Name: Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Ontdek hoe dubbelstrengig RNA in huisstofmijten de eosinofiele longontsteking moduleert in muismodellen. Deze methode helpt onderzoekers de immunogene eigenschappen van allergenen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken mevrouw Karla Gorena voor technische bijstand bij stroomcytometrie. L.S. wordt ondersteund door de China Scholarship Council en Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. wordt ondersteund door de afdeling Klinische Laboratoriumwetenschappen, Hogeschool voor Toegepaste Medische Wetenschappen, Jouf University, Sakaka, Saoedi-Arabië. X.D.L. wordt ondersteund door het UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund en het Max en Minnei Voelcker Fund.

Experimentele procedures hier beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas Health San Antonio.
1. Dot blot om de aanwezigheid van dsRNA structuren in HDM totale RNA aan te tonen
<ol><li>Totale RNA-isolatie van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen<ol>
<li>Zet HDM, insecten, of niet-insecten dieren levend verzameld of commercieel verkregen in 50 mL buizen, en snel bevriezen met vloeistof-N2. Bewaar vervolgens bij -70 °C voor de daaropvolgende totale RNA-isolatie. OPMERKING: In dit experiment werden HDM-, insecten- en niet-insectendieren geselecteerd omdat ze bekend staan als veel voorkomende bronnen van allergenen. Verder blijft een immunostimulaatfunctie van hun RNA's onduidelijk.</li>
		<li>Breng een behoorlijke hoeveelheid (gelijk aan 100 μL in volume of minder) HDM, insecten of niet-insecten dieren opgeslagen bij -70 °C over in een buis van 2 mL met kralen (1,4 mm keramische bollen) en vries buizen in een vloeibare-N2-container voor ~ 10 min.</li>
		<li>Voeg voor de totale RNA-isolatie 1 mL guanidinium thiocyanaat-gebaseerde RNA-isolatiereagens24 toe aan elke buis en breek vervolgens de kleine insecten en niet-insecten met een hoogenergetische celverstoorder met de maximale snelheid van 45 s en koel op ijs. Herhaal deze stap twee keer.</li>
		<li>Breng de oplossing van stap 1.1.3 over in een nieuwe buis van 1,5 mL en voeg 200 μL chloroform toe aan elke buis en vortex. Centrifugebuizen bij 14.000 x g gedurende 14 min bij 4 °C.</li>
		<li>Zodra de centrifugatie is voltooid, breng je de bovenste waterige fase (200 μL) over in een nieuwe 1,5 mL buis met 500 μL isopropanol om RNA-pellet neer te zetten. Verstoor de interfase niet. De aanbevolen volumeverhouding van de bovenste fase versus isopropanol is 1:2,5 verhouding.</li>
		<li>Meng door zachte vortexing, dan centrifuge buizen op 14.000 x g gedurende 14 min bij 4 °C.</li>
		<li>Spoel de supernatant voorzichtig aan en was vervolgens de RNA-pellet met 500 μL van 75% ethanol en centrifuge bij 7.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder alle vloeistof voorzichtig, droog de pellet aan de lucht en los de RNA-pellet op met 20-50 μL RNase-vrije H2O.</li>
		<li>Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer met behulp van de volgende parameters:<ol>
<li>Open de bijbehorende software en selecteer het type nucleïnezuren om te meten. Wijzig het voorbeeldtype in RNA.</li>
			<li>Voer de blanco meting uit met 1-2 μL RNase-vrij H2O. Veeg de RNase-vrije H2O af. Nu is het instrument klaar voor de meting.</li>
			<li>Laad 1-2 μL van het RNA-monster en meet de RNA-concentratie (μg/μL). OPMERKING: De verhouding van de absorptie op 260 en 280 nm (A260/280) bij ~2.0 (1.9-2.2) wordt algemeen aanvaard als "zuiver" voor RNA. Als u niet onmiddellijk wordt verwerkt, slaat u RNA-monsters op -70 °C op en vermijdt u de vriesdooicycli om het RNA intact te houden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van dsRNA-structuur in het totale RNA met dsRNA-specifieke J2-antilichamen<ol>
<li>Bereid twee 20 μL RNA-monsters (200 ng/μL) voor. Een met RNase-III behandeling (1 μL voor 1 μg RNA, incubaat bij 37 °C gedurende 60 minuten), en de andere zonder RNase-III behandeling. OPMERKING: RNase III wordt hier gebruikt om dsRNA specifiek te degraderen, maar niet enkelstrengsRNA 25.</li>
		<li>Gebruik een potlood om rasters te tekenen waar RNA-monsters op het membraan worden uitgewist.</li>
		<li>Spot 2 μL van de 200 ng/μL van het RNA monster op het positief geladen nylon membraan.</li>
		<li>Crosslink de monsters aan het membraan bij 1.200 microjoule x 100 in een UV-crosslinker. Herhaal stap 1.2.3 en 1.2.4 nog twee keer op de plek van het monster. Dit resulteert in een totaal van 0,8 μg per vlek. OPMERKING: Spot niet meer dan 2 μL RNA-monster op het membraan tegelijk.</li>
		<li>Blokkeer niet-specifieke binding met 5% melk in TBS-T voor 1 uur met schudden bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende oplossing uit stap 1.2.5 en voeg het anti-dsRNA J2-antilichaam toe bij de verdunning van 1:1.000 in 1% melk in TBS-T en incubbate 's nachts met schudden bij 4 °C.</li>
		<li>Was het membraan met TBS-T gedurende 5 minuten en herhaal deze stap 3 keer. Voeg het secundaire antilichaam (Alkaline fosphatase-conjugated Anti-Mouse IgG verdund in 1% melk 1:5.000) en incubeer gedurende 1 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Was het membraan met TBS-T gedurende 5 minuten en herhaal deze stap voor 3x.</li>
		<li>Voeg het substraat (BCIP/NBT) toe en broed gedurende 5-15 min tot een gewenst signaal zichtbaar is.</li>
		<li>Stop de reactie door het membraan te spoelen met ddH2O.</li>
		<li>Droog het membraan op tissuepapieren en maak een foto met een smartphone (een representatief resultaat wordt weergegeven in figuur 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. RT-qPCR om het vermogen van HDM totaal RNA te meten bij het stimuleren van de long-ISGs-expressie
<ol><li>RNA isolatie van muizen longweefsels OPMERKING: Muizen (vrouw, 8-12 weken oud, C57BL/6J) werden gehandhaafd onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden.<ol>
<li>Verdoven het dier kort met isofluraan en toedien via de intratracheale instillatie met 5 μg (verdund in 80 μL PBS) HDM RNAs behandeld met of zonder RNase III.</li>
		<li>Na 16-18 uur na hdm RNA behandeling, offer de muis door CO2 inademing voor een paar minuten. Plaats vervolgens de muis op een platform en speld ledematen met naalden.</li>
		<li>Desinfecteer de muis met 70% ethanol en snijd de huid vanaf de buik naar de nek met een gesteriliseerde schaar.</li>
		<li>Bevestig de huid met naalden en snijd de ribben om de longen bloot te leggen. Verwijder de hele longen en was ze met koude PBS. Plaats de longen op tissuepapier en verdeel een klein stukje van elke longkwab in een buis van 2 mL met kralen (200-300 μL in volume, 1,4 mm keramische bollen). OPMERKING: Het doel van het gebruik van keramische kralen is het malen van hele longweefsels</li>
		<li>Vries de longmonsters door het plaatsen van buizen in een vloeistof-N2 container voor ~ 10 min.</li>
		<li>Voeg 500 μL guanidinium thiocyanaatgebaseerd RNA-isolatiereagens toe aan elke buis en breek de longweefsels met een homogenisator voor 45 s. Chill tussen elke stap op ijs. Herhaal deze stap twee keer.</li>
		<li>Volg de stappen 1.1.4- 1.1.7 voor longRNA isolatie.</li>
		<li>Droog de pellet aan en los de RNA-pellet op met de juiste hoeveelheid RNase-vrije H2O (~20-30 μL).</li>
		<li>Meet de RNA-concentratie zoals beschreven in stap 1.1.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT-qPCR om het vermogen van HDM RNA te bepalen bij het stimuleren van longgenexpressie.<ol>
<li>Met behulp van 100 ng/μL RNA uit longweefsels als sjabloon voert u de cDNA-synthese uit volgens het genoemde protocol26.</li>
		<li>Stel een RT-qPCR-reactie op 10 μL/put voor een 384-put plaat met behulp van cDNA gegenereerd boven en de gen-specifieke primer paren (Tabel 1 en Tabel 2).</li>
		<li>Sluit de putten goed af met een transparante kleeffolie en draai de plaat voor 30 s. Draai de plaat op 1.000 x g voor 30 s om monsters te verzamelen aan de onderkant van de putten.</li>
		<li>Laad de plaat op een RT-qPCR-machine en begin met het uitvoeren van de RT-qPCR-reactie met behulp van het thermische cycler-protocol(tabel 3).</li>
		<li>Exporteer de resultaten in een spreadsheetbestand of analyseer de gegevens met behulp van de software die door de productie wordt geleverd nadat het programma is voltooid (een representatief resultaat wordt weergegeven in figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FACS-analyse om de effecten van HDM RNA op de infiltratie van eosinofielen in BAL en longen te bepalen
<ol><li>BAL vloeistofopvang voor FACS-analyse<ol>
<li>Euthanaseer muizen (vrouwelijk, 8-12 weken oud, C57BL/6J) die werden behandeld met HDM allergeen extracten (volgens het experimentele ontwerp getoond in figuur 3B) door CO2 inademing.</li>
		<li>Plaats de muis op een platform en speld ledematen met naalden.</li>
		<li>Desinfecteer de muis met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de huid te snijden van het bovenste gebied van de buik naar de nek.</li>
		<li>Voorzichtig, trek de speekselklieren en de sternohyoid spier zorgvuldig uit elkaar met behulp van de tangen om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats een nylon string (~ 10 cm) onder de luchtpijp met behulp van tangen.</li>
		<li>Maak een incisie in de luchtpijp (~ 2 mm onder het strottenhoofd) net genoeg om een canule in te voegen. Snij niet door de luchtpijp. Knoop de string rond luchtpijp en canule.</li>
		<li>Laad de spuit met 1 mL PBS+EDTA en bevestig deze aan het einde van de canule. Injecteer 1 mL PBS+EDTA in de long en draag de oplossing volledig aan. Maak de spuit voorzichtig los van de canule en breng de oplossing over in een buis van 15 mL op ijs.</li>
		<li>Herlaad de spuit met de verse PBS+EDTA en herhaal deze stap 2x.</li>
		<li>Centrifugeren de buis met de gepoolde BAL verkregen in stap 3.1.7 om de cellen op 500 x g gedurende 7 min bij 4 °C te pelleteren. Neem het volume bal-vloeistof op en breng de supernatant over naar twee 1,5 mL-buizen zonder de pellet te storen. OPMERKING: De supernatant van BAL kan worden opgeslagen bij -70 °C voor toekomstige analyse, bijvoorbeeld ELISA.</li>
		<li>In het geval dat er RBC's aanwezig zijn in de pellet als gevolg van ernstige longontsteking, voeg na het verwijderen van de supernatant 500 μL RBC lyse buffer toe en meng goed door resuspensie. Breng de oplossing over in een nieuwe buis van 1,5 mL en centrifuge gedurende 7 minuten met een snelheid van 500 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 150 μL facs buffer.</li>
		<li>Breng de 150 μL van het opnieuw opgetrokken monster in 96-putplaat en centrifuge de plaat gedurende 7 minuten met een snelheid van 500 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Snel, omkeren van de plaat op weefselpapier om de cellen die zich op de bodem van de putten te verzamelen.</li>
		<li>Bevlek de cellen met antilichamen in FACS-buffer in aanwezigheid van 2,4G2-blokkerend antilichaam (2,5 μg / 100 μL). Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een donkere plaats.</li>
		<li>Na het bevlekken, centrifugeren de plaat om de cellen pellet op 500 x g gedurende 7 min bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder de kleuroplossing door de plaat op tissuepapier om te keren en vervolgens te wassen door opnieuw uit te geven met 100 μL FACS-buffer. Vervolgens u de plaat opnieuw centrifugeren op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C en de FACS-buffer verwijderen door de plaat op tissuepapier om te keren.</li>
		<li>Resuspend monsters in 150 μL facs buffer en breng monsters naar de FACS buizen met 350 μL FACS buffer. Voeg 25 μL telkralen toe aan elk monster. Monsters zijn nu klaar voor flow cytometrie analyse. OPMERKING: Verschillende celtypen in BAL-vloeistof werden aangeduid met antilichamen. Telkralen zijn toegevoegd voordat de FACS werd uitgevoerd. Flow cytometriegegevens werden geanalyseerd met behulp van een commercieel beschikbare software. Zie figuur 3 en tabel 4 voor de gatingstrategie.</li>
	</ol></li>
	<li>Spijsvertering van longweefsel voor de FACS-analyse<ol>
<li>Volg de stappen 3.1.1 - 3.1.3.</li>
		<li>Snijd de huid vanaf de buik naar de nek met een gesteriliseerde schaar. Bevestig de huid met naalden en snijd de ribben om de longen bloot te leggen.</li>
		<li>Verwijder de hele longen en was ze met koude PBS. Plaats monsters in de 1,5 mL buis met 50 μL longverteringsoplossing.</li>
		<li>Hak de longweefsels in kleine stukjes met een gebogen schaar. Breng de longweefsels in een 6-well plaat, voeg dan 8 mL long spijsvertering oplossing. Leg de plaat 45 minuten op een shaker in een couveuse van 37 °C.</li>
		<li>Gebruik na incubatie de bovenkant van 1,5 mL buis om de longweefsels te malen. Plaats een 70 μm strainers op een nieuwe 6-well plaat en breng het monster aan via een filter van 0,22 μm.</li>
		<li>Breng de gefilterde oplossing in een buis van 15 mL en centrifugeer de buizen vervolgens op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Aspirate de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van RBC lysis buffer en laat het op ijs voor 3 min.</li>
		<li>Breng het monster in een buis van 1,5 mL en centrifuge op 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Herhaal 2x</li>
		<li>Was de longcellen 2x met 1 mL FACS buffer. Aspirate de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL van FACS buffer, en vervolgens overdracht 100 μL van het monster in 96 put plaat.</li>
		<li>Centrifugeren de plaat gedurende 7 minuten bij een snelheid van 500 x g bij 4 °C. Volg de stappen beschreven in BAL vloeistofverzameling voor FACS-analyse (3.1.13 tot 3.1.16) om de cellen van verteerde longweefselmonsters te bevlekken. OPMERKING: Eosinofielen in de longen werden gelabeld met antilichamen zoals aangegeven, vervolgens gemengd met het tellen van kralen voor verdere FACS-analyse. Flow cytometrie gegevens werden geanalyseerd met behulp van bijbehorende software. Raadpleeg figuur 3 voor de evaluatie van HDM RNA-geïnduceerde immuunreacties.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Statistische analyse
<ol><li>Statistische analyses uitvoeren met behulp van een commercieel beschikbare software.</li>
	<li>Bepaal de p-waarden op onbetaalde tweestaartstudenten t-toets voor de vergelijking van twee groepen.</li>
	<li>Bereken de absolute aantallen eosinofielen op basis van referentiekralen (bovenste paneel) met behulp van de formule</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61183/61183equ01.jpg">
<ol start="4"><li>Bepaal de p-waarden aan de hand van tweerichtings-ANOVA- en Sidak-test voor de vergelijking van meer dan twee groepen.</li>
	<li>Beschouw een p-waarde kleiner dan 0,05 als statistisch significant. De p-waarden worden aangegeven op percelen als *p <0,05, **p<0.01, ***p<0,001 en ****p<0,0001. LET OP: Alle bufferrecepten zijn opgenomen in tabel 5.</li>
</ol>

<ol><li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hay+fever%2C+hygiene%2C+and+household+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li>
<li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li>
<li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li>
<li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li>
<li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li>
<li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li>
<li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+flora+as+a+forgotten+organ%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li>
<li>Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces. , Microbiology Society. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018).</li>
<li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li>
<li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5%3A+Key+regulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li>
<li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Th1%2FTh2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor%2FT-helper+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li>
<li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly%28I%3AC%29+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351(2012).</li>
<li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506(2016).</li>
<li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li>
<li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li>
<li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A%28H1N1%29pdm09+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128(2017).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li>
<li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research%3A+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73(2017).</li>
<li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
<li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4%2B+T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427(2019).</li>
<li>Hungary (SCICONS). "Antibodies - J2." Antibodies - Monoclonal Anti-DsRNA J2 and Anti-DsRNA K1. English and Scientific Consulting Kft. , Available from: 
 <a target="_blank" href="scicons.eu/en/antibodies/j2/">scicons.eu/en/antibodies/j2/</a> (2020).</li>
<li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections%2C+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li>
<li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70(2018).</li>
<li>TRIzol Reagent Literature. RNA Isolation with TRIzol (Invitrogen) and Qiagen RNAeasy. Invitrogen Life Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf">http://www.ocg.cancer.gov/sites/default/files/RNA_Trizol_NBL.pdf</a> (2020).</li>
<li>ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245">www.neb.com/protocols/0001/01/01/shortcut-rnase-iii-digestion-protocol-m0245</a> (2020).</li>
<li>IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf">www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106228.pdf</a> (2020).</li>
<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li>
<li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li>
<li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+asthma%3A+a+comparison+between+C57BL%2F6+and+BALB%2Fc+strains+regarding+bronchial+responsiveness%2C+inflammation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Het huidige protocol beschrijft hoe de immunostimulerende eigenschappen van allergeen-geassocieerd microbiële RNA en hun effecten op de ontwikkeling van eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma te evalueren. Hoewel lange dsRNAs bekend staan als de replicatie tussenproducten van vele virussen die krachtig interferonreacties in zoogdiercellen kunnen activeren, zijn hun aanwezigheid in HDM-allergenen onbekend tot ons recente werk15. De combinatie van RNA dot blot, RT-qPCR en ...

Op basis van de hygiënehypothese die Strachan1oorspronkelijk voorstelde , kan blootstelling aan milieumicrobiële factoren zoals endotoxine beschermen tegen de ontwikkeling van allergische aandoeningen2,3. Tijdens microbiële infecties, bijvoorbeeld virale infecties, activeert de aangeboren immuundetectie van vreemde nucleïnezuren (RNA/DNA) hostverdedigingsreacties4,5,6. Het bestaan en de prevalentie van immunogene nucleïnezuren zoals lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten in huisstofmijt (HDM) of andere insectenallergenen blijven echter onbekend. Dit protocol is ontworpen om te bepalen of HDM of insecten- en niet-insectenallergenen lange dsRNA-soorten bevatten die een beschermende immuunrespons kunnen activeren om de ontwikkeling van ernstige eosinofiele longontsteking in een muismodel van allergische astma tegen te gaan. Hier bieden we drie eenvoudige en snelle methoden om de structurele determinanten in HDM totaal RNA te evalueren die nodig zijn voor het reguleren van allergeen-geïnduceerde eosinofiele longontsteking.
Het slijmvlies immuunsysteem is het grootste immuunsysteem orgaan in het lichaam en dient als de eerste lijn van gastheer verdediging tegen zowel microbiële infecties en allergische beledigingen7,8. De lange dsRNA, de replicatie tussenliggende van vele virussen, staat bekend om te functioneren als een pathogen-geassocieerd moleculair patroon (PAMP) om krachtig te stimuleren aangeboren reacties via Toll like receptor 3 (TLR3) om de expressie van interferon gestimuleerd genen (ISG's)9,10,11,12,13,14induceren . We hebben onlangs aangetoond dat HDM totale RNA bevatte dsRNA structuren, die upregulated de expressie van ISG's en verminderde ernstige eosinofiele longontsteking wanneer toegediend via de intratracheale instillatie in een murine model van allergische astma geïnduceerd door HDM extracten15. De ernst van longontstekingen wordt bepaald door het analyseren van de immuunceltypen in bronchoalveolaire lavage (BAL) en longweefsel via flow cytometrie16,17,18,19,20.
Dit protocol bevat drie tests: 1) snelle detectie van dsRNA-structuren met RNA-puntvlek met behulp van een monoklonale antilichaam J2 van de muis, dat specifiek op een sequentieonafhankelijke manier aan het dsRNA (≥40bp) bindt; 2) snelle evaluatie van in vivo effecten van immunostimulatorium RNA in muislongen door het meten van de inductie van ISG's met behulp van RT-qPCR; 3) nauwkeurige kwantificering van eosinofielen in BAL en long in de context van HDM-geïnduceerde longontsteking met behulp van flow cytometrie analyse.
De bovenstaande testen kunnen worden gebruikt om niet alleen allergische longziekten te bestuderen, maar ook respiratoire bacteriële en virale infecties. Zo kan het dsRNA-specifieke J2-antilichaam ook worden gebruikt in andere toepassingen zoals immunoaffiniteitschromatografie, immunohistochemie, enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en immunostaining21,22,23. Bovendien kunnen verschillende toepassingen stroomafwaarts van BAL-vloeistofverzameling worden gebruikt voor het kwantificeren van oplosbare inhoud, zoals cytokines en chemokines met behulp van ELISA, en transcriptieprofilering van cellen in de luchtwegen (bijvoorbeeld alveolaire macrofagen). Hoewel er een verscheidenheid van protocollen beschikbaar in de literatuur om longaandoeningen te evalueren, de meeste van deze protocollen richten zich vaak op de doelvalidatie. De hier beschreven procedures kunnen worden toegepast om componenten in milieuallergenen te identificeren die belangrijk zijn voor het reguleren van de ontwikkeling van allergische ziekten.

<table><tbody><tr><td>0.40 &micro;m Falcon Cell Strainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>TH.Geyer</td><td>7696702</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube</td><td>TH.Geyer</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Counting Beads</td><td>Life Technologies Europe B.V.</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>ACK-RBC lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ant</td><td>San Antonio</td><td>Opmerking: Lokaal verzameld</td><td></td></tr><tr><td>Antibody dilution buffer</td><td></td><td>(zie Tabel 5 voor recept)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td><td>BD Bioscience</td><td>560456</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td><td>BioLegend</td><td>117317</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>15-0193-81</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td><td>Invitrogen</td><td>15-0031-81</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103130</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td><td>Invitrogen</td><td>65-0866-14</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td><td>Promega</td><td>S3721</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-5931-82</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>47-5321-80</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552126</td><td>1 op 200 verdunning</td></tr><tr><td>BCIP/NBT substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI34042</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td></td><td>(zie Tabel 5 voor recept)</td><td></td></tr><tr><td>Cannual, 20G X 1.5&rdquo;</td><td>CADENCE SCIENCE</td><td>9920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cockroach</td><td>Greer Laboratories</td><td>B26</td><td></td></tr><tr><td>Counting beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>D. farinae</td><td>Greer Laboratories</td><td>B81</td><td></td></tr><tr><td>D. pteronyssinus</td><td>Greer Laboratories</td><td>B82</td><td></td></tr><tr><td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td><td>Thomas Scientific</td><td>1156F03</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td><td>Universal Medical, Inc.</td><td>BSH1004</td><td></td></tr><tr><td>Earthworm</td><td>San Antonio</td><td>Opmerking: Lokaal verzameld</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td></td><td>(zie recept in Tabel 5)</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td><td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td><td>38056</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Greer Laboratories</td><td>B8</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>HT-DNA</td><td>Sigma</td><td>D6898</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td></td></tr><tr><td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td><td>SCICONS</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Lung digestion solution</td><td></td><td>(zie recept in Tabel 5)</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913050-CF</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU:116913100</td><td></td></tr><tr><td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30120.094</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater</td><td>Homogenizers</td><td>SKU:BS:607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito</td><td>Greer Laboratories</td><td>B55</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td><td>TSCND2000C</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td><td>BD Biosciences</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat milk</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>Nylon string</td><td>Dynarex</td><td>3243</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>RNase III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2290</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2283</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Shaker or Small laboratory mixer</td><td>Boekel Scientific</td><td>201100</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td><td>Spherotech</td><td>ACFP-70-5</td><td>1 op 10 verdunning</td></tr><tr><td>Spider</td><td>San Antonio</td><td>Opmerking: Lokaal verzameld</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td>(zie recept in Tabel 5)</td><td></td></tr><tr><td>TBS-T</td><td></td><td>(zie recept in Tabel 5)</td><td></td></tr><tr><td>Total cell medium</td><td></td><td>(

identificatie en karakterisering van immunogene rna-soorten bij hdm-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevinden zich vaak in complexe vormen die zowel allergische eiwitten bevatten die afwijkende reacties van type 2 en microbiële stoffen stimuleren die aangeboren immuunreacties veroorzaken. Deze allergeen-geassocieerde microbiële componenten spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de ontwikkeling van type 2 ontstekingsaandoeningen zoals allergische astma. De onderliggende mechanismen blijven echter grotendeels ongedefinieerd. Het hier gepresenteerde protocol bepaalt de structurele kenmerken en in vivo activiteit van allergeen-geassocieerd immunostimulatorium RNA. Specifiek, gemeenschappelijke allergenen worden onderzocht op de aanwezigheid van dubbelstrengs RNA (dsRNA) soorten die IFN reacties in de longen kan stimuleren en de ontwikkeling van ernstige longeosinofilie in een muismodel van HDM-geïnduceerde allergische astma kunnen beperken. Hier hebben we de volgende drie tests opgenomen: Dot blot om de dsRNA-structuren in totale RNA-structuren te tonen die geïsoleerd zijn van allergenen, waaronder HDM-soorten, RT-qPCR om de activiteiten van HDM RNA in interferontimulerende genen (ISG's) expressie in muislongen en FACS-analyse te meten om de effecten van HDM RNA op het aantal eosinofielen in BAL en long te bepalen, respectievelijk.

De aanwezigheid van lange dsRNA-structuren in HDM, insecten en niet-insect kleine dieren werd onderzocht door dot vlek met behulp van een dsRNA-specifieke muis monoklonale antilichaam J2 (≥ 40bp). RNase III werd gebruikt om dsRNA te verteren tot 12-15 bp dsRNA-fragmenten, die niet op te sporen waren door J2 (figuur 1).
Het vermogen van HDM total RNA om een aangeboren immuunrespons in muislongen op een dosisafhankelijke manier te stimuleren, werd geanalyseerd door ...

Milieuallergenen zoals huisstofmijt (HDM) bevatten vaak microbiële stoffen die aangeboren immuunreacties activeren om allergische ontstekingen te reguleren. Het hier gepresenteerde protocol toont de identificatie aan van dsRNA-soorten in HDM-allergenen en karakterisering van hun immunogene activiteiten bij het moduleren van eosinofiele longontsteking.

Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Dit protocol is ontworpen om een zeer belangrijk en onopgelost probleem aan te pakken over hoe microbiële stoffen aanwezig en milieuallergenen de ontwikkeling van allergische ontstekingen kunnen reguleren. Specifiek, de methoden hier gepresenteerd kan helpen beantwoorden of dubbelstrengs RNA soorten in huis huis huis stofmijten zijn immunogene in vivo en in staat om eosinofiele longontsteking moduleren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze eenvoudig, efficiënt, zeer reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van veel gebruikte gereedschappen en apparatuur.Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om longziekten veroorzaakt door virale infecties van de luchtwegen te evalueren. Li Zij, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal helpen de procedure aan te tonen. Begin met het isoleren van het totale RNA van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen.Breng een juiste hoeveelheid monster in een twee-milliliter buis met 1,4 millimeter keramische kralen, en vries de buizen in een vloeibare stikstof container voor ongeveer 10 minuten. Voeg een milliliter guanidinium thiocyanaat-gebaseerde RNA isolatie reagens aan elke buis. Breek vervolgens het i

identification-characterization-immunogenic-rna-species-hdm-allergens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Experimentele muismodellen van allergische astma bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de ziekte van pathogenese en het ontwikkelen van nieuwe therapeutica. Deze modellen zijn zeer geschikt voor het meten factoren die de allergische immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen pathofysiologie.

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

We beschrijven een strategie om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen te volgen in reactie op ovalbumine in de setting van ovalbumine geïnduceerde allergische luchtwegontsteking. Deze strategie kan worden aangepast aan de migratie van pulmonale dendritische cellen te beoordelen in de instellingen van de infectie.

Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

This video demonstrates a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system. Serum IgEs interact with distinct allergens immobilized in the reaction zone of the cartridge, which are subsequently detected with peroxidase-conjugated anti-IgE antibodies and a chemiluminescent substrate, allowing simultaneous detection of multiple allergen-specific IgEs.

A Microfluidic Cartridge-Based Detection System for Allergen-Specific Immunoglobulin E

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Hier presenteren we de mediator release assay, met behulp van een rat basofiele leukemie cellijn getransfecteerd met de menselijke IgE receptor, om de degranulatie van effectorcellen te simuleren die typisch worden waargenomen bij type 1 allergische reacties. Deze methode onderzoekt de biologische activiteit van allergenen op een zeer gevoelige, reproduceerbare en aanpasbare manier.

Gestandaardiseerde Mediator Release Assay als een uitlezing voor allergeen potentie

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Een protocol voor het uitvoeren van een uitdaging in een allergeenblootstellingskamer (AEC) -faciliteit wordt gepresenteerd. AEC's hebben bewezen veilige en effectieve hulpmiddelen te zijn voor de inductie van allergische symptomen of als eindpunt bij het testen van de werkzaamheid van allergeenimmunotherapie vanwege hun vermogen om stabiele deeltjesconcentraties en omgevingsomstandigheden te handhaven.

Symptoombeoordeling van patiënten met allergische rhinitis met behulp van een allergeenblootstellingskamer

Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.

Immunofluorescerende etikettering in neusslijmvliesweefselsecties van allergische rhinitis-ratten via veelkleurige immunoassay

Een snelle protocol voor de directe identificatie van Enterococcus faecalis en Enterococcus andere soorten uit een positieve bloedkweek met behulp van een Peptide Nucleic Acid fluorescente in situ hybridisatie assay (PNA FISH).

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Ontdek hoe dubbelstrengig RNA in huisstofmijten de eosinofiele longontsteking moduleert in muismodellen. Deze methode helpt onderzoekers de immunogene eigenschappen van allergenen te bestuderen.

Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Meer video's verkennen