Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Ons protocol verbeterde zowel de doorvoer als de tijdsefficiëntie voor het verkrijgen van RT-qPCR-gegevens direct uit enkele of kleine bulk monsters zonder de noodzaak van RNA-isolatie. Met behulp van dit protocol kunnen meer dan 9.000 RT-qPCR-resultaten worden verkregen in slechts twee dagen werk op de werkbank, een proces dat normaal gesproken ongeveer vijf weken zou duren met standaard 96-wells qPCR. Dit protocol biedt een snellere, robuuste en zeer gevoelige RT-qPCR-test in C. elegans, die ideaal is voor het bewaken van de interindividuele variabiliteit in de genexpressie tussen isogene wormen.

Begin door de wormen van hun bacteriënlaag op een verse, ongezaaide nematodengroeimediumplaat te plukken en laat de wormen vijf minuten rond de plaat bewegen. Terwijl de wormen acclimatiseren, meng in een RNase-vrije kap 10 microliters van lysisbuffer met een tot 100 Dnase I per monster en plaats het deksel van een PCR-strip ondersteboven op het platform van een dissectiemicroscoop. Voeg vervolgens 10 microliters van de lysismix toe aan de koepelkapsjes van PCR-buisjes en schep de wormen van de plaat om te voorkomen dat bacteriën in elke sleuf van het deksel worden overgebracht.

Wanneer alle wormen zijn overgebracht, sluit u de doppen en laat de buisjes vijf seconden draaien voordat u de buisjes in een Dewar-fles met vloeibare stikstof plaatst. Na de laatste vijf seconden, ontdooi de buisjes in een waterbad van 40 graden Celsius voordat u de bevriezing/ontdooi procedure nog negen keer herhaalt. Na de laatste bevriezing/ontdooi cyclus, meng de gelyseerde monsters op een thermische mixer gedurende 20 tot 30 minuten bij vier graden Celsius en ongeveer 1800 omwentelingen per minuut.

Aan het einde van de mengincubatie, centrifugeer de monsters zoals gedemonstreerd en voeg een microliter vers ontdooide stopoplossing toe aan elke buis. Voor de reverse transcriptie van bulk warme monsters, bereid in een RNase-vrije kap een enzymbuffer mastermix en voeg 14 microliters mastermix toe aan 11 microliters van elk monster. Laat de monsters door een thermocycler lopen met behulp van het aangegeven reverse transcriptieprogramma en verdun het resulterende cDNA-product in een verhouding van één op vier in nuclease-vrij water.

Voor doelspecifieke pre-amplificatie, voeg 3,75 microliters pre-amplificatie mastermix toe aan één putje per monster in een 96-wells plaat en voeg 1,25 microliters van elke cDNA-oplossing toe aan elke putje van mastermix. Wanneer alle monsters zijn geladen, dek de plaat af met afdichtingstape en kortjes vortex de monsters voordat u ze door centrifugatie naar beneden draait, laad vervolgens de plaat in een thermocycler en voer het programma uit zoals aangegeven. Om niet-geïncorporeerde primers uit de pre-amplificatie te verwijderen, centrifugeer de monsterplaat aan het einde van de thermocyclus en verwijder voorzichtig de afdichting.

Voeg twee microliters van exonuclease I mastermix toe aan elke pre-amplificatiereactie en sluit opnieuw, centrifugeer en laad de plaat terug in de thermocycler. Aan het einde van de cyclus, verdun de monsters met 18 microliters Tris-EDTA buffer. Om een multi-array chip op te zetten, voeg 3,6 microliters van de assay loading master mix en 0,4 microliters van 50 micromolar voorwaartse omgekeerde primer toe aan één putje per monster in een 384-wells plaat.

Voeg vervolgens 2,2 microliters van de monster master mix en 1,8 microliters van elk preamplificeerd exonuclease I behandeld monster toe aan de juiste putjes van de plaat. Om een single-array chip op te zetten, voeg 5,4 microliters van de assay loading master mix en 0,6 microliters van de voorwaartse omgekeerde primer toe aan één putje per monster van een tweede 384-wells plaat, voeg vervolgens 3,3 microliters van de monster master mix en 2,7 microliters van elk preamplificeerd exonuclease I behandeld monster toe aan de juiste putjes van de voorbereide single-array plaat. Om de nanofluidics chip voor de eerste run te primen, injecteer langzaam en voorzichtig 150 microliters controlelijnvloeistof in de accumulatoren van de chip terwijl u de chip onder een hoek van 45 graden houdt.

Wanneer alle vloeistof is geladen, verwijder de blauwe beschermfolie van de onderkant van de chip en plaats de chip in de nanofluidics PCR priming machine met de streepjescode naar buiten gericht. Voer vervolgens de Prime(153x)script uit. Na het primen, plaats de chip op een donker oppervlak en verwijder, wanneer elk assay of monstermix wordt geladen, de corresponderende barrièrepluggen indien nodig en voeg het juiste volume van het assay of monstermix toe aan de corresponderende inlaten van de nanofluidische chip volgens het experimentele plan.

Na het laden, plaats de chip in de nanofluidische thermocycler en voer het juiste protocol uit in de dataverzameling software. Als de hele multi-array chip niet wordt gebruikt, voer een post-script run uit om downstream gebruik van resterende chip arrays mogelijk te maken. Om te testen of het worm-tot-Ct protocol een geldige cDNA-extractiemethode is, werd de methode vergeleken met standaard guanidiumthiocyanaat-fenol-chloroform extractiemethoden.

Globaal waren hsp-70 mRNA expressieniveaus per 100 nanogram totaal RNA vergelijkbaar met behulp van zowel de fenol-chloroform als worm-tot-Ct methoden. Echter, in de gevallen van de hoogste hsp-70 expressie, was de expressie hoger met de worm-tot-Ct methode, wat duidt op een verbeterde gevoeligheid. Voor guanidiumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie van bulk monsters, verminderde hsp-70 met 82,7 bij hsf-1 mutanten vergeleken met controles en met 92,3% voor warm-tot-Ct, wat aangeeft dat de afname vergelijkbaar was tussen de twee methoden.

Met behulp van cDNA verkregen uit bulk monsters van 25 wormen of uit een gemiddelde van 36 enkele worm monsters, detecteerden de methoden vergelijkbare expressieniveaus voor alle geteste chaperones, wat aangeeft dat de parameters verkregen uit enkele wormen betrouwbaar zijn. Hier worden de gemiddelde expressie van meerdere hsp transcripten van enkele wormen na een korte hitteschok getoond. Zoals waargenomen, verschilt de variabiliteit in de expressie van de transcripten dramatisch tussen verschillende genen.

Voor elk