Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica
July 23rd, 2020
Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.
Dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken of vluchtige anesthetica sommige synapsen meer verstoort dan andere, om te bepalen of hun effecten celtype- of padspecifiek zijn en om te bepalen welke effecten zich op populatieniveau voordoen. Het grote voordeel van deze techniek is de specificiteit waarmee we de effecten van vluchtige anesthetica kunnen beoordelen. We kunnen specifieke paden en celtypen tegelijkertijd beoordelen op populatieactiviteit.
Begin met het voorbereiden van het weefselblok voor het snijden. Til het brein voorzichtig uit de schedelholte en plaats het op het filterpapier. Maak een snede langs het sagittale vlak van het brein parallel aan de middenlijn en plaats het weefselblok op dit sagittale vlak.
Leid het filterpapier over de blokkeringssjabloon en lijn het brein uit met de onderliggende sjabloonrand. Maak een evenwijdige snede in het coronale vlak zoals aangegeven door de lijnen op de sjabloon en voeg indien nodig een kleine druppel snijdend aCSF toe om het filterpapier nat te houden. Plaats het weefselblok in vier graden Celsius snijdend aCSF en breng een kleine hoeveelheid lijm aan op het ijskoue monsterplatform.
Til het weefselblok uit het snijdende aCSF en veeg overtollig oplossing weg met een hoek van een absorberend handdoekje. Lijm het achterste coronale vlak van het weefselblok op het monsterplatform met de dorsale oppervlakte van het brein naar de saffiermes toe. Verzamel coronale hersenslices van 500 micrometer dik en plaats ze op een nylon gaas in 34 graden Celsius snijdend aCSF.
Laat de container op kamertemperatuur komen. Om experimentele aCSF-zakken met opgelost isofluraand toe te voegen, voeg 600 milliliter experimentele aCSF en 600 milliliter 95% zuurstof en 5% koolstofdioxidegasmengsel toe aan een lege polytetrafluorethyleen gaszak. Label deze zak controle.
Voeg 300 milliliter experimentele aCSF toe aan een andere polytetrafluorethyleen gaszak en label deze zak isofluraand. Ga verder met het voorbereiden van de isofluraandzak volgens de handleiding. Configureer de lichtsimulatieprotocollen door golfvormen willekeurig toe te wijzen aan elk profiel.
Elk profiel met de toegewezen golfvorm komt overeen met een triggerpuls van een digitale TTL-invoer of één proef. Als u klaar bent, slaat u de profielsequentie op. Om de multi-kanaals sonde in de ex vivo hersenweefseldop te plaatsen, perfundeer gebubbeld experimenteel aCSF met drie tot zes milliliter per minuut en breng de hersenslice die het gebied van belang bevat over op het gaasrooster in de microscoopperfusiekamer.
Veranker de hersenslice met een platina harp. Draai het gaasrooster zodat de lijn van elektrodencontacten aan het distale uiteinde van de multi-kanaals sonde ongeveer loodrecht op het schiloppervlak staat. Onder brede veldverlichting en fijne controle van de micromanipulator, laat de multi-kanaals sonde langzaam naar het oppervlak van de slice zakken.
Activeer de juiste filterkubus voor visualisatie van het fluorescerende reportereiwit dat wordt uitgedrukt in axonterminals van corticale afferente vezels. Indien nodig, draai de slice om de sonde nauwkeuriger uit te lijnen met het schiloppervlak. Plaats de sonde net boven het vlak van de slice op 200 micrometer van de laatste doelpositie langs de x-as, waarbij minimaal één kanaal buiten het gebied van weefsel dat wordt opgenomen blijft.
Breng de sonde langzaam in de slice in langs de longitudinale as. Om schade aan het weefsel te minimaliseren, brengt u de sonde alleen vooruit totdat de scherpe uiteinden net onder het weefseloppervlak zichtbaar zijn. Schakel de experimentele aCSF-bron over naar de opgevangen controle-oplossing en identificeer de fluorescerend gelabelde cel voor gerichte patch clamp-opname.
Beperk de diafragma tot de kleinste diameter en activeer de wateronderdompelingobjectief met hoge vergroting, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat er contact is tussen de multi-kanaals sonde en het objectief. Breng het weefsel in focus. Centreer het licht over een weefseldering naast maar niet overlappend met de multi-kanaals sonde.
Activeer de juiste filterstel om beeldvorming van cellen die het Cre-afhankelijke fluorescente marker uitdrukken mogelijk te maken. Breng het objectief omhoog om voldoende ruimte te creëren voor het neerleggen van een patchpijp. Laad een patchpijp met interne oplossing en monteer deze op de elektrodehouder.
Gebruik een spuit van één milliliter om een positieve druk toe te passen die overeenkomt met ongeveer 0,1 milliliter lucht. Breng de patchpijp in de oplossing en breng de punt onder visuele begeleiding in focus, en verkrijg een volledige celopname van de doelcel. De dieren die in dit protocol werden gebruikt, drukten fluorescerend reportereiwit tdTomato uit in somatostatine of parvalbumine-positieve interneuronen.
Deze interneuronen werden onder visuele begeleiding gericht voor patch clamping met de juiste filterkubus actief. Postsynaptische potentialen werden waargenomen in interneuronen als reactie op een reeks van vier twee milliseconde lange lichtpulsen. Lokale veldpotentialen werden ook opgenomen.
Huidige brondichtheid en multi-eenheidsactiviteit werden geëxtraheerd uit lokale veldpotentialen. De amplitude van stroomputten geëxtraheerd uit de stroombrondichtheid nam toe als functie van lichtintensiteit. Een drieparameter niet-lineaire logistieke vergelijking werd aangepast aan de gegevens voor vergelijkingen tussen paden.
De amplitude van de postsynaptische potentiaal nam ook toe met de amplitude van de stroomput. Synaptische reacties op de thalamocorticale en cortico-corticale inputs werden gemeten tijdens controle, isofluraan en herstelcondities. Postsynaptische reacties van somatostatine en cortico-corticale stimuli en de geïnduceerde stroomputten werden onderdrukt in isofluraandcondities.
Bij het voorbereiden van de hersenslices is het behoud van de gezondheid van het weefsel van het grootste belang. Het is belangrijk om het weefsel tijdens de snijproceduur koel te houden, snel te werken zonder het weefsel te beschadigen. Multichannel extracellulaire opnames kunnen op verschillende manieren nabewerkt worden.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van ex vivo herfsneden om de effecten van vluchtige anesthetica, specifiek isofluraan, op neuronale reacties op afferente inputten te onderzoeken. Met behulp van optogenetica activeren de onderzoekers onafhankelijk thalamocorticale en corticocorticale afferenties in de niet-primaire neocortex, waarbij wordt onderzocht hoe anesthetische blootstelling synaptische en netwerkreacties moduleert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Synaptische plasticiteit
Achtergrond
- Het begrijpen van hoe vluchtige anesthetica neuronale circuits beïnvloeden, is cruciaal.
- Ex vivo herfsneden bieden een gecontroleerde omgeving voor dergelijke studies.
- Optogenetica maakt specifieke activering van neuronale paden mogelijk.
- De effecten van anesthetica op synaptische reacties kunnen bredere implicaties voor anesthesie in klinische omgevingen informeren.
Doel van de studie
- Om te bepalen of vluchtige anesthetica verschillende effecten hebben op verschillende synaptische paden.
- Om te beoordelen of deze effecten specifiek zijn voor bepaalde celtypen.
- Om populatie-niveau reacties tijdens anesthetische blootstelling te evalueren.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform dat voor deze studie werd gebruikt, omvatte ex vivo herfsneden van dieren.
- Doelwit celtypen omvatten somatostatine en parvalbumine-positieve interneuronen.
- Herfsneden werden bereid en onderhouden in omstandigheden die weefselschade minimaliseren.
- Experimenten omvatten optogenetische stimulatie om postsynaptische potentialen te meten.
- Kritieke stappen omvatten het voorbereiden van experimentele oplossingen en het configureren van lichtstimulatieprotocollen.
Belangrijkste resultaten
- Isofluraanblootstelling onderdrukte synaptische reacties op thalamocorticale en corticocorticale inputten.
- Post-synaptische potentiaalamplitudes namen toe met lichtintensiteit, wat duidt op de reactiviteit van doelgerichte interneuronen.
- Breedtebrondendheidsberekeningen benadrukten verhoogde synaptische activiteit onder specifieke omstandigheden.
- Bevindingen suggereren duidelijke effecten van anesthetica op neuronale excitabiliteit en synaptische modulatie.
Conclusies
- Deze studie toont de bruikbaarheid van ex vivo herfsneden voor het onderzoeken van anesthetische effecten op neurale circuits.
- Het biedt inzichten in synaptische dynamischa beïnvloed door vluchtige anesthetica, wat bijdraagt aan een dieper begrip van neuronale mechanismen onder anesthesie.
- De bevindingen kunnen klinische praktijken met betrekking tot anesthesie en de effecten ervan op hersenfunctie informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
