Generatie van hiPSC-afgeleide darmorganoïden voor ontwikkelings- en ziektemodelleringstoepassingen
8 maart 2024
Dit protocol maakt het mogelijk om menselijke pluripotente cellen te differentiëren tot darmorganoïden. Het protocol bootst de normale menselijke ontwikkeling na door cellen te differentiëren in een populatie van definitief endoderm, endoderm van de dikke darm en vervolgens darmepitheel. Dit maakt het protocol geschikt voor het bestuderen van zowel darmontwikkeling als toepassingen voor ziektemodellering.
Deze methode biedt stapsgewijze instructies voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide darmorganoïden door differentiatie in definitief endoderm, vervolgens in het epitheel van de dikke darm en ten slotte in de overdracht naar 3D-kweekomstandigheden. Resultaten verkregen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide darmorganoïden tonen een grotere vertaalbaarheid aan dan gegevens van eencellige culturen, terwijl ze ook praktischer zijn dan primaire weefsel-afgeleide organoïden, die moeilijk op lange termijn in cultuur te houden kunnen zijn. Gebruik bij het genereren van menselijke darmcellen uit gedifferentieerde iPSC's een serologische pipet van 5 milliliter om de celmonolaag los te maken van elk putje van de plaat met 6 putjes.
En bundel de cellen in een enkele buis van 15 milliliter voor centrifugatie. Resuspendeer de pellet in darmgroeimedium aangevuld met groeifactoren. En voeg het juiste volume extracellulaire matrix toe op basis van het aantal putjes dat wordt geplateerd.
Voeg 30 microliter van de celsuspensie toe aan het midden van het juiste aantal putjes van een plaat met 48 putjes. Ervoor zorgen dat de ECM in het midden van de put wordt geplaatst, is erg belangrijk voor de stabiliteit van dat monster op lange termijn. Als de ECM de wand van de put raakt, kan deze instorten en kunnen de monsters verloren gaan.
Plaats de plaat minimaal 5 minuten in de celkweekincubator. Wanneer de extracellulaire matrix is uitgehard, voegt u 300 microliter vers darmgroeimedium aangevuld met groeifactoren toe aan elk putje en plaatst u de plaat terug in de celkweekincubator. Gebruik na 48 uur een lichtmicroscoop om de putjes te controleren op organoïdevorming.
Na 7 dagen kweken zuig je de kweekmedia op en vervang je deze door ijskoud DPBS. Gebruik een serologische pipet van 5 milliliter om de organoïden en de extracellulaire matrixbol mechanisch los te maken van de plaat. Bundel vervolgens de organoïden in een enkele centrifugebuis van 15 milliliter.
Verzamel de organoïden door centrifugeren en zuig het supernatans op tot aan de bovenkant van de zichtbare ECM-laag. Suspendeer de pellet opnieuw in 15 milliliter ijskoude DPBS en centrifugeer de cellen opnieuw. Na het opzuigen van het supernatans zoals gedemonstreerd, suspendeert u de pellet opnieuw in 1 milliliter ijskoude PBS en gebruikt u een P200-pipet om de intacte organoïden handmatig te verstoren.
Bevestig een volledige dissociatie van de organoïden. Draai de gedissocieerde organoïden en suspendeer ze opnieuw in het vereiste volume van de extracellulaire matrix voordat ze op een nieuwe plaat met 48 putjes worden geplateerd, zoals gedemonstreerd. Zet het bord vervolgens 5 minuten terug in de couveuse.
Haal na 5 minuten de plaat uit de incubator en voeg intestinale basale media met groeifactoren en ROCK-remmer toe. Wissel elke 2-4 dagen van medium. Om een ontstekingsreactie in de darmorganoïden op gang te brengen, vervangt u het supernatans in elk putje van de organoïdecultuur door 300 microliter vers bereid basaal medium aangevuld met 40 nanogram per milliliter TNF-alfa.
Breng de plaat vervolgens 48 uur terug naar de celkweekincubator om een pro-inflammatoire omgeving na te bootsen. Genexpressie kan worden gevolgd in de loop van humane IPSC-differentiatie met behulp van pluripotentiemarkers die sterk tot expressie komen op dag 0 en snel worden neerwaarts gereguleerd tijdens het proces van definitieve endodermdifferentiatie. Op dag 2 van differentiatie zouden definitieve endodermgenen tot expressie moeten worden gebracht en zou de expressie op dag 3 moeten pieken.
Tijdens de specificatie van de achterste darm moet de expressie van CDX2 en HNF4alfa worden geïnduceerd en in de loop van de tijd toenemen. 48 uur na de overdracht van 2D-celvellen zouden de celvellen zich automatisch moeten organiseren in meer gecomprimeerde 3D-sferoïde structuren die aanvankelijk klein zijn, maar die geleidelijk in omvang en complexiteit toenemen in de komende 7-10 dagen van de kweek. De organoïden mogen niet worden gepasseerd voordat ze een duidelijke organoïde sferoïde morfologie hebben bereikt met duidelijk epitheel en met het lumen naar het midden van de structuur gericht.
Wanneer de structuren dit stadium bereiken, kan immunocytochemie worden uitgevoerd om de expressie van darmmarkers, zoals villine en CDX2, te bevestigen. Om ontsteking te modelleren, kan TNF-alfa gedurende 24-48 uur aan het weefselkweekmedium worden toegevoegd, wat doorgaans resulteert in de expressie van pro-inflammatoire markers in combinatie met de neerwaartse regulatie van intestinale epitheelmarkers. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide darmorganoïden kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen, ziektemodellering, genbewerking, een studie van de micro-omgeving van de tumor en transcriptomische en proteomische en epigenetische profielen van elke ziekte van belang.
Deze methode kan veel laboratoria helpen om darmorganoïden als modelsysteem vast te stellen, waardoor ze een extra methode voor hun onderzoek krijgen.
Overzicht
Dit onderzoek beschrijft een protocol voor het differentiëren van humane pluripotente stamcellen tot intestinale organoïden, waarbij de normale menselijke ontwikkeling wordt nagebootst. De methode produceert effectief definitief endoderm, hindgut-epitheel en uiteindelijk functionele intestinale structuren, die geschikt zijn voor het bestuderen van de intestinale ontwikkeling en ziektemodellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Ziektemodellering
Achtergrond
- Humane pluripotente stamcellen kunnen worden gedifferentieerd naar verschillende celtypen.
- Intestinale organoïden dienen als een beter vertaalbaar model in vergelijking met monocellulaire culturen.
- Er zijn uitdagingen verbonden aan het in stand houden van organoïden afgeleid van primair weefsel.
Gebruikte methoden
- Differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) tot organoïden.
- 3D-kweekcondities voor stabiliteit en groei op de lange termijn.
- Monitoring van genexpressie en immunocytochemie voor intestinale markers.
Belangrijkste Resultaten
- Generatie van intestinale organoïden uit iPSCs met duidelijke epitheliale structuren.
- Succesvolle modellering van inflammatoire responsen met behulp van TNF alpha.
- Robuuste expressie van intestinale markers bevestigd via diverse assays.
Conclusies
- De studie biedt een levensvatbare methode voor het creëren van humane intestinale organoïden.
- Deze techniek verbetert de onderzoeksmogelijkheden voor medicijnontwikkeling en ziektemodellering.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Uit hiPSC afgeleide intestinale organoïden bieden een schaalbaar, reproduceerbaar en menselijk relevant modelsysteem voor vroege drug discovery en het onderzoeken van ziektemechanismen. Hun vermogen om de complexe architectuur van het darmepitheel te recapituleren, maakt voorspellend vertrouwen mogelijk bij targetvalidatie en mechanistische risicoreductie voor gastro-intestinale ziekteportfolio's. Dit platform ondersteunt translationele continuïteit van discovery tot preklinisch onderzoek, wat risicogecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk in een fysiologisch relevante 3D menselijke intestinale context.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het modelleren van epitheliale celdifferentiatie en polarisatie.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor inflammatoire en fibrotische pathways die relevant zijn voor IBD en aanverwante aandoeningen.
- Biedt een platform voor comparatieve studies met behulp van gezonde en patiëntafgeleide hiPSCs.
Screening & assay-ontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, uitbreidbare organoïdculturen die geschikt zijn voor de ontwikkeling van kwantitatieve assays.
- Maakt reproduceerbare meting van genexpressie en eiwitmarkers mogelijk via qPCR en immunocytochemie.
- Ondersteunt het screenen van inflammatoire responsen op cytokinen en bacteriële mediatoren in een gecontroleerd systeem.
- Maakt schaalbare passage en onderhoud mogelijk, wat high-throughput workflows ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Modelleert ziekterelevante fenotypen, waaronder inflammatoire en fibrotische responsen, voor de ontdekking van translationele biomarkers.
- Maakt afstemming van in vitro bevindingen op patiëntafgeleide genetische achtergronden mogelijk voor preklinische validatie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde progressie van kandidaat-therapeutica die gericht zijn op intestinale pathologieën.
- Faciliteert de integratie van transcriptomische, proteomische en epigenetische analyses voor uitgebreide ziektemodellering.
Pipeline- & Workflowintegratie
Dit organoïdenplatform slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische validatie door een mens-relevant, reproduceerbaar systeem te bieden voor hypothesetesten en mechanistische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het toetsen van nulhypothesen en de verduidelijking van signaalpaden bij darmontwikkeling en -ziekten.
- Screening: Levert assay-klare, gestandaardiseerde organoïden voor kwantitatieve evaluatie van inflammatoire en fibrotische reacties.
- Analytica: Maakt robuuste meting van gen- en eiwitexpressie mogelijk om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Stemt in vitro ziektemodellering af op genetische achtergronden van patiënten voor de ontdekking van biomarkers en targets.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar platform dat aanpasbaar is aan diverse behoeften binnen gastro-intestinaal onderzoek.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows en maakt reproduceerbare, schaalbare organoïdeproductie mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en het kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een laat stadium te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's voor gastro-intestinale aandoeningen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in hiPSC-kweek, differentiatie en de hantering van 3D-organoïden.
- Toegang tot gespecialiseerde celkweekinfrastructuur en analytische platforms voor qPCR en immunocytochemie is noodzakelijk.
- Standaardisatie van differentiatie- en passageringsprotocollen tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassingen kunnen noodzakelijk zijn voor verschillende hiPSC-lijnen of ziekte-specifieke genetische achtergronden.
- Stabiliteit van de kweek op lange termijn en schaalbaarheid zijn afhankelijk van nauwkeurige hantering van ECM en supplementatie met groeifactoren.
