Identificatie en karakterisering van immunogene RNA-soorten bij HDM-allergenen die eosinofiele longontsteking moduleren

Dit protocol is ontworpen om een zeer belangrijk en onopgelost probleem aan te pakken over hoe microbiële stoffen aanwezig en milieuallergenen de ontwikkeling van allergische ontstekingen kunnen reguleren. Specifiek, de methoden hier gepresenteerd kan helpen beantwoorden of dubbelstrengs RNA soorten in huis huis huis stofmijten zijn immunogene in vivo en in staat om eosinofiele longontsteking moduleren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze eenvoudig, efficiënt, zeer reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van veel gebruikte gereedschappen en apparatuur.

Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om longziekten veroorzaakt door virale infecties van de luchtwegen te evalueren. Li Zij, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal helpen de procedure aan te tonen. Begin met het isoleren van het totale RNA van allergenen, insecten en niet-insectenallergenen.

Breng een juiste hoeveelheid monster in een twee-milliliter buis met 1,4 millimeter keramische kralen, en vries de buizen in een vloeibare stikstof container voor ongeveer 10 minuten. Voeg een milliliter guanidinium thiocyanaat-gebaseerde RNA isolatie reagens aan elke buis. Breek vervolgens het insect en niet-insect kleine dieren met een hoog-energetische cel disruptor op maximale snelheid gedurende 45 seconden.

Chill het monster op ijs, en herhaal dit proces twee keer. Breng de oplossing over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Voeg 200 microliter chloroform toe aan elke buis en draaikolk het monster.

Centrifugeren de buizen op 14.000 keer g gedurende 14 minuten bij vier graden Celsius. Breng vervolgens de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis met 500 microliter isopropanol. Meng het monster.

Dan centrifugeren op 14,000 keer g gedurende 14 minuten op vier graden Celsius. Zorgvuldig aspirate de supernatant. Was vervolgens de RNA-pellet met 500 microliters van 75%-ethanol en vercentrifugeren op 7, 500 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder voorzichtig alle vloeistof. Droog de pellet aan en los het RNA op met 20 tot 50 microliter RNase-vrij water. Om de dubbelstrengs RNA-structuren in het totale RNA te detecteren, spot je twee microliters van het 200 nanogram-per-microliter RNA-monster op het positief geladen nylonmembraan.

Crosslink de monsters aan het membraan bij 1. Herhaal het spotten en crosslinken nog twee keer, wat resulteert in een totaal van 1,2 microgram RNA per vlek. Blokkeer niet-specifieke binding met 5% melk in TBS-T gedurende een uur tijdens het schudden bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens de blokkerende oplossing en voeg het anti-dubbelstrengs RNA J2-antilichaam toe bij een één-op-1, 000 verdunning in 1%melk in TBS-T. Incubeer het membraan 's nachts met schudden op vier graden Celsius. Op de volgende dag, was het membraan drie keer met TBS-T gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Voeg het secundaire antilichaam toe en broed het membraan een uur lang uit bij kamertemperatuur. Herhaal dan de wasbeurten met TBS-T. Voeg het substraat toe en broed het membraan gedurende vijf tot 15 minuten tot een gewenst signaal zichtbaar is.

Stop de reactie door het membraan te spoelen met dubbel gedestilleerd water. Om de longmonsters te verzamelen, plaats de longen op tissuepapier, en accijns een klein stukje van elke longkwab. Plaats elk stuk in een twee-milliliter buis met kralen.

Om bronchoalveolar lavage te verzamelen, desinfecteerde een geëuthanaseerde muis met 70% ethanol en gebruikt u een schaar om de huid van het bovenste gedeelte van de buik tot de nek te snijden. Trek voorzichtig de speekselklieren en de sternohyoid spier uit elkaar met tangen om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats er dan een nylon touwtje onder.

Maak een incisie in de luchtpijp ongeveer twee milliliter onder het strottenhoofd net genoeg om een canule in te voegen en knoop de string rond de luchtpijp en canule. Bevestig een spuit aan het einde van de canule en laad deze met verse PBS-EDTA. Injecteer en aspiraat vervolgens een milliliter van de oplossing in de long.

Maak de spuit los van de canule en werp de oplossing in een buis van 15 milliliter. Herhaal dit proces op ijs met verse PBS-EDTA, en zwembad de spoel. Centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende zeven minuten op vier graden Celsius.

Neem vervolgens het volume op en breng de supernatant over op twee buizen van 1,5 milliliter zonder de pellet te verstoren. Breng na het opnieuw intrekken van de pellet 150 microliters over in een plaat met 96 put en centrifuge de plaat zeven minuten lang bij 500 g en vier graden Celsius. Keer vervolgens snel de plaat om op tissuepapier om de supernatant te verwijderen.

Bevlek de cellen met antilichamen in FACS-buffer in aanwezigheid van 2,4G2-blokkerend antilichaam en broed de plaat 30 minuten in het donker uit bij kamertemperatuur. Na het bevlekken, centrifugeren de plaat om de cellen pellet op 500 keer g gedurende zeven minuten op vier graden Celsius. Verwijder de kleuroplossing door de plaat op tissuepapier om te keren.

Voeg 100 microliter facs-buffer toe om de cellen te wassen en herhaal vervolgens de centrifugatie. Resuspend de monsters in 150 microliters van FACS buffer, en breng ze vervolgens naar FACS buizen met een extra 350 microliters van buffer. Voeg 25 microliter van het tellen van kralen aan elk monster, en ga verder met flow cytometrie analyse.

De aanwezigheid van lange dubbelstrengs RNA-structuren in huisstofmijt, insecten en niet-insect kleine dieren werd onderzocht door dot vlek met behulp van een dubbelstrengs, RNA-specifieke muis monoklonale antilichaam. RNase III werd gebruikt om het dubbelstrengs RNA te verteren tot 12 tot 15 basispaarfragmenten, die niet op te sporen waren door J2. Het vermogen van huisstofmijt totaal RNA om een aangeboren immuunrespons in muislongen te stimuleren werd aangetoond door RT-qPCR. De RNase III-behandeling schafte de immunostimulerende activiteit van huisstofmijt totaal RNA af, wat aangeeft dat de dubbelstrengs RNA-structuren essentieel zijn voor aangeboren immuunactiviteit in de longen.

Het remmende effect van huisstofmijt totaal RNA op de ontwikkeling van een ernstige type twee longontsteking werden geëvalueerd met FACS analyse. De eosinofiele longontsteking werd veroorzaakt door stofmijtextracten, die met of zonder RNase III werden behandeld. De afbraak van lange dubbelstrande RNA-soorten resulteerde in ernstige type twee longontsteking, weerspiegeld door de toegenomen eosinofiele aantallen in bronchoalveolr lavage en longen.

Met name het aantal eosinofielen in de totale RNA-behandelde groep met stofmijt is vergelijkbaar met de groep die is behandeld met het oorspronkelijke stofmijtextract dat de lange dubbelstrengs RNA-soorten endogeen bevatte. Bij het proberen van dit protocol, wees zeer voorzichtig bij het injecteren en het verzamelen van de BAL vloeistof, als eventuele schade aan de longen in dit stadium kan de uiteindelijke resultaten te veranderen. Naast deze procedure kunnen andere methoden zoals ELISA worden uitgevoerd om niet-cellulaire oplosbare inhoud in de BAL-vloeistof te analyseren.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers om andere microbiële stoffen te onderzoeken die aanwezig zijn in omgevingsallergenen, zoals niet-dubbelstrengs RNA-factoren die de ontwikkeling van allergische longontsteking kunnen reguleren.