Name: Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli analyseren met drie gevestigde technieken. Deze methoden helpen onderzoekers individuele en collectieve motiliteit in bacteriën bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant GM118085 en gedeeltelijk door de Robert Welch Foundation (subsidie F-1811 aan R.M.H.).

1. Isolatie van suppressor mutanten in motiliteit-deficiënte stammen
OPMERKING: Gebruik deze methode als een brede 'catch-all' om de algemene aard van het motiliteitsdefect te identificeren.
<ol><li>Zacht-agar plaatvoorbereiding OPMERKING: Soft-agar, ook wel motiliteit- of zwem-agar genoemd, is een laag percentage agar (~0,2-0,35% w/v), lang gebruikt om chemotaxis31,32te meten.<ol>
<li>Voeg 3 g bacto-agar (0,3% w/v) en 20 g LB toe aan een maatkolf met ronde bodem van 2 L. Voeg 1 L ddH2O (dubbel gedestilleerd water) toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.</li>
		<li>Laat afkoelen met zachte agitatie met behulp van de staaf/plaat zoals hierboven. Wanneer de temperatuur ongeveer 50 °C bereikt, giet dan 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat de gesmolten agar ten minste 1 uur op zijn plaats zetten met deksel, voor gebruik binnen 16 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Kweekvoorbereiding, inenting en isolatie van suppressormutanten OPMERKING: E. coli ingeënt in het centrum van voedingsrijke media gestold met zachte agar consumeren voedingsstoffen lokaal, waardoor een nutriëntengradiënt ontstaat die ze volgen. Als ze naar buiten bewegen, verschijnen gedefinieerde 'ringen' (figuur 1A), die gerelateerd zijn aan specifieke chemoattractanten waarop de bacteriën reageren. Defecten in het chemotaxis-systeem of structurele componenten van de flagellamotor kunnen de prestaties in deze test in gevaar brengen. Vaak ontstaan mutanten met een motiliteitsvoordeel tijdens de screening en kunnen ze worden gezien vanaf enkele of meerdere punten langs de rand van de ring, van waaruit ze 'uitfakkelen' (figuur 1C). Men zal merken dat de buitenste rand van het zwemfront gemakkelijk contrasteert met de ongekoloniseerde maagdelijke zachte agar.<ol>
<li>Kweek 's nachts culturen van de gewenste motiliteitsdeficiënte stam in 5 ml Lennox Bouillon (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl, Tafel van Materialen) bij 30 °C met horizontaal schudden (220 r.p.m.). De volgende dag, subcultuur (1:100 verdunning) in verse LB, groeiend onder dezelfde omstandigheden tot exponentiële fase (OD600 van 0,6).</li>
		<li>Ent 6 μL van de cultuur in het midden van een zachtzwamplaat (1.1) met behulp van een pipet en duw de geladen steriele punt in de agar om de inhoud voorzichtig te verdrijven. Breng over naar 30 °C en incubeer (figuur 1B), totdat de beweeglijkheid "flares" zichtbaar is, afkomstig van het inentingspunt of de periferie van de motiliteitsringen, meestal in 24-36 uur (figuur 1C). OPMERKING: Bij motiliteitstesten moet een wilde stam naast de mutante isolaten worden ingeënt ter vergelijking. Deze wilde stam toont de karakteristieke concentrische chemotactische ringen(figuur 1A)en vult de plaat binnen 8-10 uur.</li>
		<li>Gebruik een steriele draadlus om de cellen uit het 'flare'-gebied te tillen en streep om enkele kolonies te zuiveren op een LB harde agarplaat (LB bereid zoals hierboven, gestold met 15 g/L bacto-agar).</li>
		<li>Pluk enkele kolonies uit de streepplaat met behulp van een steriele draadlus en zuiver opnieuw door strepen voor enkele kolonies om isolatie van een 'zuiver' kolonieisolaat te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestiging en karakterisering van suppressor mutanten
	<ol>
<li>Bevestig dat de geïsoleerde suppressor mutant(en) de beweeglijkheid hebben hersteld. Bereid zachte agarplaten (1.1) en culturen voor op soorten van belang (zoals in 1.2.1), met inbegrip van wilde-type en de beginnende 'motility-deficiënte' stam ter vergelijking.</li>
		<li>Ent de platen (zoals in 1.2.2) en incubeer bij 30 °C gedurende 8-10 uur.</li>
		<li>Noteer de diameter van de buitenste ring (rand van de cirkel) en vergelijk om vast te stellen welke van de isolaten de beweeglijkheid aanzienlijk hebben hersteld. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om platen te fotograferen tijdens het verloop van het experiment. Gebruik voor het beste resultaat een "emmer licht" apparaat30, waarbij een digitale camera boven een lichtbron is gemonteerd voor een betere verlichting om de diameter van de zwemkolonie te meten en te onderscheiden van niet-colonized agar.</li>
		<li>Onderworpen geverifieerde isolaten naar WGS indien nodig, waardoor voldoende 'sequentiedekking' mogelijk is om de mutaties die de wild-type functie herstelden positief te identificeren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kwantificeren van flagella motorisch gedrag via celgebonden
OPMERKING: Gebruik deze methode wanneer normaal loopgedrag (chemotaxis) in gevaar blijkt te zijn.
<ol><li>
Cultuurvoorbereiding en flagella scheren
	<ol>
<li>Bereid een exponentiële fasecultuur voor van de interessestam zoals beschreven in stap 1.2.1.</li>
		<li>Pellet 10 ml cellen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 3 minuten voordat u deze in 10 ml met filter gesteriliseerde motiliteitsbuffer (MB; 10 mM kaliumfosfaatbuffer [0,0935 M K2HPO 4 , 0,0065 M KH 2 PO 4 , pH 7,0], 0,1 m MH [0,0935 M K 2 HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0] OPMERKING: MB ondersteunt beweeglijkheid, maar ondersteunt geen bacteriële groei</li>
		<li>Herhaal stap 2.1.2 nog twee keer voordat u de uiteindelijke pellet in 1 ml MB opnieuw opgeeft.</li>
		<li>Breng de celsuspensie over in een spuit van 1 ml en bevestig een 23G-naald aan het uiteinde. Monteer een identiek spuit-/naaldapparaat en bevestig de twee aan elkaar via 6 inch polyethyleen buizen (binnendiameter van 0,58 mm) strak omhuld over elke naaldpunt.</li>
		<li>Scheer de flagella (ze zijn breekbaar en breken gemakkelijk) door de celsuspensie voorzichtig 50x heen en weer van de ene spuit naar de andere te brengen, met 1 minuut pauzes tussen elke 10 passen.</li>
		<li>Centrifugeer de geschoren cellen gedurende 3 minuten op 2.000 x g en resuspend in een eindvolume van 500 μL MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diavoorbereiding en celgebonden
	<ol>
<li>Bereid een celfixatiekamer voor door een afdeklip van 18 mm x 18 mm over een glazen microscoopschuif van 3 inch x 1 inch x 1 mm te stapelen, gescheiden door dubbelzijdige tape (afbeelding S1).</li>
		<li>Spoel de kamer door met 0,01% (m/v) polylysineoplossing door op de bovenkant van de kamer aan te brengen. Kantel de onderrand (de afdeklip vlak met de microscoopschuif) op een taakwisser (tissuepapier) om de oplossing door de kamer te trekken (afbeelding S1). Incubeer vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur.</li>
		<li>Was de kamer driemaal met 40 μL MB met behulp van zoals beschreven in stap 2.2.2</li>
		<li>Voeg 40 μL van de geschoren celsuspensie (hierboven voorbereid) toe aan de bovenkant van de kamer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om cellen aan de afdeklip te laten hechten.</li>
		<li>Spoel de kamer voorzichtig door met 40 μL MB zoals in 2.2.3 om niet-vastgemaakte cellen te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celrotatieregistratie en kwantificering
	<ol>
<li>Breng de microscoopschuif geladen met vastgebonden cellen over naar het microscoopstadium.</li>
		<li>Scan met behulp van fasecontrastmicroscopie en een 100x-doelstelling de populatie op cellen die op hun plaats zijn bevestigd en roteren op een enkele as, d.w.z. vloeiende rotaties op een vast punt in plaats van te presenteren onder een hoek waarin de cel in en uit focus beweegt (Video 1).</li>
		<li>Gebruik een commerciële microscoop en bijbehorende camera. Open de bijbehorende software, zorg ervoor dat cellen van belang scherp zijn en klik op video-acquisitie om de celrotatie gedurende één minuut op te nemen (met 10 frames per seconde of hoger).</li>
		<li>Kwantificeer bij het afspelen van video het aantal volledige rotaties per minuut en het aantal keren dat de cel van richting verandert (schakelfrequentie). OPMERKING: Rotatiesnelheden en schakelfrequentie kunnen te snel zijn om met het oog te meten, dus het wordt aanbevolen om videosoftware te gebruiken die langzame / fijne weergave biedt, of een geautomatiseerd softwaresysteem gebruikt om rotatiepatronen te kwantificeren33. Een alternatief zou zijn om de viscositeit van de MB te verhogen met behulp van methylcellulose (of een soortgelijk middel) om de rotatie van snellere bacteriën te vertragen en op te lossen of te compenseren wanneer camera's met lage framerates in gebruik zijn.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.2 met biologische replica's om een weergave van de populatie van belang samen te stellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Voorbereiding van zwermen in een grensoverschrijdingstest
OPMERKING: Gebruik deze methode om de impact van een mutatie of aandoening op de beweeglijkheid van de groep te beoordelen. Zwerm-agar verwijst naar agar waar het percentage meestal hoger is dan dat van soft-agar. In zachte agar (0,3 %) zwemmen cellen individueel in de agar. In zwermzwam (0,5% en hoger) bewegen cellen als een groep op het oppervlak. Hoewel zwermplaten hier moeten worden gebruikt, hebben zwemplaten een langere houdbaarheid en kunnen ze meerdere dagen worden gebruikt. Onze persoonlijke voorkeur is om te gebruiken in 1-2 dagen.
<ol><li>
Voorbereiding van zwermzwam
	<ol>
<li>Voeg 5 g Eiken agar (0,5% w/v) en 20 g LB toe aan een ronde bodemkolf van 2 L. Voeg 1 L ddH2O toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.</li>
		<li>Laat afkoelen met zachte agitatie om luchtbellen te voorkomen met behulp van de staaf / plaat zoals hierboven. Voeg bij ongeveer 50 °C met filtersterilisatie gesteriliseerde glucose toe voor een eindconcentratie van 0,5 %.</li>
		<li>Giet 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat het op kamertemperatuur gedurende ten minste 14 uur en niet meer dan 20 uur instellen. Niet bewaren voor toekomstig gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inenting en incubatie van zwermplaten
	<ol>
<li>Ent 6 μL van een mid-exponentiële cultuur (bereid zoals in 1.2) door bovenop de agar te spotten.</li>
		<li>Laat het deksel 5-10 minuten staan en vervang wanneer het entmateriaal in het agaroppervlak is opgedroogd.</li>
		<li>Incubeer bij 30 °C gedurende 8 uur. Vermijd de verleiding om de zwermvoortgang te inspecteren door het deksel te verwijderen, omdat dit zal bijdragen aan het drogen van de agar en zwermen zal verminderen. OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van het fenotype van de stam. Sommige geïsoleerde mutaties kunnen het zwermvermogen belemmeren en vereisen een verminderd percentage agar of een langere incubatieperiode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van grensoverschrijdende testplaten OPMERKING: Deze test maakt gebruik van een gemodificeerde petrischaal, waarbij een plastic scheiding (rand) twee kamers creëert in plaats van één (figuur 2A). Elke kamer kan onafhankelijk van de andere worden voorbereid en biedt verschillende voorwaarden voor zwermen, voordat de twee worden 'verbonden'. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan de eerste kamer (links aangeduid) worden bereid met zwemagar (0,3% w/v) of zwermagar (0,5% w/v) van waaruit de bacteriën over de grens kunnen migreren naar de rechterkamer met zwermagar +/- elk vereist supplement of uitdaging (bijv. antibiotica). Migratie op een van beide agars wordt meestal gemeten / vergeleken door de breedste diameter van bacteriële kolonisatie (van rand tot rand) vanaf het oorspronkelijke punt van inenting vast te houden.<ol>
<li>Bereid zwem agar voor zoals beschreven in 1.1 indien nodig.</li>
		<li>Bereid zwermzwam voor zoals beschreven in 3.1.</li>
		<li>Giet ~30 ml zwermzwam (eventueel met de gewenste suppletie) in de rechterkamer van een petrischaal met twee compartimenten (100 mm x 15 mm), tot het punt waar het waterpas staat met de plastic scheidingswand tussen de kamers, maar niet naar links overloopt (Afbeelding 2B).</li>
		<li>Nadat de agar is uitgehard, vult u de linkerkamer met ~30 ml zwem- of zwermagar, opnieuw tot het contactpunt met de plastic scheiding (figuur 2C). Voordat de agar wordt ingesteld, gebruikt u een steriele pipetpunt om de agar voorzichtig over de rand te slepen om de twee zijden te verbinden met een ~ 1 mm hoge agarbrug die de hele lengte van de scheiding overspant (Afbeelding 2D).</li>
		<li>Laat de plaat drogen bij kamertemperatuur (3.1). OPMERKING: Een alternatieve methode voor het maken van een brug is om de linkerkameragar te laten drogen en vervolgens langzaam ~ 100 μL gesmolten zwermzwam langs de plastic verdeler te pipetten om de twee kamers te overbruggen (3.4). Ent de platen op de linkerkamer zoals hierboven beschreven voor zwemmen (1.2.2) of zwerm (3.2) agar, voordat u gedurende 12-16 uur op 30 °C broedt, of totdat zwermen voldoende vooruitgang hebben geboekt boven de rechterkamer om vergelijkingen tussen interessestammen mogelijk te maken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De isolatie en karakterisering van suppressormutaties hebben met succes bijgedragen tot het identificeren van belangrijke componenten van het chemotaxis-systeem35,36,37, evenals de motormachines zelf38,39,40. Tijdens het gebruik van Protocol 1 is het belangrijk om meerdere onafhankelijke replica's op te nemen om de isolatie van een groo...

Bacteriën gebruiken veel aanhangsels voor beweging en verspreiding in hun ecologischeniches 1. Flagella-gedreven beweeglijkheid is de snelste van deze, bevordert de kolonisatie van gunstige plaatsen als reactie op omgevingssignalen en draagt aanzienlijk bij aan het pathogene vermogen van sommige soorten2,3. Flagellated bacteriën kunnen individueel zwemmen in bulk vloeistof, of zwerm als een collectief over een semi-solide oppervlak4. Extracellulaire flagella hechten zich aan en worden aangedreven door roterende motoren ingebed in het membraan, die de kracht van ionengradiënten benutten om koppel te genereren dat rotatie1,2,4,5,6,7,8veroorzaakt. In E. coli, waarvan de motoren op een constant koppel9draaien, kan het motorvermogen worden gecategoriseerd in termen van rotatiesnelheid en schakelen van de rotor tussen de richting tegen de klok in (CCW) en de richting met de klok mee (CW). CCW-rotatie bevordert de vorming van een coherente flagellarbundel die de cel naar voren stuwt (lopen), terwijl een voorbijgaande schakelaar in rotatierichting (CW) ervoor zorgt dat de bundel gedeeltelijk of volledig wordt gedemonteerd10, en de cel zijn zwemrichting heroriënteert (tuimelen). E. coli loopt meestal een seconde en tuimelt voor een tiende van een seconde. De schakelfrequentie van de rotor of "tumble bias" wordt geregeld door het chemotaxis-signaleringssysteem, waarbij transmembrane chemoreceptoren externe chemische signalen detecteren en via fosforelay naar de flagellaire motor overbrengen om de runs uit te breiden als reactie op attractanten, of ze onderdrukken als reactie op giftige chemicaliën11,12. Zwemmotiliteit wordt uitgevoerd in 0,3% zachte agar.
Tijdens het zwermen navigeren bacteriën op een semi-vast oppervlak als een dicht collectief, waar groepen bacteriën in een continue wervelende beweging2,13,14,15stromen. E. coli zwermen vertonen veranderde chemosensorische fysiologie (lagere tumble bias), hogere snelheden en een hogere tolerantie voor antimicrobiële stoffen boven cellen zwemmen in bulk vloeistof16,17. Zwermers variëren in hun inzet van een overvloed aan strategieën die beweging helpen, waaronder oppervlakteactieve productie, hyperflagellatie en celverlenging2. Zwermen biedt bacteriën een concurrentievoordeel in zowel ecologische als klinische omgevingen18,19,20. Er zijn twee categorieën zwermbacteriën: gematigde zwermen, die alleen kunnen zwermen op media gestold met 0,5-0,8% agar, en robuuste zwermen, die over hogere agarconcentraties kunnen navigeren21.
Er bestaan verschillende testtesten om de zwemmotiliteit en de regelgeving ervan te ondervragen. Wanneer aangetast door mutaties of omgevingsomstandigheden, biedt de beweeglijkheid zelf een sterke selectie voor het identificeren van gain-of-function suppressor mutaties. Deze suppressors kunnen echte revertanten van de oorspronkelijke mutatie zijn, of pseudo-revertanten, waarbij een tweede mutatie de functionaliteit herstelt. Dergelijke mutanten kunnen worden geïdentificeerd door hele genoomsequencing (WGS). Een alternatief voor onbevooroordeelde suppressorselectie is een bevooroordeelde gerichte mutagenesestrategie (bijv. PCR mutagenese). Deze methoden werpen vaak licht op de functie of milieuregelgeving van het motiliteitsapparaat. Als het doel is om de motorische functie te bestuderen, dan is het herstel van wild-type motiliteit zoals gemeten in zachte agar mogelijk niet noodzakelijkerwijs wijzen op herstel van wild-type motor output. De cel-tethering assay, waarbij cellen door een enkel flagellum aan een glasoppervlak worden bevestigd en de rotatie van het cellichaam vervolgens wordt gecontroleerd, kan de eerste keuzetest zijn voor het beoordelen van motorisch gedrag. Hoewel er nu meer geavanceerde methodologieën beschikbaar zijn om motorische eigenschappen te monitoren , beperken de vereiste opstelling en toepassing van softwarepakketten voor bewegingsanalyse het wijdverbreide gebruik ervan22,23,24,25. De cel-tethering assay vereist alleen dat de flagella wordt geschoren, waardoor de korte filamenten aan een glazen dia kunnen worden gehecht, gevolgd door het filmen van de rotatie van het cellichaam. Hoewel de geregistreerde motorische snelheden laag zijn in deze test vanwege de hoge belasting die het cellichaam uitoefent op het flagellum, heeft deze test niettemin bijgedragen aan waardevolle inzichten in chemotactische reacties26,27,28,29, en blijft een geldig onderzoeksinstrument zoals hieronder besproken.
Zwermmotiliteit stelt onderzoekers voor een andere uitdaging. Selectie van gain-of-function suppressors werkt alleen in zwermen die overvloedige oppervlakteactieve stoffen produceren en gemakkelijkzwermen 13. Oppervlakteactieve niet-producenten zoals E. coli zijn kieskeurig met betrekking tot de keuze van agar, mediasamenstelling en vochtigheid van het milieu2,13,14,21. Zodra zwermcondities zijn vastgesteld, is de grensovergangstest17 een nuttige methodologie om het vermogen van een zwerm te ondervragen om door nieuwe / zware omstandigheden te navigeren. Hoewel de onderstaande protocollen betrekking hebben op E. coli, kunnen ze gemakkelijk worden aangepast voor toepassing bij andere soorten.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential voor E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materials en apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscoopbeeldsoftware (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Of gelijkwaardige software voor gebruikte microscoop</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Dubbelzijdig plakband</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscoopglazen 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Elke rechtopstaande of omgekeerde fasemicroscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Voor zachte-agar-tests</td></tr><tr><td>Polyethyleen Nebulizer capillaire buis (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Ronde Petrischaal met 2 compartimenten</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>Voor grensoverschrijdende tests</td></tr><tr><td>Veiligheidshypodermische naalden (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Steriele spuit - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/weefseldoekjes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Of gelijkwaardige wegwerp weefseldoekjes</td></tr><tr><td>VWR micro dekglas 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Of gelijkwaardige microscoopcamera</td></tr></tbody></table>

onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Beweeglijkheid is cruciaal voor het overleven en succes van veel bacteriesoorten. Er bestaan veel methoden om de beweeglijkheid te benutten om signaleringsroutes te begrijpen, om de functie en assemblage van flagellar-onderdelen op te helderen en om bewegingspatronen te onderzoeken en te begrijpen. Hier demonstreren we een combinatie van drie van deze methodieken. Motiliteit in zachte agar is de oudste en biedt een sterke selectie voor het isoleren van gain-of-function suppressor mutaties in motiliteit-aangetaste stammen, waar motiliteit wordt hersteld door een tweede mutatie. De cel-tethering techniek, eerst gebruikt om de roterende aard van de flagellar motor aan te tonen, kan worden gebruikt om de impact van signaleringseffectoren op de motorsnelheid en zijn vermogen om van draairichting te veranderen te beoordelen. De "grensovergang" test is recenter, waar zwemmende bacteriën kunnen worden klaargekmeld om over te schakelen naar collectief bewegen als een zwerm. In combinatie vertegenwoordigen deze protocollen een systematische en krachtige benadering van het identificeren van componenten van de motiliteitsmachines en het karakteriseren van hun rol in verschillende facetten van zwemmen en zwermen. Ze kunnen gemakkelijk worden aangepast om de beweeglijkheid bij andere bacteriesoorten te bestuderen.

De isolatie van pseudo-revertanten in een E. coli stam waarvan de beweeglijkheid wordt aangetast door hoge niveaus van het signaalmolecuul c-di-GMP, werd gedetailleerd beschreven in recent werk van ons lab34. Deze stam (JP1442) had twee mutaties: ΔyhjH en ΔycgR. YhjH is het meest actieve fosfodiësterase dat c-di-GMP in E. coliafbreekt. Afwezigheid van YhjH leidt tot verhoogde c-di-GMP niveaus en remming van de beweeglijkheid. YcgR is een c-di-GMP effector. In co...

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

De protocollen die in deze video worden gedemonstreerd, kunnen in elk laboratorium ter wereld worden gereproduceerd. In combinatie vertegenwoordigen ze een systematische en krachtige benadering voor het karakteriseren van bacteriële flagellummobiliteit. Mobiliteit is een cruciaal aspect van bacteriële verspreiding en overleving, en deze drie methoden zijn nuttige en krachtige hulpmiddelen voor de analyse van zowel individuele als collectieve mobiliteit.De hier beschreven technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast om een reeks bacteriën te bestuderen, inclusief die welke als pathogene aard zijn geclassificeerd. Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, moet u er rekening mee houden dat als de zwermplaten verkeerd worden bereid, inconsistent gedrag of patronen die collectieve beweging nabootsen maar deze niet echt weerspiegelen, kunnen worden waargenomen. Laat overnacht culturen van de gewenste mobiliteit-deficiënte stam groeien in vijf milliliter Lennox-bouillon bij 30 graden Celsius met horizontaal schudden, en subcultuur in vers LB onder dezelfde omstandigheden tot exponentiële fase.Inoculeer zes microliters van de cultuur in het midden van een zachte agarplaat, en duw de geladen pipettip in de agar om de inhoud voorzichtig te verdrijven. Incubeer de plaat bij 30 graden Celsius tot mobiliteitflares duidelijk zijn, uitstralend vanaf het inoculatiepunt of de rand van de mobiliteitsringen. Gebruik een steriele draadlus om de cellen uit het flaregebied te tillen en ze uit te strekken op een LB harde agarplaat om enkele kolonies te zuiveren.Om te bevestigen dat de geïsoleerde suppressormutanten de mobiliteit hebben hersteld, kweek ze op zachte agarplaten voor stammen van belang. Neem de wildtype en de oorspronkelijke mobiliteit-deficiënte stam op voor vergelijking. Na het incuberen van de kweekplaten bij 30 graden Celsius gedurende acht tot 10 uur, noteer de diameter van de buitenste ring om vast te stellen welke van de isolaten de mobiliteit aanzienlijk hebben hersteld.Bereid een exponentiële fasecultuur van de stam van belang voor. Pellet vervolgens 10 milliliter cellen door centrifugatie bij 2000 keer G gedurende drie minuten, en schud ze opnieuw op in 10 milliliter filtergesteriliseerde mobiliteitsbuffer, of MB. Was de cellen nog twee keer in MB en schud ze opnieuw op in één milliliter MB na de laatste centrifugatie. Breng de celsuspensie over in een spuit van één milliliter en bevestig een 23 gauge naald aan het uiteinde.Assembleer een identiek spuit- en naaldapparaat en bevestig de twee aan elkaar via zes centimeter polyethyleenbuis, strak omwikkeld over elke naaldtip. Scheer de flagella door de celsuspensie voorzichtig heen en weer te leiden van de ene spuit naar de andere 50 keer met pauzes van één minuut tussen elke 10 doorvoeren. Centrifugeer vervolgens de gescheurde cellen bij 2000 keer G gedurende drie minuten en schud ze opnieuw op in 500 microliter MB. Om een ​​celfixatiekamer voor te bereiden, stapelt u een 18 bij 18 millimeter dekglas over een glazen microscoopglas gescheiden door dubbelzijdig plakband.Voeg 0,01% polylysine-oplossing toe aan de bovenkant van de kamer om deze te spoelen. Kantel de onderkant op een taakdoek om de oplossing door de kamer te trekken, en laat hem vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur staan. Was de kamer drie keer met 40 microliter MB en voeg 40 microliter gescheurde celsuspensie toe aan de bovenkant van de kamer.Laat de cellen 10 minuten aan het dekglas hechten, spoel de kamer vervolgens voorzichtig met 40 microliter MB om niet-gehechte cellen te verwijderen. Breng de schuif over naar de microscooptafel en gebruik fasecontrastmicroscopie en een 100X objectief om de populatie te scannen op cellen die op een enkele as worden gefixeerd en ronddraaien. Open de microscoopsoftware, zorg ervoor dat de cellen scherp staan en begin met video-acquisitie om de celrotatie gedurende één minuut op te nemen.Vanuit de videoweergave, kwantificeer het aantal volledige rotaties per minuut en het aantal keren dat de cel van richting verandert. Inoculeer zes microliters van een mid-exponentiële cultuur door het op de agar aan te brengen. Laat het deksel vijf tot 10 minuten open staan en vervang het wanneer het inoculum is opgedroogd in het agaroppervlak.Vervolgens incubeer de plaat gedurende acht uur bij 30 graden Celsius. Giet ongeveer 30 milliliter zwermagar in de rechterkamer van een dubbele compartiment petrischaal, zorg ervoor dat het vlak is met de kunststof verdeler tussen de kamers, maar niet overloopt in de linkerkant. Nadat het agar is uitgehard, vult u de linkerkamer met ongeveer 30 milliliter swim of zwermagar.Voordat het hard wordt, gebruik een steriele pipettip om de agar voorzichtig over de rand te drijven en verbind de twee zijden met een agarbrug van één millimeter hoog die de hele lengte van de verdeler overspant. Laat de plaat op kamertemperatuur drogen. Let op de diepte van de agar terwijl u hem giet.Als het te hoog is, zal het overlopen. Als het te laag is, kunt u de twee kamers niet met elkaar verbinden. Dit protocol werd gebruikt om pseudo-revertantflares te isoleren in een dubbele mutante E.coli-stam met verminderde mobiliteit.Een van deze revertanten vertoonde mobiliteit dicht bij de wildtype. De dubbele mutante ouder en isogene wildtype-stam werden als controles gebruikt. Video-opnamen werden geanalyseerd om rotaties per minuut te berekenen, en de fractie van de tijd dat motoren in een klokrichting draaien, of tumble-bias.De yhjH-mutant vertoonde een paar rotaties per minuut en een lagere tumble-bias vergeleken met wildtype E.coli, zoals verwacht. Zowel de dubbele mutant als zijn suppressor vertoonden motorgedrag vergelijkbaar met wildtype. De border-crossing-assay werd gebruikt om de capaciteiten van de wildtype en de suppressorisolaat te vergelijken om te zwermen en vervolgens de grens over te steken en te zwermen op agar aangevuld met kanamycine.Beide stammen vertoonden vergelijkbare zwermraten vanaf een identiek inoculatiepunt, maar het kruispunt van de zwerm naar de antibioticumkamer was consistent groter voor de wildtype dan voor de suppressor. Het verschil tussen de

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Source: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a swarming assay using bacteria that express green fluorescent protein to observe surface motility on soft agar. Time-lapse imaging captures coordinated expansion and tendril formation, highlighting bacterial surface motility.

Swarming Assay for Visualizing Bacterial Surface Motility

Source: Pioli, R., et al., Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the method of capturing single fluorescently tagged Escherichia coli (E. coli) cells in microfluidic traps using a carbon-free suspension and controlled flow, followed by nutrient addition to trigger growth and fluorescence imaging of microcolonies.

Microfluidic Patterning and Fluorescence-Based Tracking of Single-Cell Bacterial Growth

Source: Scheidweiler, D., et al. Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the use of a microfluidic device to quantify bacterial motility through a porous matrix composed of randomly arranged pillars. Fluorescently labeled bacteria are introduced into the device, imaged via microscopy as they move through the porous matrix into the observation channel, and analyzed...

Assessing Bacterial Motility Using a Microfluidic Device

In this video, we perform an in vitro motility assay to analyze the actin-myosin interactions. The gliding movement of actin filaments on immobilized myosin molecules is visualized using fluorescence microscopy.

Inverted Motility Assay: An In Vitro Technique to Visualize Myosin Movement on Immobilized Actin Filaments

Zwermen motiliteit wordt beïnvloed door fysische en omgevingsfactoren. We beschrijven een tweefasenprotocol en richtlijnen om de uitdagingen die gewoonlijk worden geassocieerd met zwermtestvoorbereiding en gegevensverzameling te omzeilen. Een macroscopische beeldtechniek wordt gebruikt om gedetailleerde informatie over zwermgedrag te verkrijgen die niet wordt geleverd door huidige analysetechnieken.

Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen

Recente bevindingen suggereren dat bacteriële flagellaire motoren een verscheidenheid aan omgevingssignalen detecteren en als reactie hierop veranderen. De hier besproken bead-assays zullen naar verwachting helpen bij het verklaren van de rol van verandering in cellulaire aanpassing aan omgevingsstressors.

Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Hier presenteren we een protocol om bacteriële motiliteit te detecteren op basis van een kleurreactie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren en nauwkeuriger is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.

Bacteriële beweeglijkheid visualiseren op basis van een kleurreactie

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het identificeren van genetische factoren die betrokken zijn bij verschillende soorten motiliteiten in Pseudomonas aeruginosa.

High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

Leer flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli analyseren met drie gevestigde technieken. Deze methoden helpen onderzoekers individuele en collectieve motiliteit in bacteriën bestuderen.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Meer video's verkennen