplasma4,5. Tijdens de interperiplasmische voortplantingsfase gebruikt B. bacteriovorus een overvloed aan hydrolytische enzymen om de macromoleculen van de gastheer te degraderen en te hergebruiken voor zijn eigen groei. Kort na het binnenvallen van het periplasma sterft de gastheercel en opgeblazen in een bolvormige structuur genaamd een bdelloplast, waarin de roofzuchtige cel de chromosomen elongates en repliceert. Het replicatieproces begint bij de replicatieoorsprong(oriC)6 en gaat door totdat meerdere kopieën van het chromosoom volledig zijn gesynthetiseerd7. Interessant is dat replicatie van elk chromosoom niet wordt gevolgd door celdeling. In plaats daarvan, het roofdier elongates om een lange, multinucleoïde en filamenteuze cel te vormen. Bij uitputting van voedingsstoffen ondergaat de gloeidraad synchrone septatie en worden nakomelingen vrijgegeven uit de bdelloplast8.
Voordat B. bacteriovorus kan worden gebruikt als een levend antibioticum tegen bacteriële infecties, is het van cruciaal belang om de belangrijkste stadia van zijn levenscyclus te begrijpen, met name die in verband met de proliferatie ervan in de prooi. Live-cel beeldvorming van B. bacteriovorus is uitdagend geweest, vanwege de verschillende morfologische vormen van het roofdier en zijn prooi tijdens de complexe levenscyclus. Tot nu toe zijn de interacties tussen B. bacteriovorus en zijn gastheercel voornamelijk bestudeerd door elektronenmicroscopie en snap-shot analyse2,9,10, die beide beperkingen hebben, vooral wanneer ze worden gebruikt om opeenvolgende stadia van de roofzuchtige levenscyclus te controleren. Deze methoden bieden beelden met hoge resolutie van B. bacteriovoruscellen en maken observatie van een klein roofdier tijdens de aanval of groeifase mogelijk. Ze staan echter geen tracking toe van enkele B. bacteriovoruscellen gedurende beide levenscyclusfasen.
Hier gepresenteerd is een uitgebreid protocol voor het gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie (TLFM) om de volledige levenscyclus van B. bacteriovoruste controleren. Een systeem bestaande uit een agarose pad wordt gebruikt in combinatie met een cel-imaging schotel, waarin de roofzuchtige cellen vrij kunnen bewegen onder de agarose pad, terwijl de geïmmobiliseerde prooi cellen in staat zijn om bdelloplasten te vormen (Figuur 2). Deze opstelling wordt voorbereid op basis van specifieke stammen van zowel E. coli als B. bacteriovorus,maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan de afzonderlijke stammen van een gebruiker (bijvoorbeeld het dragen van verschillende selectiemarkers, eiwitten die zijn versmolten met verschillende fluoroforen, enz.).
In dit geval, om B. bacteriovorus tijdens de aanvalsfase te visualiseren, werd een specifieke stam (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) gebouwd die een fluorescerende versie van het cytoplasmische eiwit uitdrukt, PilZ (beschikbaar in ons laboratorium op verzoek)7. Deze stam produceert bovendien DnaN (de β-schuifklem), een subunit van DNA polymerase III holo-enzym, versmolten met een fluorescerend eiwit. Hierdoor kan de lopende DNA-replicatie worden gecontroleerd in de roofzuchtige cellen als ze groeien binnen bdelloplasten.
Hoewel het beschreven protocol en de software die voor beeldverwerving worden gebruikt, verwijzen naar een omgekeerde microscoop die door een specifieke fabrikant wordt geleverd (zie tabel van materialen),kan deze techniek worden aangepast voor elke omgekeerde microscoop die is uitgerust met een milieukamer of andere externe verwarmingshouder en die in staat is om time-lapse beeldvorming te maken. Voor gegevensanalyse kunnen gebruikers alle beschikbare software kiezen die compatibel is met de afzonderlijke uitvoerindelingen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg"> Figuur 1: B. bacteriovorus levenscyclus in E. coli als gastheercel. Tijdens de aanvalsfase zoekt en hecht een vrijzwemende B. bacteriovoruscel naar en hecht deze aan een gastheer E. coli-cel. Na de invasie wordt de roofzuchtige cel gelokaliseerd in het periplasma van de prooi, waardoor de vorm van de gastheercel verandert en een bdelloplast wordt gevormd. De voortplantingsfase begint met bdelloplastformatie. De roofzuchtige cel verteert de prooicel en hergebruikt eenvoudige verbindingen om zijn eigen structuren te bouwen. B. bacteriovorus groeit als een lange gloeidraad in het periplasma van de gastheer. Wanneer de middelen van de prooicel uitgeput zijn, vertolft de B. bacteriovorus filament synchroon en vormt ze nakomelingencellen. Nadat de nakomelingen hun flagella hebben ontwikkeld, lyse ze bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotor ref. 12183</td></tr><tr><td>CertifiedMolecular Biology Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>low fluorescence agarose for agarose pad</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Open source image processing package</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dish 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>uncoated glass</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart Filter 0.45 &micro;m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>Manufacturer-supplied imaging software</td></tr></tbody></table>

live-cell beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële predator bdellovibrio bacteriovorus met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is een kleine gram-negatieve, obligate roofzuchtige bacterie die andere gram-negatieve bacteriën doodt, waaronder schadelijke ziekteverwekkers. Daarom wordt het beschouwd als een levend antibioticum. Om B. bacteriovorus toe te passen als een levend antibioticum, is het eerst noodzakelijk om de belangrijkste stadia van zijn complexe levenscyclus te begrijpen, met name de proliferatie in prooi. Tot nu toe is het een uitdaging geweest om opeenvolgende stadia van de roofzuchtige levenscyclus in real-time te volgen. Hier gepresenteerd is een uitgebreid protocol voor real-time beeldvorming van de volledige levenscyclus van B. bacteriovorus, vooral tijdens de groei in de gastheer. Hiervoor wordt een systeem gebruikt dat bestaat uit een agarosepad in combinatie met celbeeldvormingsschotels, waarin de roofzuchtige cellen zich vrij onder het agarosepad kunnen bewegen terwijl geïmmobiliseerde prooicellen bdelloplasten kunnen vormen. De toepassing van een stam die een fluorescerend gelabelde β-subunit van DNA polymerase III produceert, maakt het verder mogelijk om chromosoomreplicatie te monitoren tijdens de reproductiefase van de B. bacteriovorus levenscyclus.

Het beschreven TLFM-gebaseerde systeem maakt het mogelijk om individuele cellen van B. bacteriovorus op tijd bij te houden (figuur 3, film 1) en biedt waardevolle informatie over elke fase van de complexe roofzuchtige levenscyclus. De PilZ-mCherry fusie maakt het mogelijk de gehele roofcel te labelen in de aanvalsfase en het vroege stadium van de groeifase(figuur 3). De overgang van de aanval naar de replicante fase werd niet alleen gev...

Hier gepresenteerd is een protocol dat het toezicht op de volledige levenscyclus van roofzuchtige bacterie Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie in combinatie met een agarose pad en cell-imaging gerechten beschrijft.

Live-Cell Beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële Predator Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van Time-Lapse Fluorescentie Microscopie

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Live-Cell Bdellovibrio bacteriovorus beeldvorming is uitdagend vanwege de complexe levenscyclus van deze roofzuchtige bacteriën. Ons protocol maakt het mogelijk om de stadia van volledige levenscyclus in realtime te monitoren. Hoewel ons protocol is gebaseerd op een specifieke egaliseren stammen, het kan gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van bacteriële stammen, waaronder pathogene stammen.Om het opzetten van een B.bacteriovorus cultuur, combineren een milliliter verse 24-uurs gekweekte bacteriën met drie milliliter van 's nachts prooi cultuur in een 250 milliliter fles met 50 milliliter calcium hippies buffer aangevuld met antibiotica als dat nodig is. Controleer na een 24-uurs incubatie bij 30 graden Celsius en 200 omwentelingen per minuut of de prooicellen volledig zijn gelyseerd door vloeistofgemonteerde gezichtscontrastmicroscopie. Tal van multi-attack gefaseerde B.bacteriovoruscellen moeten aanwezig zijn en er mag geen E.coli cel of bdelloplast zichtbaar zijn.Zeef de B.bacteriovoruscultuur door een filter van 0,45 micrometer porie in een kegelvormige buis van 50 milliliter en schorst het filtraat in een centrifuge. Stel vervolgens de B.bacteriovoruspellet opnieuw op in drie milliliter calciumhippies buffer tot een uiteindelijke optische dichtheid op 600 nanometer van ongeveer 0,2 en ontcuut de bacteriën bij 30 graden Celsius en 200 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten. Om de gastheercellen voor te bereiden, selecteert u een enkele kolonie uit de gastheerstam van belang en knikt u de bacteriën in 10 milliliter YT-medium aangevuld met antibiotica, indien nodig voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 180 omwentelingen per minuut.De volgende ochtend overdracht twee milliliter van de nachtelijke cultuur naar een twee milliliter reageerbuis en pellet de cellen door centrifugatie. Dan opnieuw opschorten de pellet in 200 microliters van calcium hippies buffer. Het is zeer belangrijk om de hele celpellet volledig opnieuw op te schorten na centrifugatie om ervoor te zorgen dat de prooicel op het niveau van één cel wordt gescheiden.Om de cellen voor te bereiden op time-lapse fluorescentie microscopie, ten eerste, meng 200 milligram lage fluorescerende moleculaire graad agarose met 20 milliliter calcium hippies buffer en los de agarose in een magnetron. Giet drie milliliter van de gesmolten agarose in een 35 millimeter glazen bodemschotel en laat de agarose stollen. Verwijder met behulp van een microspatel in het laboratorium voorzichtig het agarosepad uit de schotel zonder de middelste paal van het pad te verstoren en plaats de onderzijde van het pad op een petrischaaldeksel.Plaats vijf microliter van de geconcentreerde gastheercelsuspensie op het omgedraaide pad en gebruik een inentingslus om cellen in de middelste paal te verspreiden. Voeg vervolgens vijf microliter van de geconcentreerde B.bacteriovorus suspensie toe aan het gecoate oppervlak van de gastheercel zonder verspreiding en keer de gel snel terug naar de bovenzijde van de 35 milliliter glazen bodemschaal. Bedek vervolgens de schotel met een deksel.Voor Time-Lapse Florescence microscopie van de co-cultuur, plaats het gerecht in een petrischaal houder zodanig dat het gerecht niet zal bewegen in de loop van het experiment en plaats een druppel onderdompeling olie op de omgekeerde microscoop doelstelling en een druppel op de bodem van de schotel. Monteer de houder op het microscoopstadium in de omgekeerde microscoopkamer en zet in de microscoopsoftware de vergroting op 100X en de polychrome lens op GFP en Mcherry. Met behulp van een iPS in Brightfield, zoek het brandpuntsvlak en open de zinloze manager.Verplaats het werkgebied en gebruik de knop Markeringspunten om de coördinaten van ten minste 10 posities van belang op te slaan. Schakel de camera val van de iPS naar de monitor. Stel het brandpuntsvlak in en klik op de knop Punt vervangen in het punt dat u niet wilt gebruiken om elk punt te kalibreren.Open de doos met het stapelen van de experimentontwerper en de merkziekte. Selecteer de juiste tl-kanalen en de optimale eliminatie-instellingen en stel de intervallen in tussen de beeldverwerving en de totale tijd van het experiment. Schakel focusonderhoud in voor de gekozen posities en selecteer de gegevensmap waarin de afbeeldingsbestanden automatisch moeten worden opgeslagen.Controleer alle instellingen in de microscoopsoftwarebesturing opnieuw en start het time-lapse-experiment. Controleer na het eerste uur van het experiment of alle podiumposities nog steeds scherp zijn. Wanneer het time-lapse-experiment is voltooid, verwijdert u de petrischaal en gooit u de 35 millimeter schotel weg met een agarosepad volgens de juiste bioveiligheidsprotocollen.Voor de verwerking van de time-lapse beeldgegevens, de overdracht van de experimentele gegevens naar een computer geladen met de Fiji-software en open een afbeelding in Fiji. Selecteer in importopties voor bioformaten de weergavestack met hyperstack. Selecteer in de samengestelde kleurmodus automatische schaal.Door te scrollen door de afbeelding stapels beoordelen of de cellen en bdelloplasten bleef focus in de loop van het experiment. Of de groene fluorescerende vlekken van het DNA en mNeon groen aanwezig zijn in de B.bacteriovorus cellen in de bdelloplasten gedurende de groeifase en of alle stadia van de roofzuchtige levenscyclus kan worden gevisualiseerd. Als u een bepaalde B.bacteriovoruscel bdelloplast wilt analyseren, gebruikt u een selectiegereedschap om de cel van belang te markeren.Dupliceer vervolgens de gekozen regio. Klik in de gedupliceerde afbeelding op proces en vloeiend en klik voor elk tl-kanaal op afbeelding, kleur, kanalengereedschappen en selecteer het kanaal van belang. Klik vervolgens op afbeelding, aanpassen en helderheidscontrast om de helderheid en het contrast van de afbeelding in elk kanaal aan te passen.Als u een schaalbalk wilt toevoegen, selecteert u analyseren, gereedschappen en schaalbalk. Als u een tijdstempel aan de afbeeldingen wilt toevoegen, klikt u op afbeeldingen, stapels en tijdstempel. Als u de gewijzigde afbeeldingen wilt opslaan, selecteert u TIF.Als u de gegevens wilt opslaan als een beeldreeks, moet AVI een film of PNG produceren om één afbeelding van het huidige frame op te slaan. Dit Time-Lapse Fluorescentie microscopie gebaseerd systeem maakt het mogelijk om individuele B.bacteriovoruscellen real-time te volgen en biedt waardevolle informatie over elke fase van de complexe roofzuchtige levenscyclus. De pillsy mCherry fusie maakt het mogelijk de hele roofzuchtige cel te worden gelabeld in de aanvalsfase en in het vroege stadium van de groeifase.De overgang van de aanval naar de replicante fase kan niet alleen worden gevisualiseerd door de host bdelloplast formatie, maar ook door het uiterlijk van de replisome. De replisome wordt geassembleerd op de binnenvallende celpool en meer dan een replisome kan worden waargenomen binnen een groeiende B.bacteriovorus filament als de reproductiefase vordert. Nadat meerdere kopieën van het chromosoom zijn gesynthetiseerd, wordt de replicatie beëindigd.Ten slotte wordt de multinucleated filament septatie ondergaan en worden de nakomelingencellen uit de bdelloplast vrijgegeven. De B.bacteriovorus cellen moeten materieel genoeg zijn om actief te zoeken naar hun prooi en de hele celdichtheid moet hoog genoeg zijn om roofzuchtige celbevestiging mogelijk te maken. Dit platform kan nuttig zijn bij experimenten met multiresistente ziekteverwekkers en om verbeteringen in de genetische manipulatie van de B.bacteriovorus als levend antibioticum in de menselijke en veterinaire geneeskunde te vergemakkelijken.

live-cell-imaging-life-cycle-bacterial-predator-bdellovibrio

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

Dit artikel beschrijft de procedure voor het bereiden van een fluorescentie-gemerkte versie van bacteriofaag lambda, infectie...

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

Source: Heering, J., et al., Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the preparation of swarmer cells from a Vibrio parahaemolyticus colony for fluorescence imaging. The bacteria are genetically engineered to express a fluorophore-tagged protein that localizes unipolarly in swimmer cells and bipolarly in elongated swarmer cells, allowing for their visual differentiation. An...

Preparation of Vibrio parahaemolyticus Swarmer Cells for Imaging

Source: Schumacher, D., and Sogaard-Andersen, L. Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the use of live-cell imaging to track fluorescently tagged chromosome origins during bacterial cell division. It captures chromosome segregation dynamics using time-lapse phase-contrast and fluorescence microscopy.

Time-Lapse Imaging of Chromosome Segregation in Fluorescently Labeled Bacteria

Source: Makowski, Ł., et al. Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates time-lapse fluorescence imaging of Bdellovibrio bacteriovorus preying on immobilized E. coli beneath an agarose pad, enabling real-time visualization of intracellular replication and progeny release for studying bacterial predation and host-pathogen interactions.

Live-Cell Time-Lapse Imaging of Bdellovibrio bacteriovorus Predation on E. coli

Source: Brzozowski, R. S. et al. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates live-cell fluorescence microscopy to visualize real-time morphological changes in bacteria. It outlines the steps involved in imaging, time-lapse acquisition, and deconvolution to obtain high-resolution images in real time.

Imaging Morphological Changes in Bacteria Using Live-Cell Fluorescence Microscopy

Streptomyces worden gekenmerkt door een complexe levenscyclus die experimenteel uitdagend is gebleken om te bestuderen met cellulair-biologische methoden. Hier presenteren we een protocol om fluorescentie time-lapse microscopie van de volledige levenscyclus uit te voeren door Streptomyces venezuelae te laten groeien in een microfluïdisch apparaat.

Fluorescentie Time-lapse beeldvorming van de volledige<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Met behulp van een microfluïdische apparaat

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.

Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Leer hoe je de levenscyclus van het roofbacterie Bdellovibrio bacteriovorus in levende cellen volgt met tijdverloop-fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van predatie-interacties mogelijk.

Live-Cell Beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële Predator Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van Time-Lapse Fluorescentie Microscopie (Video) | JoVE Journal

Live-Cell Beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële Predator Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van Time-Lapse Fluorescentie Microscopie

Meer video's verkennen