Name: Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Leer massaspectrometrieanalyse om ubiquitinering van EYFP-CENP-A te identificeren met behulp van immunoprecipitatie en eiwit-A parels. Deze methode onthult cruciale modificatiesites voor centromeerfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Chao-Jun Li van het Model Animal Research Center, Nanjing University voor de analyse van massaspectrometrie. Wij danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, en de huidige onderzoekers van het Model Animal Research Center, Nanjing University en Greehey Children's Cancer Research Institute voor hun nuttige discussie, experimentele begeleiding en reagentia. Wij danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago en Dawn S. Chandler voor hun gulle giften van reagentia. Y.N. werd ondersteund door de provincie Jiangsu ''Double-First-Class'' Bouwfonds, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) en National Natural Science Foundation in China (31970665). Deze studie werd mede ondersteund door NCI grant R21 CA205659.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Hier beschreven we methoden van massaspectrometrie analyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren suggereert dat de EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit8. In onze resultaten hebben we met succes alomtegenwoordigheid geïdentificeerd op lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, die overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrieanalyse. De hier beschreven massaspectrometrieanalyse i...

In de meeste eukaryoten moeten spindelmicrotubuli zich hechten aan één enkel gebied van elk chromosoom, centromere genoemd. De kinetochore is een complex van eiwitten die zich op de centromere bevinden. Het bestuderen van de timing van centromere en kinetochore eiwit bewegingen en de structuur van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosoom instabiliteit (CIN) en kanker progressie. De belangrijkste vragen zijn hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en hoe ze deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie. In de meeste soorten, de aanwezigheid van een speciaal nucleosoom met een specifieke histone-achtige eiwit genaamd CENP-A definieert de centromere identiteit. Daarom wordt voorgesteld dat CENP-A de niet-DNA-indicator (epigenetisch merk) van centromere identiteit is. Het is belangrijk om het mechanisme op te helderen van hoe CENP-A de centromere identiteit bij mensen definieert.
De Holliday junction recognition protein (HJURP) is de CENP-A-specifieke chaperon die CENP-A in centromerische nucleosomen1,2,3deponeert . We have previously reported that the CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase is required for CENP-A ubiquitylation on lysine 124 (K124) and centromere localization4. Ook onze resultaten toonden aan dat de centromere werving van nieuw gesynthetiseerde CENP-A vereist reeds bestaande ubiquitylated CENP-A5. Thus, a model was provided suggesting that CENP-A ubiquitylation is inherited through dimerization between cell divisions.
In tegenstelling tot onze bevindingen en die van Yu et al., werden de negatieve resultaten betreffende CENP-A en zijn centromeric lokalisatie onlangs gepubliceerd6. Het artikel beweerde dat CENP-A wijzigingen op lysine 124 (K124) zijn onmisbaar voor de oprichting, onderhoud, en de functie op lange termijn van de menselijke centromeres, op basis van hun negatieve resultaten waaruit blijkt dat de mutatie van K124R niet van invloed CENP-A centromere lokalisatie noch cel levensvatbaarheid6. Er is echter voldoende ruimte voor discussie in hun resultaten en conclusies, en we hebben al beschreven welk probleem er zou kunnen zijn in hun vorige publicatie7. Er moet op worden gelet dat ze eiwitten hebben versmolten met CENP-A, die veel grotere moleculaire gewichten hebben dan de grootte van endogene CENP-A: bijvoorbeeld, ze gesmolten ~ 30 kDa verbeterde gele fluorescente eiwitten (EYFP) tot ~ 16 kDa CENP-A en analyseerde EYFP-CENP-A K124R fusie eiwit in hun RPE-1 CENP-A-/F knock-out systeem. K124 ubiquitine zal naar verwachting niet rechtstreeks binden aan HJURP op basis van structurele voorspellingen4,maar de toevoeging van mono-ubiquitine zal naar verwachting een impact hebben op de eiwitcontenschap van CENP-A. Het eiwit van CENP-A-conformatie kan worden veranderd door de aanwezigheid van een groot fusie-eiwit, en deze conformatieverandering kan de structurele veranderingen maskeren die worden veroorzaakt door het verlies van alomtegenwoordigheid. Wij stellen voor dat de fusie van groot-en klein-grote eiwit alome alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt / maskeert de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype. Bewijs dat alomtegenwoordigheid optreedt bij verschillende lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit met een large tag eiwit (EYFP) werd gemeld in onze vorige publicatie8. Er werd vastgesteld dat EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert van een andere lysinesite van EYFP-CENP-A K124R en dat EYFP-CENP-A K124R mutant bindt aan HJURP. Als gevolg hiervan remt/maskeert deze alomtegenwoordigheid op een andere locatie het oorspronkelijke K124R enkel mutantene fenotype, en zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden centromere lokalisatie (we gebruikten en vergeleken pBabe-EYFP-CENP-A WT en K124R mutant, samen met pBabe-EYFP control.). The results demonstrated that Flag-tagged or untagged CENP-A K124R mutants are lethal but can be rescued by a monoubiquitin fusion, suggesting that CENP-A ubiquitylation is indispensable to cell viability.
In de afgelopen jaren hebben veel studies verschillende tests ontwikkeld om posttranslationele modificaties (PTMs) van CENP-A-eiwit en andere centromere-kinetochore-eiwitten te identificeren, zowel in vivo als in vitro9,10,11. Analoog aan de PTMs van histoneiwitten die een belangrijk mechanisme zijn dat de functie van chromatine regelt, zijn PTMs van centromerische chromatinecomponenten ook betrokken bij een essentieel mechanisme om de algehele structuur en functie van centromeres te reguleren. De meeste CENP-A PTM-sites zijn specifiek voor CENP-A-bevattende nucleosomen, hoewel een paar daarvan in histone H3 worden bewaard, wat suggereert dat wijziging van deze residuen bijdraagt aan de centromere-specifieke functie. PTMs van CENP-A met inbegrip van fosforylatie, acetylatie, methylatie, en alomtegenwoordigheid werden eerder gemeld9, wat suggereert dat CENP-A wordt onderworpen aan een verscheidenheid van PTM's en hun combinatorische arrays op zijn amino terminus en C-terminus histone-fold domein. Het belang van CENP-A wijzigingen in meerdere functies werd onthuld door vele groepen, waaronder de onze. Deze functies omvatten CENP-A depositie bij centromeres, eiwitstabiliteit en rekrutering van het CCAN (constitutief centromere-geassocieerd netwerk)9. Beperkte studies en bevindingen van CENP-A PTM's zijn echter voorgevormd wanneer vergelijkingen worden gemaakt met een van canonieke histonen die hun functie direct of indirect reguleren. Technische rapporten die zich richten op de methodologie om deze CENP-A PTMs te identificeren zijn ook beperkt.
Because CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere12, inherited through dimerization between cell division5, and indispensable to cell viability8, the method to identify CENP-A ubiquitylation would be essential in future to study the functional activity, positioning, and structure of the centromere. Daarom beschrijven we hier massaspectrometrie-analyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R-mutant te identificeren, wat suggereert dat de EYFP-tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in het CENP-A K124R gemuteerde eiwit8. Protocollen van andere controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) worden ook gepresenteerd om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken.

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml protein low binding tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>10cm cell culture dish</td><td>BIOFIL/JET, China</td><td>700224</td><td>10 cm weefselkweekschaal (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-well kweekplaat</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO</td><td>-</td><td>Benchtop vacuüm concentrator voor vaccum droog peptiden voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu;m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Liquid chromatography (RPLC) kolom voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Olie immersie lens</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Olie immersie lens</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Voor western blot</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td><td>Leica</td><td>-</td><td>gemotoriseerde fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Leica EL6000 compact light source</td><td>Leica</td><td></td><td>Externe lichtbron voor fluorescente excitatie</td></tr><tr><td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Dekglas (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Gel elektroforese apparaat I om grotere SDS-PAGE gel toe te passen</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent Technologies</td><td>-</td><td>Liquid chromatography systeem voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>De commercieel verkrijgbare 4%-12% Bis-Tris eiwit gels voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Confocale laser scanning microscoop (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>CCD camera</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Voor een waterafstotende barrière bij immunofluorescente kleuring</td></tr><tr><td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10 cm weefselkweekschaal</td></tr><tr><td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td><td>Junyi, China</td><td>JY-SCZ6+</td><td>Gel elektroforese apparaat II om grotere SDS-PAGE gel toe te passen (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro slides</td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CENP-A antibody</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Muis monoklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Muis monoklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-GFP antibody</td><td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td><td></td><td>Konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Ratten monoklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash;1-AP</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>anti-Ubiquitin</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Konijn polyklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Commercieel proteïne assay reagens I voor meting van proteïneconcentratie (compatibel met 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Disruptor hoorn voor sonicatie</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Microtip voor sonicatie</td></tr><tr><td>Buffer A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholaat; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-vrije protease inhibitor reagens</td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Complete EDTA-vrije protease inhibitor reagens voor buffer A1</td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>BBI Life Sciences</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>Coomassie blauw oplossing voor massaspectrometrie analyse</td></tr><tr><td>Crystal violet solution (2,3% crystal violet, 0,1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Voor koloniekleuring</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Voor nucleaire kleuring</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 Medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fetaal bovien serum)</td></tr><tr><td>High-glucose DMEM (Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>High-glucose DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfectiereagens I voor chemische transfectie</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfectiereagens II voor chemische transfectie</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fixatie reagens</td></tr><tr><td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td><td>

massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a) te identificeren

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Het bestuderen van de structuur en de dynamiek van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosomale instabiliteit (CIN) en kankerprogressie. Hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie is een fundamentele vraag. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren, wat suggereert dat alomtegenwoordigheid bij een andere lysine wordt veroorzaakt door de EYFP-tagging in het CENP-A K124R gemuteerd eiwit. Lysine 306 (K306) alomtegenwoordigheid in EYFP-CENP-A K124R werd met succes geïdentificeerd, wat overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrie analyse. Een voorbehoud wordt besproken in het gebruik van GFP /EYFP of het taggen van eiwit met een hoog moleculair gewicht als hulpmiddel om de functie van een eiwit te analyseren. Huidige technische limiet wordt ook besproken voor de detectie van alomquitylated banden, identificatie van site-specifieke alomtegenwoordigheid(en), en visualisatie van alomtegenwoordigheid in levende cellen of een specifieke eencellige cel tijdens de hele celcyclus.
De methode van massaspectrometrie analyse hier gepresenteerd kan worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore eiwitten. Deze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests / analyses kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid.

EYFP-CENP-A K124 mutant toont alomtegenwoordigheid, interactie met HJURP, en geen gebreken in centromere lokalisatie noch cel letaliteit. Hier werd het door Fachinetti et al. (2017)6 gemelde systeem opnieuw gevormd: in diploïde menselijke (RPE-1) cellen die er een droegen verstoord en één ''floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), werd EYFP-CENP-A uitgedrukt uit de pBabe-EYFP retrovirusvector. In dit systeem kan de expressie van endogene CENP-A uit het C...

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Deze methode maakt het mogelijk om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A eiwit te identificeren. Het kan ook worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tests en andere eiwitten. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat het kan worden gebruikt om EYFP CENP-A K124R alomtegenwoordige sites met een cruciale biologische betekenis te identificeren.Het zou kunnen worden uitgebreid om de post-translationele wijzigingen van een breed scala aan functionele eiwitten te onderzoeken. Begin met het bereiden van eiwit Een kralen gebonden met anti-GFP antilichaam. Was 25 microliter eiwit Een kralen per immunoprecipitatiereactie met buffer A1 ten minste drie keer om de ethanol te verwijderen.Maak dan een 50% kraal oplossing met buffer A1. Voeg twee microliter anti-GFP antilichaam toe aan de kralen. Voeg vervolgens buffer A1 toe tot 20 keer het netto kraalvolume. Voer end-to-end rotatie uit bij vier graden Celsius gedurende vier tot 18 uur.De optimale duur van de rotatie moet empirisch worden bepaald op basis van de efficiëntie van de immunoprecipitatie. Na de rotatie, centrifugeren de kralen op 100 keer g gedurende een minuut en verwijder de niet-gebonden supernatant. Voeg

mass-spectrometry-analysis-to-identify-ubiquitylation-eyfp-tagged

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe werkwijze die kwantitatieve analyse van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signalen is beschreven voor het bestuderen enzymkinetiek.

Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Hier beschrijven we protocollen om endogene en exogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te detecteren en deze eiwitniveaus op centromeren-kinetochoren te kwantificeren door indirecte immunofluorescente kleuring door het gebruik van fixatie (paraformaldehyde, aceton of methanol fixatie).

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer massaspectrometrieanalyse om ubiquitinering van EYFP-CENP-A te identificeren met behulp van immunoprecipitatie en eiwit-A parels. Deze methode onthult cruciale modificatiesites voor centromeerfunctie.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Meer video's verkennen