Een lucht-vloeistof interface bronchiale epitheel model voor realistische, herhaalde inhalatie blootstelling aan deeltjes in de lucht voor toxiciteit testen
13 mei 2020
Beschreven is de celkweek en blootstellingsmethode van een in vitro bronchiaal model voor realistische, herhaalde inhalatieblootstelling aan deeltjes voor toxiciteitstests.
Dit protocol beschrijft hoe men menselijke bronchiale epitheelcellen kan kweken en blootstellen via de lucht. Dit is een realistischere model voor het bestuderen van blootstelling van de long aan ingeademde deeltjes. De longcellen die met deze methoden zijn bereid, lijken op de echte omgeving in de long. De cellen zullen slijm produceren, een strakke barrière vormen en gedurende enkele weken levensvatbaar blijven. Deze methode kan worden gebruikt om toxische effecten van luchtdeeltjes te bestuderen. Het kan ook worden gebruikt om infectieziekten van de luchtwegen en medicijnen die via inhalatie worden ingenomen te bestuderen. Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, houd er dan rekening mee dat het genereren van een agil vereist specialistische kennis. Het vereist ook speciaal meetapparatuur. Begin met het verdunnen van de cellen in voorverwarmd celkweekmedium of CCM, tot een concentratie van 500.000 cellen per milliliter voor 6-well inzetstukken. En 250.000 cellen per milliliter voor 12-well inzetstukken. Plaats een celkweekplaat met inzetstukken onder aseptische omstandigheden en vul de basale laterale kant met voorverwarmd CCM. Na het mengen van de celsuspensie, pipet deze op de membraan in de celkweekinzet. Dek de plaat af en incubeer deze bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Kweek de cellen gedurende zeven dagen onder ondergedompelde omstandigheden, om ze confluentie te laten bereiken, en ververs het CCM om de twee tot drie dagen. Om de transepitheliale elektrische weerstand te meten, gebruik een geladen epitheelvoltohmmeter, aangevuld met een set eetstokjeselektroden. Reinig de elektroden met 70%ethanol. Plaats de langere elektrode in het externe kweekmedium, totdat deze de bodem van de schaal raakt. En de kortere elektrode in het medium, zonder de membraan aan te raken. Begin met het verzamelen van metingen op de lege inzet zonder cellen. Wacht tot de meting is gestabiliseerd en noteer de weerstand in ohm. Deze meting is de weerstand van de inzetmembraan zonder cellen of blanco weerstand. Herhaal de meting voor elke inzet en trek de blanco weerstand af om de ware weerstand te verkrijgen en vermenigvuldig met de oppervlakte van de inzet. Verwijder het medium van de apicale kant van de inzet en voeg voorverwarmd CCM toe aan de basolaterale kant van de well. Het medium mag de membraan van onderaf raken, maar niet op de bovenkant van de inzet lekken. Kweek de cellen bij de lucht-vloeistofinterface in de incubator, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende zeven dagen. Ververs het basolaterale medium om de twee tot drie dagen. Kort voor de blootstelling aan deeltjes, bereid een 1%nanoparticlesuspensie voor. Bevochtig de NP's met 96%ethanol. Voeg zuiver water toe tot een eindconcentratie van 1%NP's. Plaats de flacon in een beker op ijs. Soniceer de suspensie gedurende 16 minuten, voeg een roerder toe aan de fles met de dispersie, verbind vervolgens de fles via een kleine buis aan een peristaltische pomp en stel het debiet in op 25 milliliter per uur. Een dag voor de blootstelling, zet de geautomatiseerde blootstellingsstation of AES aan en laat de kast een temperatuur bereiken van 37
Overzicht
Deze studie richt zich op de ontwikkeling van een in vitro bronchiaal model om herhaalde inhalatieblootstelling aan luchtdeeltjes te simuleren voor toxiciteitstesten. De gekweekte menselijke bronchiale epitheelcellen vertonen een langdurige levensvatbaarheid en een realistische slijmproductie, waardoor het model geschikt is voor toxicologische studies en onderzoek naar infectieziekten.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Toxicologie
- Respiratoire biologie
- In vitro-modellen
Achtergrond
- De behoefte aan realistische modellen voor longblootstelling
- Het belang van het bestuderen van geïnhaleerde deeltjes
- Toepassingen in medicijnaftoediening en onderzoek naar infectieziekten
Gebruikte methoden
- Celkweektechnieken voor menselijke bronchiale epitheelcellen
- Kweekcondities voor lucht-vloeistofinterface
- Meting van de transepitheliale elektrische weerstand
Belangrijkste resultaten
- De cellen vormen een nauwe barrière en produceren mucus
- Levensvatbaarheid behouden gedurende meerdere weken onder gecontroleerde omstandigheden
- Methode gevalideerd voor gebruik in toxicologische beoordelingen
Conclusies
- Het ontwikkelde model bootst de blootstelling van de longen aan ingeademde deeltjes effectief na
- Significante implicaties voor toxiciteitstesten en respiratoir onderzoek
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Realistische in vitro-modellen van het bronchiale epitheel zijn essentieel voor voorspellende inhalatietoxiciteitstesten en onderzoek naar toediening van respiratoire geneesmiddelen. Het air-liquid interface (ALI)-systeem met Calu-3-cellen maakt herhaalde blootstellingsstudies met lage doses mogelijk die de menselijke luchtwegcondities nauwkeurig nabootsen, wat zorgt voor een hoger translationeel vertrouwen bij de evaluatie van verbindingen in een vroeg stadium. Deze benadering voldoet aan de behoefte aan fysiologisch relevante, reproduceerbare modellen in respiratoire biofarmaceutische pijplijnen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk van de effecten van geïnhaleerde verbindingen op het luchtwagepitheel.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door tight junctions en mucusproductie over langere perioden in stand te houden.
- Vergemakkelijkt voorspellende betrouwbaarheid bij beoordelingen van respiratoire toxiciteit en veiligheid.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd, reproduceerbaar systeem voor de kwantitatieve meting van de integriteit van de epitheliale barrière.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays voor herhaalde blootstelling aan deeltjes in lage concentraties.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van de effecten van luchtborn verbindingen onder continue stroomcondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante luchtwegmodellen voor translationele biomarkerstudies.
- Garandeert continuïteit van in vitro ontdekking naar preklinische workflows voor inhalatietoxicologie.
- Vermindert het risico op uitval in een laat stadium door realistische blootstellingsscenario's te modelleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit ALI-bronchiële model is geïntegreerd in het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek voor respiratoire therapieën en inhalatietoxicologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot de barrièrefunctie van de luchtwegen en partikeltoxiciteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de transepitheliale weerstand en viabiliteit.
- Analytics: Maakt continue monitoring van de blootstellingsconcentratie en de toegediende dosis mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische inhalatiestudies met ziekte-relevante eindpunten.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd platform dat aanpasbaar is voor diverse studies naar luchtgedragen partikels en geneesmiddelen.
Operationele en bedrijfsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij testen van respiratoire toxiciteit.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor protocollen met herhaalde blootstelling.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie bij de ontwikkeling van respiratoire portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van geïnhaleerde verbindingen en formuleringen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in ALI-celkweek en het meten van de epitheliale barrière.
- Vereist specifieke instrumentatie voor continue flow-blootstelling en weerstandsmonitoring.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor blootstellingsprotocollen en data-analyse.
- Aanpasbaar aan verschillende typen en concentraties van luchtgedragen deeltjes binnen de beperkingen van het model.
- Afhankelijk van het behoud van cellevensvatbaarheid en de integriteit van tight junctions gedurende langere kweekperioden.
