Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken of vluchtige anesthetica sommige synapsen meer verstoort dan andere, om te bepalen of hun effecten celtype- of padspecifiek zijn en om te bepalen welke effecten zich op populatieniveau voordoen. Het grote voordeel van deze techniek is de specificiteit waarmee we de effecten van vluchtige anesthetica kunnen beoordelen. We kunnen specifieke paden en celtypen tegelijkertijd beoordelen op populatieactiviteit.

Begin met het voorbereiden van het weefselblok voor het snijden. Til het brein voorzichtig uit de schedelholte en plaats het op het filterpapier. Maak een snede langs het sagittale vlak van het brein parallel aan de middenlijn en plaats het weefselblok op dit sagittale vlak.

Leid het filterpapier over de blokkeringssjabloon en lijn het brein uit met de onderliggende sjabloonrand. Maak een evenwijdige snede in het coronale vlak zoals aangegeven door de lijnen op de sjabloon en voeg indien nodig een kleine druppel snijdend aCSF toe om het filterpapier nat te houden. Plaats het weefselblok in vier graden Celsius snijdend aCSF en breng een kleine hoeveelheid lijm aan op het ijskoue monsterplatform.

Til het weefselblok uit het snijdende aCSF en veeg overtollig oplossing weg met een hoek van een absorberend handdoekje. Lijm het achterste coronale vlak van het weefselblok op het monsterplatform met de dorsale oppervlakte van het brein naar de saffiermes toe. Verzamel coronale hersenslices van 500 micrometer dik en plaats ze op een nylon gaas in 34 graden Celsius snijdend aCSF.

Laat de container op kamertemperatuur komen. Om experimentele aCSF-zakken met opgelost isofluraand toe te voegen, voeg 600 milliliter experimentele aCSF en 600 milliliter 95% zuurstof en 5% koolstofdioxidegasmengsel toe aan een lege polytetrafluorethyleen gaszak. Label deze zak controle.

Voeg 300 milliliter experimentele aCSF toe aan een andere polytetrafluorethyleen gaszak en label deze zak isofluraand. Ga verder met het voorbereiden van de isofluraandzak volgens de handleiding. Configureer de lichtsimulatieprotocollen door golfvormen willekeurig toe te wijzen aan elk profiel.

Elk profiel met de toegewezen golfvorm komt overeen met een triggerpuls van een digitale TTL-invoer of één proef. Als u klaar bent, slaat u de profielsequentie op. Om de multi-kanaals sonde in de ex vivo hersenweefseldop te plaatsen, perfundeer gebubbeld experimenteel aCSF met drie tot zes milliliter per minuut en breng de hersenslice die het gebied van belang bevat over op het gaasrooster in de microscoopperfusiekamer.

Veranker de hersenslice met een platina harp. Draai het gaasrooster zodat de lijn van elektrodencontacten aan het distale uiteinde van de multi-kanaals sonde ongeveer loodrecht op het schiloppervlak staat. Onder brede veldverlichting en fijne controle van de micromanipulator, laat de multi-kanaals sonde langzaam naar het oppervlak van de slice zakken.

Activeer de juiste filterkubus voor visualisatie van het fluorescerende reportereiwit dat wordt uitgedrukt in axonterminals van corticale afferente vezels. Indien nodig, draai de slice om de sonde nauwkeuriger uit te lijnen met het schiloppervlak. Plaats de sonde net boven het vlak van de slice op 200 micrometer van de laatste doelpositie langs de x-as, waarbij minimaal één kanaal buiten het gebied van weefsel dat wordt opgenomen blijft.

Breng de sonde langzaam in de slice in langs de longitudinale as. Om schade aan het weefsel te minimaliseren, brengt u de sonde alleen vooruit totdat de scherpe uiteinden net onder het weefseloppervlak zichtbaar zijn. Schakel de experimentele aCSF-bron over naar de opgevangen controle-oplossing en identificeer de fluorescerend gelabelde cel voor gerichte patch clamp-opname.

Beperk de diafragma tot de kleinste diameter en activeer de wateronderdompelingobjectief met hoge vergroting, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat er contact is tussen de multi-kanaals sonde en het objectief. Breng het weefsel in focus. Centreer het licht over een weefseldering naast maar niet overlappend met de multi-kanaals sonde.

Activeer de juiste filterstel om beeldvorming van cellen die het Cre-afhankelijke fluorescente marker uitdrukken mogelijk te maken. Breng het objectief omhoog om voldoende ruimte te creëren voor het neerleggen van een patchpijp. Laad een patchpijp met interne oplossing en monteer deze op de elektrodehouder.

Gebruik een spuit van één milliliter om een positieve druk toe te passen die overeenkomt met ongeveer 0,1 milliliter lucht. Breng de patchpijp in de oplossing en breng de punt onder visuele begeleiding in focus, en verkrijg een volledige celopname van de doelcel. De dieren die in dit protocol werden gebruikt, drukten fluorescerend reportereiwit tdTomato uit in somatostatine of parvalbumine-positieve interneuronen.

Deze interneuronen werden onder visuele begeleiding gericht voor patch clamping met de juiste filterkubus actief. Postsynaptische potentialen werden waargenomen in interneuronen als reactie op een reeks van vier twee milliseconde lange lichtpulsen. Lokale veldpotentialen werden ook opgenomen.

Huidige brondichtheid en multi-eenheidsactiviteit werden geëxtraheerd uit lokale veldpotentialen. De amplitude van stroomputten geëxtraheerd uit de stroombrondichtheid nam toe als functie van lichtintensiteit. Een drieparameter niet-lineaire logistieke vergelijking werd aangepast aan de gegevens voor vergelijkingen tussen paden.

De amplitude van de postsynaptische potentiaal nam ook toe met de amplitude van de stroomput. Synaptische reacties op de thalamocorticale en cortico-corticale inputs werden gemeten tijdens controle, isofluraan en herstelcondities. Postsynaptische reacties van somatostatine en cortico-corticale stimuli en de geïnduceerde stroomputten werden onderdrukt in isofluraandcondities.

Bij het voorbereiden van de hersenslices is het behoud van de gezondheid van het weefsel van het grootste belang. Het is belangrijk om het weefsel tijdens de snijproceduur koel te houden, snel te werken zonder het weefsel te beschadigen. Multichannel extracellulaire opnames kunnen op verschillende manieren nabewerkt worden.</