Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten
16 mei 2020
Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.
Het voordeel van het gebruik van differentiële centrifugatie voor dit protocol is dat het gemakkelijk schaalbaar is tot liters en daarom ideaal is voor het isoleren van exosomen uit primaire fibroblasten. Gezuiverde exosomen kunnen worden verkregen uit verschillende celtypen en weefsels geïsoleerd uit verschillende ziektemodellen. De exosomen kunnen worden gebruikt als diagnostische biomarkers.
Demonstratie van de procedure zal worden gedaan door Diantha van de Vlekkert, een wetenschapper van het d'Azzo Laboratorium. Om te beginnen, weeg de muisspieren en breng ze vervolgens over naar een 10-centimeter schaal. Werkend onder een bioveiligheidskast, hak de spieren fijn met scalpels om een fijne pasta te produceren. Breng de fijngehakte spierpasta over naar een 50-milliliter buis en voeg spijsverteringsoplossing toe met 3,5 keer het volume per milligram weefsel.
Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Om volledige dissociatie te bevorderen, meng de suspensie grondig met een 5-milliliter pipette elke 10 minuten. Om de spijsverteringsoplossing te inactiveren, voeg 20 milliliter DMEM Complete toe aan de celsuspensie.
Pipetteer door een 70-micrometer nylon celstrainer geplaatst op een 50-milliliter buis, en spoel vervolgens de celstrainer met een extra 5 milliliter DMEM Complete. Centrifugeer de celsuspensie bij 300g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in 10 milliliter DMEM Complete.
Zaai de cellen in een 10-centimeter schaal en plaats de schaal in de incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 3% zuurstof. De skeletspier fibroblast cultuur moet worden gehandhaafd op een laag zuurstofniveau om fysiologische lichtomstandigheden te waarborgen. Het zuurstofniveau in de skeletspier is ongeveer 2,5%Nadat de cellen 100%confluency hebben bereikt, kweek ze nog een dag verder, spoel ze vervolgens met PBS en voeg een milliliter trypsinisatieoplossing toe.
Na 10 minuten incubatie van de cellen, stop de trypsinisatie door 10 milliliter DMEM Complete toe te voegen. Breng de celsuspensie over naar een 50-milliliter buis en centrifugeer de cellen bij 300g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer vervolgens het pellet opnieuw in 20 milliliter DMEM complete en zaai de cellen in een 15-centimeter schaal.
Verzamel het geconditioneerde medium van de gekweekte fibroblasten in een 15-milliliter buis. Centrifugeer het geconditioneerde medium bij 300g gedurende 10 minuten om de levende cellen te pelleten. Breng het supernatant over naar een nieuwe 50-milliliter buis en pellet de dode cellen door de buis te centrifugeren bij 2.000g gedurende 10 minuten.
Breng vervolgens het supernatant over naar een 38,5-milliliter polypropyleen buis en centrifugeer de buis bij 10.000g gedurende 30 minuten om organellen, apoptotische lichamen en membraanfragmenten te verwijderen. Om de exosomen te pelleten, breng het supernatant over naar een 38,5-milliliter ultraklare buis en ultracentrifugeer het bij 100.000g gedurende 1,5 uur. Gooi voorzichtig het supernatant weg, waarbij ongeveer een milliliter geconditioneerd medium overblijft.
Was het exosome pellet en suspendeer het opnieuw in maximaal 30 milliliter ijskoud PBS. Centrifugeer de exosomen opnieuw bij 100.000g gedurende 1,5 uur. Om de zuivering te voltooien, verwijder het supernatant door te pipetteren, waarbij u voorzichtig moet zijn om het exosome pellet niet te verstoren.
De exosome pellet stap kan los zijn en gemakkelijk loslaten. Daarom moet het verwijderen van het PBS supernatant zeer voorzichtig worden gedaan met behulp van een 200-microliter pipette. Suspendeer het pellet opnieuw in ijskoud PBS met 25 microliter per 15-centimeter schaal van fibroblasten.
Ten slotte meet de eiwitconcentratie met behulp van de BCA Protein Assay Kit en een microplaatlezer bij 562 nanometer. Dit protocol is een zeer reproduceerbare en consistente methode voor het zuiveren van exosomen. Transmissie-elektronenmicroscopie toont de relatief uniforme grootte van deze exosomen.
De immunoblot van exosome lysaten toont een canonieke patroon van eiwitexpressie en de afwezigheid van LDH en calnexine-eiwitcontaminanten. Exosomen werden gescheiden door een sucrose-dichtheidsgradient, en individuele fracties werden getest op een western blot met antilichamen tegen Alix, CD9 en CD81. Exosomen sedimenteerden consequent in fracties drie tot zes.
De geïsoleerde en geconcentreerde bioactieve exosomen kunnen worden gebruikt voor elektronenmicroscopie en massaspectrometrie analyses, evenals voor in-vitro en in-vivo opname-experimenten voor functionele studies. Dit protocol is geschikt voor de isolatie van exosomen uit laag secretoire cellen en kan worden toegepast om de betrokkenheid van exosomen bij humane fibrotische ziekten te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol illustreert de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemiusspier van een volwassen muis en de zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode gecombineerd met sucrose-dichtheidsgradiënten, gevolgd door western blot-analyses. De mogelijkheid om exosomen uit primaire fibroblasten te isoleren, maakt deze methode significant voor het bestuderen van hun potentieel als diagnostische biomarkers.
Belangrijke componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Exosoomonderzoek
- Fibrotische ziekten
Achtergrond
- De isolatie van primaire fibroblasten biedt inzicht in cellulaire mechanismen.
- Exosomen spelen een cruciale rol bij de celcommunicatie en kunnen dienen als biomarkers voor ziekten.
- De techniek maakt schaalbare isolatie van exosomen uit diverse weefsels mogelijk.
Gebruikte methoden
- Differentiële ultracentrifugatie voor exosoomzuivering
- Muis gastrocnemiusspier als biologisch systeem
- Western blot-analyses voor karakterisering
Belangrijkste resultaten
- Exosomen uit fibroblasten succesvol geïsoleerd en gekarakteriseerd.
- Een consistent sedimentatiepatroon van exosomen via sucrosegradiënten waargenomen.
- De afwezigheid van eiwitcontaminanten in gezuiverde exosomen aangetoond.
Conclusies
- Deze studie stelt een reproduceerbare methode vast voor het isoleren van exosomen, wat kan bijdragen aan het begrip van fibrotische ziekten.
- De resultaten benadrukken de potentiële therapeutische toepassingen van exosomen in de diagnostiek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van exosomen uit primaire fibroblasten van skeletspieren maakt schaalbare productie van extracellulaire blaasjes mogelijk voor biomarkerontdekking en functionele studies in fibrotische ziekte-modellen. Het protocol ondersteunt reproduceerbare zuivering met behulp van differentiële centrifugatie en sucrose-dichtheidsgradiënten, wat downstream-applicaties zoals massaspectrometrie en elektronenmicroscopie faciliteert. Deze aanpak verbetert de validatie van targets door een consistente bron van bioactieve exosomen te bieden voor mechanische risicoreductie in preklinisch onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de inhoud van fibroblast-afgeleide exosomen te onderzoeken om paracriene signaleringsmechanismen bij weefselhomeostase en fibrose te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbare methode om exosomen uit primaire cellen te isoleren, wat zorgt voor een consistente levering voor analyse van doelgerichte signaalpaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Gezuiverde exosomen leveren kwantitatieve eiwit- en lipidprofielen die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en de ontwikkeling van biomarkerpanels.
- Operationele waarde: De methode maakt de verwerking van grote volumes mogelijk, wat high-throughput screening van exosoom-geassocieerde cargo over verschillende experimentele condities faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Exosomen geïsoleerd uit ziekte-relevante fibroblasten ondersteunen de uitlijning van translationele biomarkers en preklinische functionele validatie.
- Operationele waarde: De aanpasbaarheid van het protocol aan diverse weefsels en vloeistoffen vergemakkelijkt de continuïteit tussen verschillende modellen in studies voor het beperken van risico's bij targets.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege targetbiologie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor studies naar communicatie tussen stromale cellen en signalering via extracellulaire blaasjes.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing naar de rol van fibroblast-exosomen bij de progressie van fibrose en intercellulaire signalering.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde preparatie van exosomenmonsters mogelijk voor comparatieve analyse van de cargo-samenstelling onder verschillende condities.
- Analytica: Genereert monsters die geschikt zijn voor western blot, elektronenmicroscopie en massaspectrometrie voor multi-omische karakterisering.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de isolatie van fibroblast-exosomen met preklinische modellen van fibrotische ziekten door middel van consistente, schaalbare vesikelproductie.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Het protocol is aanpasbaar voor verschillende celtypen en weefsels, waardoor het een herbruikbaar platform vormt voor biomarkerprogramma's op basis van exosomen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door de variabiliteit in exosoomzuiverheid en opbrengst te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde centrifugatiestappen en gradiëntzuivering.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door betrouwbare biomarker-kandidaten te leveren uit mechanistisch relevante celbronnen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van exosoom-gestuurde diagnostische of therapeutische wegen op basis van consistente functionele gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek, ultracentrifugatie en western blot-technieken.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie-apparatuur en de mogelijkheid om sucrosegradiënten voor te bereiden.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente exosoomopbrengst en zuiverheidsbeoordeling.
- Aanpassing aan menselijke weefselmodellen of ziektemodellen kan optimalisatie van de digestie- en kweekcondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de potentiële co-isolatie van proteïneaggregaten als de gradiëntstappen niet zorgvuldig worden uitgevoerd.
