Name: Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer primaire trilharen detecteren in fibroblasten door immunofluorescentie en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van ciliaire functie en signalering in cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie van de Tsjechische Republiek - Langetermijnorganisatie ontwikkelingsplan Medische aspecten van massavernietigingswapens van de faculteit Militaire Gezondheidswetenschappen, Universiteit van Defensie; het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport, Tsjechië (Specifiek Onderzoeksproject nr: SV/ FVZ201703) en PROGRES Q40/06. Dank ook aan Daniel Diaz voor zijn vriendelijke hulp in het Engels taalrevisie.

1. Bereiding van cultuurmedia, oplossingen en gerechten
<ol><li>Autoclave de coverslips (22 x 22 mm). Bereid 6 goed platen. Dooi foetaal runderserum (FBS) en antibiotica penicilline/streptomycine en verwarmen het kweekmedium tot kamertemperatuur (RT). Gebruik trypsin-EDTA (0,25%) en 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium) om de cellen door te geven.</li>
	<li>Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) voor in dH2O (800 mg PFA in 20 mL dH2O). De PFA moet voor elk experiment vers worden bereid. Roer en verwarm de oplossing op 55 °C gedurende 30 minuten in de kap. Koel af bij RT. Voeg 1 M natriumhydroxide toe totdat de oplossing duidelijk wordt (pH = 7.2–7.4). Bewaar tot 1 week bij 4 °C. Opmerking: PFA is giftig; draag altijd voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen en bereid u voor in de chemische kap.</li>
	<li>Bereid 500 mL cultuurmedia, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 2% glutamine.</li>
	<li>Bereid 13 mL van 1% gelatineoplossing in steriele dH2O (130 mg gelatine in 13 mL dH2O). Gebruik 2 mL van 1% gelatine voor elke put in een 6 put plaat. Blijf steriel.</li>
	<li>Reinig de laminaire stroomkap met 70% ethanol. Plaats het benodigde materiaal in de laminaire stroomkap voordat u met het experiment begint.</li>
</ol>2. Celkweek voor immunocytochemie kleuring
<ol><li>Ontdooi de cellen (in deze studie C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) met behulp van standaardtechnieken en plaat ze in een T75 kolf aangevuld met ~ 10-12 mL van de voorbereide media. Incubeer bij 37 °C/5% CO2/90% relatieve vochtigheid (RH) tot de cellen 70% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Verwijder de cellen uit de couveuse en plaats ze in de laminaire stroomkap. Verwijder de kweekmedia en spoel de cellen kort 2x met 1x PBS. Voeg ~2 mL van 0,25% trypsin-EDTA toe aan de T75-kolf en incubeer bij 37 °C voor ~5 min. Controleer periodiek op de omgekeerde microscoop om celloslating te controleren. OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de cellijn en moet daarom empirisch worden bepaald.</li>
	<li>Voorzichtig resuspend de cellen in 10 mL van de cultuur media, pipetting zorgvuldig om een enkele cel suspensie te creëren. Spoel de kolf indien nodig opnieuw af.</li>
	<li>Plaats de celsuspensie in een conische buis van 50 mL en centrifuge gedurende 5 minuten op ~200 x g. Decanteer de supernatant, voeg 10 mL cultuurmedia toe en verbouw de pellet voorzichtig. Neem 20 μL van de celsuspensie en meng in een 1:1-verhouding met trypanblauw en tel in een cytometer volgens de standaardmethode.</li>
	<li>Plaats een coverslip in elke put van een 6 goed plaat met behulp van een pincet. Coat de coverslips met gelatine door het gieten ~2 mL in de putten. Dit zal helpen de cellen hechten aan de coverslips. Verwijder de gelatineoplossing en laat de lucht enkele minuten drogen. De coverslips zijn nu klaar voor de teelt van de cellen. Start de teelt onmiddellijk.</li>
	<li>Zaad 100.000 fibroblasten in elke put en voeg 2 mL van cultuur media. De cellen 24 uur uitbroeden bij 37 °C/5% CO2/90% RH. Op dit punt kunnen de cellen worden behandeld op basis van de behoeften van de gebruiker. Behandelingen om ciliatie te veroorzaken zijn eerder beschreven4,5. OPMERKING: Het initiële zaainummer is afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellen en moet dienovereenkomstig worden bepaald.</li>
</ol>3. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen in vitro
<ol><li>Verwarm de 4% paraformaldehyde tot RT. Bereid Pasteur pipetten, 1x PBS (RT), afvalcontainer, 15 mL conische buizen, micropipettes (0,5–10 μL, 20-200 μL en 100-1.000 μL) en tips. Neem de cellen uit de couveuse en leg ze in de bank. OPMERKING: De kleuringsprocedure hoeft niet in steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Alle oplossingen moeten bij RT zijn.</li>
	<li>Verwijder media uit elke put. Laat de hoezen in de put. Was de cellen 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Voeg met behulp van een Pasteur pipet 2 mL van 4% PFA toe in elke put om de cellen te fixeren. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de PFA en was 3x met 1x PBS. LET OP: Gebruik altijd een voldoende volume om het volledige dekvlak tijdens de incubatieperioden te dekken. Laat de cellen nooit drogen. Giet nooit een van de oplossingen direct op de coverslip.</li>
	<li>Bereid 0,5% Triton X-100 voor in 13 mL van 1x PBS 10 min voor gebruik. Voeg 2 mL in elke put. Incubeer gedurende 15 minuten. Was voorzichtig 4x met 1x PBS. OPMERKING: Triton X-100 is onoplosbaar in PBS bij RT. Verwarm de 0,5% Triton X-100 oplossing tot 37 °C in een waterbad om het op te lossen.</li>
	<li>Dooi geitenserum 5 min voor gebruik. Verdun het geitenserum in 1x PBS in een 1:20 verhouding als blokkerende oplossing. Voeg 150 μL toe aan elke coverslip en incubbate gedurende 20 minuten bij RT. LET OP: Verleng de blokkeringsperiode indien nodig tot 60 min. Was de cellen niet na het blokkeren met geitenserum.</li>
	<li>Ontdooi de primaire antilichamen (d.w.z. anti-acetylated alfa tubuline en anti-gamma tubuline) 5 min voor gebruik. Verdun de antilichamen afzonderlijk in 1x PBS als volgt: muis anti-acetylated alpha tubulin in een 1:800 verhouding en konijn anti-gamma tubuline in een verhouding van 1:300. Verwijder de blokkeringsoplossing. Niet wassen. Voeg 150 μL van beide antilichaamverdunningen toe aan de coverslips en incubeer gedurende 60 minuten bij RT. OPMERKING: Als het uitbroeden 's nachts 500-1.000 μL van de primaire antilichaamoplossingen gebruikt, sluit u de 6 putplaat af met paraffinefolie en bewaar u bij 4 °C. U ook 150 μL antilichaam gebruiken en incubeer in een vochtigheidskamer.</li>
	<li>Verwijder de primaire antilichamen. Was de covers 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Bereid de secundaire antilichamen in 1x PBS door afzonderlijk verdunnen Cy3 schapen anti-muis en Alexa Fluor488 geit anti-konijn in een 1:300 verhouding. Voeg 150 μL van beide secundaire antilichaamverdunningen toe aan de coverslips. Incubeer voor 45 minuten op RT in het donker. OPMERKING: Incubeer in het donker om fotobleaching te voorkomen. Andere combinaties van secundaire antilichamen kunnen naar behoefte worden gebruikt.</li>
	<li>Bereid een DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het overtollige aliquots op -20 °C. Verdun 10 μL uit een voorraad aliquot (1:5.000) in 50 mL van 1x PBS. Voeg 2 mL van deze verdunning toe aan de coverslips. Incubeer voor 5 minuten op RT in het donker. OPMERKING: Het is belangrijk om de cellen in het donker uit te broeden om fotobleekt te voorkomen. De DAPI verdunning kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Bereid 2 naalden, dia's, pincet en montagemedia. Label de dia's.</li>
	<li>Verwijder de DAPI-oplossing uit de putten. Was 3x met 1x PBS. Zet een druppel montagemedia op elke dia. Gebruik de naald om de coverslip voorzichtig van de bodem van de put te tillen. Draai de coverslip met behulp van de pincet en plaats het voorzichtig over de druppel montagemedia. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels.</li>
	<li>Bescherm de dia's tegen licht en bewaar ze 's nachts op 4 °C.</li>
	<li>Gebruik een fluorescerende of confocale microscoop met hoge vergroting om de primaire trilharen te visualiseren. LET OP: De dia's kunnen maximaal 2 maanden in het donker bij 4 °C worden bewaard.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende auteurs hebben diverse methoden beschreven voor de detectie van primaire trilharen, soms ook het beschrijven van verschillende fixatiemethoden die hun detectie kunnen beïnvloeden6,20,21,22. Hoe dan ook, het is moeilijk om een compleet en eenvoudig protocol voor detectie te vinden. De beschikbaarheid van een dergelijke methode zou ongetwijfeld van grote hulp zijn voor de studie van...

Primaire trilharen zijn zintuiglijke, solitaire, membraangebonden, niet-moge structuren geassocieerd met de moeder van de cel centriole. Primaire trilharen worden gevonden op de meeste gewervelde cellen, met uitzondering van rode bloedcellen, adipocyten1, en hepatocyten2. Primaire trilharen worden gevormd als een langwerpig axoneme samengesteld door microtubuli, waarvan de belangrijkste component α-tubuline is. De axoneme groeit uit het basale lichaam, dat is gestructureerd uit γ-tubuline. De lengte van de primaire trilharen varieert tussen 2-10 μm; de afmetingen kunnen echter veranderen tijdens glycyleratie, honger, hypoxie, cytotoxische stress of na blootstelling aan ioniserende straling3,4,5,6,7. Meestal hebben cellen slechts één primair cilium, dat betrokken is bij morfogenese en celsignaleringstrajecten die belangrijk zijn voor celproliferatie en differentiatie8,9.
Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen, en resorbed voordat ze mitose ingaan in een proces dat gepaard gaat met tubuline-deacetylatie bemiddeld door HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Het exacte moment van primaire cilia resorptie is afhankelijk van het celtype en de expressie van genen die direct betrokken zijn bij dit proces, zoals Aurora A, Plk1, TcTex-11111,12,13. Afhankelijk van het celtype, de primaire trilharen uitdrukken verschillende soorten receptoren, ionkanalen, en actieve signalering trajecten. Deze omvatten de belangrijkste signaleringreceptoren die proliferatie en overleving beïnvloeden, EGFR, PDGFR en FGFR. Ook inbegrepen zijn enkele van de signalering trajecten die de functie van een of meer organen kunnen beïnvloeden, met inbegrip van Hedgehog, Notch, en Wnt. Dankzij deze receptoren en signalering trajecten, de primaire trilharen ook een chemosensorische functie uit te voeren. Deze functie maakt het mogelijk primaire trilharen om specifieke liganden voor Notch, hormonen, en biologisch actieve stoffen zoals serotonine of somatostatine detecteren. Andere specifieke functies tentoongesteld door primaire trilharen van verschillende lengtes zijn reactie op veranderingen in temperatuur, zwaartekracht en osmolaliteit14.
Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd door middel van verschillende methoden, zoals live visualisatie, transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of door software voor de automatische detectie van primaire trilharen5,,15,,16,17. Echter, deze methoden zijn zeer gespecialiseerd en voortdurend onderzoek moet fundamentele, snelle en eenvoudige methoden voor het beitsen van primaire trilharen in elke fase van het onderzoek. Beschreven is een eenvoudige en nuttige methode voor de detectie van primaire trilharen in gekweekte cellen.

<table><tbody><tr><td>6-well plate</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Afmetingen 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG</td></tr><tr><td>Anti-Tubulin &gamma;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Polyklonaal Konijn anti-Muis IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (muis)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-Muis IgG (heel molecuul) F(ab&prime;)2 fragment&ndash;Cy3 antilichaam geproduceerd in schapen</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s Gemodificeerd Eagle-medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Hoge glucose, Geen glutamine, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Fosfaat Gebufferde Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Met MgCl2 en CaCl2, Sterile-gefilterd, Geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>Sterile-gefilterd, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Muis embryonale fibroblast</td></tr><tr><td>Monoklonaal Anti-Acetylerd Tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Monoklonaal Anti-Acetylerd Tubuline antilichaam geproduceerd in muis</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Primaire longfibroblasten (mens)</td></tr><tr><td>Normaal Geitenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>10.000 eenheden penicilline en 10 mg streptomycine per mL in 0,9% NaCl, Sterile-gefilterd</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Huidfibroblasten</td><td>Vriendelijk geschonken van Charles University, Faculteit Geneeskunde in Hradec Králové.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vierkante Dekglasjes</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>Borosilicaat glas, 22x22mm, Vierkant</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Sterile-gefilterd, Gibco</td></tr></tbody></table>

eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen van de celcyclus, die opnieuw worden bedhuisig vóór mitose. Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd met zeer geavanceerde methoden, waaronder transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of met behulp van software voor de automatische detectie van primaire trilharen. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is echter nodig om deze methoden uit te voeren. Deze publicatie beschrijft een protocol voor de eenvoudige detectie van primaire trilharen in vitro door het beitsen van geacetyleerde alfa tubuline (axoneme) en gamma tubuline (basaal lichaam). Dit immunofluorescente kleuringsprotocol is relatief eenvoudig en resulteert in beelden van hoge kwaliteit. Het huidige protocol beschrijft hoe vier cellijnen (C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) die primaire trilharen uitdrukken, werden vastgesteld, immunostained en afgebeeld met een fluorescerende of confocale microscoop.

De immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van hoge kwaliteit. In deze experimenten werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, in een fluorescerende of confocale microscoop in beeld gebracht volgens het hierboven beschreven protocol. Het primaire cilium werd gedetecteerd met behulp van acetylated α-tubuline en γ-tubuline. De evaluatie van primaire trilharen kan op verschillende niveaus worden uitgevoerd en elke verandering in dit verban...

Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Dit protocol zorgt voor een snelle en eenvoudige detectie van primaire trilharen in gekweekte cellen, binnen een verscheidenheid van onderzoek inspanningen. De methode kan worden gebruikt in wanorde die de basale lichamen van primaire trilharen beïnvloeden. Deze procedure kan ook worden toegepast voor het bevlekken primaire trilharen in paraffine ingebed weefsel of voor andere experimenten waar fluorescentie nodig is.Begin met autoclaving 22 bij 22 millimeter afdek slips, en de voorbereiding van materialen voor het experiment. Ontdooi FBS en penicilline streptomycine, en warm de cultuur medium tot kamertemperatuur. Doorsnee de cellen met trypsine EDTA en PBS.Bereid verse 4% paraformaldehyde, cultuur medium, en 1%gelatine oplossing, volgens manuscript richtingen. Reinig vervolgens de laminaire stroomkap met 70% ethanol en plaats alle benodigde materialen erin. Paraformaldehyde is uiterst gevaarlijk.Goede PPE moet te allen tijde worden gedragen, en het mag alleen worden behandeld in een chemische kap. Na het kweken van de gewenste cellen tot 70% samenvloeiing verwijder ze uit de incubator, en plaats ze in de laminaire stroomkap. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen twee keer af met PBS.Voeg ongeveer twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA toe aan de kweekfles en broed het vijf minuten lang uit met 37 graden Celsius. Controleer de cellen periodiek op de omgekeerde microscoop om de onthechting te controleren. Wanneer de cellen hebben losgemaakt zachtjes resuspend ze in 10 milliliter van cultuur medium, pipetting zorgvuldig om een enkele cel suspensie te creëren.Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 50 milliliter en vercentrifugeer het op 200 keer G'gedurende vijf minuten. Decanteer de supernatant voeg vervolgens 10 milliliter cultuurmedium toe en zet de pellet voorzichtig opnieuw op te hangen. Neem 20 microliter van de celsuspensie en meng deze met trypanblauw met een volumeverhouding van één op één.Tel vervolgens de cellen met behulp van standaard hemocytometrie. Plaats een deksel slip in elke put van een zes put plaat, en de vacht van de cover slip met twee milliliter van de gelatine oplossing, die zal helpen de cellen aan de cover slip. Verwijder de gelatine en laat de plaat enkele minuten luchtdrogen.Zaad 100.000 fibroblasten in elke put en voeg twee milliliter cultuurmedium toe. Dan incubeer de cellen voor 24 uur op 37 graden Celsius, vijf procent kooldioxide, en 90% relatieve vochtigheid. Na de incubatie behandelen de cellen om ciliatie te induceren.Verwarm de 4%paraformaldehyde op kamertemperatuur en bereid een weilandpipets, ABS, een afvalcontainer, 15 milliliter conische buizen, micropipettes en tips. Neem de cellen uit de couveuse en leg ze op de labbank. Verwijder de media uit elke put, waardoor de cover slip.Was de cellen voorzichtig drie keer met twee milliliter PBS. Voeg vervolgens twee milliliter van de 4%PFA in elke put om de cellen vast te stellen. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijder vervolgens de PFA en herhaal de wasbeurten met PBS.Voeg twee milliliter van 0,5% Triton X-100 aan elke put, en broeden de plaat gedurende 15 minuten. Was vervolgens de putten vier keer met PBS. Om de blokkerende oplossing te maken, ontdooit u een geitenserum gedurende vijf minuten en verdunt u het in PBS met een verhouding van één tot 20.Voeg 150 microliter van deze oplossing toe aan elke afdeksel en ontcubeer de plaat gedurende 20 minuten. Ontdooi de primaire antilichamen gedurende vijf minuten en verdun ze afzonderlijk in PBS, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verwijder de blokkeeroplossing uit de afdekbons en voeg 150 microliter van beide antilichaamoplossingen toe.Vervolgens de plaat 60 minuten incubeer maken bij kamertemperatuur. Verwijder de primaire antilichamen en was de afdekking voorzichtig drie keer met twee milliliter PBS. Verdun Cy3 Sheep Anti-Mouse en Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit in PBS, met een verhouding van één tot 300, en voeg 150 microliters van beide secundaire antilichaamoplossingen toe aan de cover slip.Bereid een werkende DAPI-oplossing door verdunnen 10 microliter van de voorraad in 50 milliliter PBS, en voeg twee milliliter van deze verdunning aan de cover slips. Broed de plaat vijf minuten in het donker, bij kamertemperatuur. Voordat u de afdekking op de dia's plaatst, bereidt u twee naalden, een pincet en bevestigingsmedia en labelt u alle dia's.Haal de DAPI-oplossing uit de putten en was ze drie keer met PBS. Zet een druppel montagemedia op elke dia. Gebruik de naald om de afdeksel voorzichtig van de bodem van de put op te tillen.Draai het vervolgens om en plaats het voorzichtig over de druppel montagemedia met behulp van de pincet. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels. Bescherm de dia's tegen licht en bewaar ze 's nachts op vier graden Celsius.Gebruik de volgende dag een fluorescerende of confocale microscoop met een hoge vergroting om de primaire trilharen te visualiseren. Dit protocol werd gebruikt om immunostain vast te stellen, en beeld verschillende cellijnen uitdrukken primaire trilharen. Wanneer muis myoblasten werden blootgesteld aan ioniserende straling bij verschillende doses, bleek dat hogere doses het verschijnen van meerdere primaire trilharen induceren.Terwijl lage doses resulteerde in het verschijnen van enkele primaire trilharen. Evenzo, wanneer menselijke longfibroblasten werden uitgestraald bij een lage dosis, werden enkele primaire trilharen gedetecteerd door immunofluorescentie. Een toename van primaire trilharen werd waargenomen bij embryonale fibroblasten van muizen die uitgehongerd waren, waaruit bleek dat metabole stress de incidenten van primaire trilharen beïnvloedt.Wanneer huidfibroblasten werden behandeld met 120 nanomolar doxorubicine, ze uitgedrukt een enkele primaire cilium. Hogere doses veroorzaken het verschijnen van meerdere primaire trilharen. Fibroblasten behandeld met 1,25 nanomolar Taxol ook uitgedrukt een enkele primaire cilium.Maar meerdere trilharen werden niet gedetecteerd na behandeling met hogere doses. Bij het openen van dit protocol zorg ervoor dat alle PPE regelgeving te volgen. Houd in gedachten de cultuur behoeften van uw cel lijn van keuze en koos uw antilichamen zorgvuldig.Deze procedure kan niet direct worden gevolgd door andere procedures, omdat de cellen onherstelbaar zijn. In plaats daarvan moeten parallelle experimenten worden geprogrammeerd.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

Hier presenteren we een protocol gebaseerd op immunohistochemische detectie van het c-FOS-eiwit, een klassieke techniek die wordt gebruikt voor de identificatie van neuronale populaties die betrokken zijn bij specifieke fysiologische reacties in vivo en ex vivo.

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.

High-speed videomicroscopie-analyse voor eerstelijnsdiagnose van primaire ciliaire dyskinesie

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Laminopathiestoornissen leiden vaak tot veranderingen in de nucleaire envelop, wat nucleaire blebbing en lekkage kan veroorzaken. Deze studie presenteert een immunofluorescentiemethode om de nucleaire lamina samen met dubbelstrengs DNA (dsDNA) te visualiseren, wat een middel biedt om de nucleaire structuur en integriteit in zoogdiercellen te beoordelen.

Detectie van nucleaire bloedingen en DNA-lekkage in zoogdiercellen door immunofluorescentie

Leer primaire trilharen detecteren in fibroblasten door immunofluorescentie en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van ciliaire functie en signalering in cellen.

Eenvoudige detectie van primaire trilharen door immunofluorescentie

Meer video's verkennen