Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Dit protocol werkt met monsters van menselijke en dierlijke harten, zelfs na uren transporttijd. Tot 200 myocyten per milligram kunnen worden geïsoleerd uit vibratome-cut weefsel plakjes. Elektrofysiologische, structurele en biochemische analyse van cardiomyocyten, helpt bij het ontdekken en beter begrijpen, mechanismen van hart-en vaatziekten.

Na het vullen van een 100 millimeter weefsel kweekschotel, met 20 milliliter koude snijden oplossing, plaats het weefsel monster in de cultuur schotel. Houd de kweekschotel op een bord gekoeld tot 4 graden Celsius. Houd er rekening mee dat levende weefselmonsters van dieren en vooral mensen potentieel besmettelijk zijn.

Gebruik een schaar of scalpel, om overtollig fibrotisch weefsel en epicardiaal vet uit het monster te verwijderen. Voor een optimale vibratome verwerking van grotere weefselmonsters, gebruik de scalpel om acht millimeter blokjes uit het weefsel te snijden. Voor kleinere monsters van biopten is dit niet nodig.

Men kan het epicardium identificeren aan de epicardiale vetlaag. Na het verwijderen van overtollig vet, plaats het weefsel blok, in de schotel, met de epicardium naar beneden. Ter voorbereiding van weefsel inbedding, kook 400 milligram van laag smeltpunt agarose in tien milliliter van snijden oplossing.

Vul een spuit van tien milliliter met de hete opgeloste agarosegel. Verzegel de spuit en plaats deze gedurende ten minste 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius, zodat de agarose in evenwicht kan komen. Met behulp van tangen, verplaats de trim specimen in een schone 35 millimeter weefsel cultuur schotel, met de epicardium naar beneden gericht.

Verwijder vervolgens overtollig vocht uit het monster, met een steriel uitstrijkje. Zet het monster tegen beweging, door het met tangen vast te houden. En leeg de spuit van agarose over de top van het, ervoor te zorgen dat volledig onder te dompelen het monster.

Onmiddellijk geplaatst de schotel op ijs en laat de agarose stollen voor 10 minuten. Monteer een ongebruikt scheermesje op de meshouder van het vibratome. Kalibreer indien mogelijk het vibratome door de Z-afbuiging van het blad aan te passen.

Gebruik een scalpel om een agarose weefselblok dat past bij het monster houder van het vibratome accijns. Om de stabiliteit te garanderen, moet u ervoor zorgen dat het weefsel nog voldoende is ondergedompeld in agarose. Met agarose marges, van minstens acht millimeter.

Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op de monsterhouder. En druk voorzichtig op de agarose weefsel blok, op de houder. Bouw een vibratome bad, met snijoplossing.

Vul vervolgens de buitenste koeltank van het vibratome met gemalen ijs, om een temperatuur van vier tot zes graden Celsius te behouden, gedurende het hele snijproces. Plaats de monsterhouder, die het agaroseweefselblok bevat, in het vibratomebad. Met behulp van de vibratome-instellingen beschreven in het manuscript, genereren 300 microliter dikke plakjes.

Het is cruciaal om secties in parallel epicardium te maken, omdat dit is hoe cardiomyocyte vezels zijn uitgelijnd in de ventriculaire wand. Anders zal er te veel schade zijn. Gebruik een standaard lichtmicroscoop, om de uitlijning van de cardiomyocyten en de weefselschijfjes te controleren.

Om te voorkomen dat het weefsel beschadigt, houdt u de agarose vast, in plaats van het weefsel zelf. Een cardiomyocytevezels, zouden uniform moeten worden uitgelijnd en de myocyten, zouden niet moeten worden gecontracteerd. Plaats een warmteplaat op de lab shaker en verwarm deze tot 37 graden Celsius.

Start de lab shaker bij 65 RPM. Los de proteinase op in twee milliliter oplossing één. En los de collagenase op, in twee milliliter oplossing één.

Maar meng de proteinase en de collagenase niet. Voeg calciumchloride toe aan de collagenaseoplossing, voor een uiteindelijke concentratie, van vijf micromolar. Broed beide oplossingen uit op 37 graden Celsius.

Gebruik tangen om een weefselschijf over te brengen naar een schone 60 millimeter weefselkweekschotel. Met vijf millimeter voorgekoelde snijoplossing. Houd de schotel op ijs of een koude plaat, verwijder voorzichtig de agarose uit het weefsel, met behulp van een mes of tangen.

Om de eerste wasbeurt van de weefselschijfjes uit te voeren, plaatst u een schone 35 millimeter weefselkweekschotel op het warmteblad. En vul het, met twee millimeter voorverwarmde oplossing één. Breng een of twee plakjes weefsel naar de bereide schotel.

Gebruik dan een een millimeter pipet, voor de wasstappen. Na het wassen van de plakjes, verwijder oplossing een uit de schotel en voeg twee milliliter van de proteinase oplossing. Incubeer de plakjes gedurende 12 minuten op het warmteblad, met de shaker bij 65 RPM.

Was de weefselschijfjes nog twee keer, met twee milliliter voorverwarmde oplossing één. Verwijder vervolgens oplossing een uit de schotel en voeg twee milliliter collagenase oplossing. Incubeer de plakjes gedurende ten minste 30 minuten op het warmteblad, met schudden bij 65 RPM.

Controleer na 15 minuten incubatie op gratis individuele myocyten door de schotel onder een lichtmicroscoop te onderzoeken. Blijf elke vijf minuten controleren, totdat individuele myocyten zichtbaar zijn. Dan, alt spijsvertering door het wassen van de plakjes tweemaal, met twee milliliter van voorverwarmde oplossing twee.

En vul de schotel, met twee milliliter oplossing twee. Trek voorzichtig de vezels van het weefsel slice uit elkaar, met behulp van fijne tangen. Blijf voorzichtig werken, om te voorkomen dat de cardiomyocyten beschadigd.

En pipet meerdere malen, met een eenmalig gebruik langs uw pipet. Bevestig vervolgens dat de staafvormige cardiomyocyten zijn gescheiden, door de schotel onder een lichte microscoop te onderzoeken. Plaats de schotel terug op de warmteplaat op 37 graden Celsius en roer door te schudden.

Door 10 millimolar en 100 millimolar calciumchloridebestandsoplossingen toe te voegen, verhoogt u langzaam de calciumconcentratie van de weefselsuspensie van vijf micromolar naar 1,5 millimolar. Wanneer de calciumverhoging is voltooid, gebruik tangen om de resterende onverteerd weefselbrokken te verwijderen. Stop eerst de agitatie van de suspensie.

Verwijder vervolgens met behulp van een pipet van 1000 microliter 1/3 van de oplossing langzaam van de bovenkant van de ophanging. Vermijd aspiratie van de cardiomyocyten. Voeg vervolgens 700 microliter van oplossing drie toe aan de cellen.

Herhaal deze wasstappen na 10 minuten van de agitatie. Breng de ophanging over op een centrifugebuis van 15 milliliter. En laat de cardiomyocyten sedimenten op kamertemperatuur, voor een minimum van 10 minuten en een maximum van 30 minuten.

Verwijder de supernatant volledig. En resuspend de pellet in gemodificeerde tyrode oplossing of de gewenste experimenteerbuffer. Controleer met behulp van een lichtmicroscoop de celkwaliteit.

30 tot 50% van de cardiomyocyten moet staafvormig zijn, glad zonder membraansingslingen. En display, duidelijke kruisstrepteringen. Om isolatie-efficiëntie te verifiëren, werd het protocol toegepast op rat myocardium.

En vergeleken met isolatie via coronaire perfusie en isolatie, van kleine stukjes weefsel. Een lager percentage staafvormige cellen werd waargenomen bij het gebruik van het protocol, daarna na isolatie door perfusie. Maar het totale aantal was nog steeds hoog.

Isolatie van weefselbrokken daarentegen leverde minder staafvormige cellen op. Flow cytometrie, werd gebruikt om de resultaten kwantitatief te vergelijken. De isolatie van cardiomyocyten uit weefselschijfjes, bereikt niet de opbrengst verkregen door coronaire perfusie.

Maar biedt, aanzienlijk hogere opbrengsten dan myocyte isolatie, van weefsel brokken. Vervolgens werd het protocol toegepast op menselijk myocardium. Isolatie van myocards, leverde Hyde nummers en een groot deel van de staaf gevormde menselijke myocyten.

En slechts een klein deel van de afgeronde cardiomyocyten. Isolatie van myocards, resulteerde in een opvallend hoger aantal staafvormige myocyten, dan isolatie van weefselbrokken. Fotometrische kwantificering bevestigde een aanzienlijk hogere myocyte levensvatbaarheid na isolatie van myocardale plakjes.

Menselijke cellen, geïsoleerd met het beschreven protocol, kunnen worden onderworpen aan structurele analyse. Alpha actinine vlekken, bleek een dichte reguliere Z lijn patroon en een gemiddelde sarcomere lengte van 1,92 micrometer, in rustende cardiomyocyten. LTCC en RyR kleuring, toonde duidelijke cluster is co-gelokaliseerd in de buurt van het celmembraan en T-tubuli.

De geïsoleerde cardiomyocyten waren prikkelbaar en konden worden gebruikt voor studies over cellulaire elektrofysiologie of excitatiecontractiekoppeling. Actie potentiële vorm en duur, was in het bereik gemeld door anderen, voor ventriculaire cardiomyocyten, van falende menselijke harten. De calcium voorbijgaande stoffen opgenomen door Khan vocale lijn scannen, toonde een duidelijke upstroke na stimulatie.

En, een aanvaardbaar signaal naar ruis verhouding. Cardiomyocyte verkorting door samentrekking kan worden gezien van de afbuiging van de onderste celrand. Vanwege het hoge aantal isolatoren cardiomyocyten verkregen door dit protocol, celcultuur is mogelijk.

Dit kan genoverdracht, farmacologische tests en weefselmanipulatie van menselijke cardiomyocyten mogelijk maken. Een belangrijke toepassing, is de verificatie van bevindingen, van dierlijke modellen in menselijke cellen. Hartfalen is een klinisch syndroom met zeer beperkte therapeutische opties.

Verbeterde cardiomyocyte isolatie technieken zal helpen om cellulaire doelen voor diagnose en toekomstige therapieën te identificeren.