Name: Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer kwantitatieve methoden voor het scoren van neuronale aggregaat- en organel-extrusie via exophergenese in C. elegans. Deze technieken ondersteunen onderzoek naar afvalverwijdering in neuronen en neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de volgende NIH-subsidies: R01AG047101 en R37AG56510. Leden van de Driscoll en Grant labs hebben uitgebreid bijgedragen aan de ontwikkeling en finetuning van beschreven protocollen, met rigoureuze experimenten en sterke communicatie.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

De karakterisering van de in vivo moleculaire mechanismen van aggregaat en organelle eliminatie in de vorm van grote exophers staat nog in de kinderschoenen. Vragen over de aanwijzing van ladingen voor uitzetting, de gepolariseerde verzameling van deze ladingen in de cel, de regulering van het besluit om exophers te genereren, de machines die extrusies bemiddelen, en de interactie van exophers met de degradatieve machines in een naburige cel moeten allemaal worden aangepakt. Bovendien is de in vivo visualisatie van buisverbindingen die biologische materialen kunnen passeren die calcium, aggregaten en mitochondriën omvatten, op zichzelf interessant en ondergestudied. Vragen van waarom bepaalde cellen zijn meer vatbaar voor exopher productie dan anderen zijn ook onopgelost, maar kan beginnen te worden genetisch ontleed met de benaderingen beschreven in dit protocol.
Beschreven in detail in dit protocol zijn de benaderingen voor het bereiken van reproduceerbare scoren van exopher productie, met aandacht voor het onderscheiden van exophers van nabijgelegen cel soma's, timing van analyses om piek van exopher productie vast te leggen, en strikte controle van de groeiomstandigheden om onbedoelde spanningen die exopher niveaus kunnen moduleren elimineren. Zowel onderscheid van de grote vroege exopher, of de "sterrennacht' dispersie in de omliggende hypodermis kan worden gekwantificeerd als bewijs van exopher productie. Dat gezegd zijnde, neuronen uitdrukken mCherry onder basale omstandigheden worden meestal geassocieerd met 5-25% van de neuronen van een specifiek type produceren van een exopher. Gecontroleerde invoering van stress voorwaarden kunnen worden toegepast om exopher productie te verhogen tot detectie zo hoog als 90% van de neuronen produceren extrusies, met name nuttig voor genetische of farmacologische schermen voor modifiers.
Bij menselijke neurodegeneratieve ziekte kunnen grote aggregaten overgaan van zieke neuronen naar naburige cellen om de verspreiding van pathologie te bevorderen. Het exopher mechanisme kan transpireren via een geconserveerd mechanisme dat wordt gebruikt voor geaggregeerde extrusie over phyla. Het definiëren van de in vivo moleculen die ofwel de efficiëntie van dit proces te verbeteren (beschouwd als meer effectieve proteostase controle) of blokkeren kan worden gebruikt om het ontwerp van nieuwe strategieën voor de bestrijding van meerdere neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden. Als zodanig kan het hier beschreven protocol worden gebruikt voor klassieke genetische mutagenesisschermen, genoombrede RNAi-schermen die systematisch genen afbreken om versterkers en suppressors te identificeren, of voor medicijninterventiestudies die kandidaat-farmacologische modifiers van dit proces identificeren. De aanpak is eenvoudig, hoewel enigszins moeizaam. Exophers zijn zo groot dat ze kunnen worden bekeken met een hoge vergroting ontleden microscoop. Nog steeds, C. elegans neuronen zijn relatief klein en kijken naar hun organellen of hun membranen vereisen een hogere macht confocale beelden en is een langzaam proces. Opties voor een hogere doorvoer kunnen gepaard gaan met hoge gehalte imaging benaderingen in multi-well plaat formaat.
De toepassing van een gestandaardiseerde benadering van exopher scoren moet ten grondslag liggen aan een gecoördineerde genetische dissectie van het proces waardoor neuronen cellulaire puin kunnen organiseren en elimineren.

De neurotoxische uitdagingen van aggregaten en disfunctionele mitochondriën worden al lang beschouwd als celon intrinsiek, maar meer recentelijk is duidelijk geworden dat verkeerd gevouwen menselijke ziekte-eiwitten afkomstig van één neuron zich ook kunnen verspreiden naar naburige cellen, waardoor pathologie1wordt bevorderd. Ook zoogdier mitochondriën kan worden verzonden uit de cel van hun oorspronkelijke productie voor transcellulaire afbraak2 of voor de redding van mitochondriale populaties in uitgedaagd naburige cellen3. Vesicles van verschillende grootte zijn over het algemeen waargenomen om cellulaire materialen over te dragen aan naburige cellen of naar vloeibare omgeving4. Sommige geëxtrudeerde akeltjes benaderen de grootte van de gemiddelde neuronale soma (gemiddelde touch neuron soma ~ 6 μm) en is geschikt voor grote aggregaten en organellen.
Een treffend voorbeeld van grote vesicle extrusie die eiwitaggregaten en organellen kan dragen komt voor in C. elegans touch receptor neuronen die een hoog kopieernummer verslaggever construeren codering een schadelijke aggregatie-gevoelige, degradatie-resistente mCherry5. Extrusies van de aanraakneuronen, exophers genaamd, zijn ~4 μm gemiddelde diameter, selectief omvatten mCherry of andere aggregaten, en worden rechtstreeks geleverd in de naburige hypodermis, die normaal gesproken omringt de touch receptor neuronen. De hypodermis probeert lyssome-gebaseerde afbraak, maar sommige niet-verteerbare inhoud zoals mCherry aggregaten kunnen opnieuw worden geëxtrudeerd door de hypodermis in de vloeistof gevulde pseudokoelom van het dier, waaruit de mCherry kan worden opgenomen door afgelegen aaseters cellen genaamd coelomocyten voor langdurige opslag (Figuur 1, Figuur 2)5.
De grote geëxtrudeerde exopher vesicles verlaten de cel omringd door touch receptor plasmamembraan en kunnen geaggregeerde menselijke ziekte-eiwitten, mitochondriën en lysosomen bevatten. Het proces van exopher productie lijkt te betrekken sorteren van potentieel giftige soorten (bijvoorbeeld een aggregatie-gevoelige uitgedrukte mCherry is gescheiden van oplosbare, onoffensieve eiwitten zoals GFP die meestal in de neuronale soma blijft). Op deze manier wordt gerichte uitzetting van de bedreigende entiteiten bereikt door het neuron5. Een proteostase uitdaging, zoals stress veroorzaakt door autofagie knockdown, MG132-gemedieerde proteasome remming, of transgene expressie van menselijke ziekte eiwitten zoals de ziekte van Huntington-geassocieerde uitgebreide polyglutamine Q128 of de ziekte van Alzheimer-betrokken fragment Aβ1-42, kan het aantal neuronen die exophers5produceren verhogen.
Zoals exophers zijn pas onlangs gedocumenteerd, wat bekend is van hun biologie verdiensten beschrijving. Exophers werden ontdekt in, en zijn de meest goed bestudeerd in, C. elegans touch receptor neuronen. Er zijn zes C. elegans mechanosensorische touch neuronen die cellichamen verspreid over het lichaam(Figuur 3A)en worden genoemd microtubuli cellen, omdat hun ultrastructuur beschikt over onderscheidende 15 protofilament microtubuli. De touch receptor neuronen zijn de voorste AVM (voorste ventrale microtubule neuron), ALMR, en ALML (voorste laterale microtubuli neuronen rechts en links), de meer centrale PVM (achterste ventrale microtubule neuron), en het achterste PLMR en PLML (achterste laterale microtubuli neuronen rechts en links) in de staart. Interessant is dat de zes touch receptor neuronen produceren exophers in verschillende snelheden, ondanks het uitdrukken van dezelfde offensieve transgene (Figuur 3C). Van de zes mechanosensorische touch receptor neuronen, de ALMR neuron ondergaat exophergenesis vaker dan de andere touch neuronen. Kwantificering van exopher nummers van touch neuronen wordt dus meestal vastgesteld door zich te concentreren op de ALMR.
Exophergenesis is een dynamisch proces dat meestal begint met zwelling van het neuronale cytoplasma(figuur 1A-B). Cellulaire inhoud, organellen of eiwit aggregaten worden verzameld aan de ene kant van de neuronale soma, meestal in de richting van het achterste uiteinde van de ALMR neuron (uit de buurt van de projecterende neurite), de vorming van een pre-exopher domein (PED) (Figuur 1B). Het vroege uitsteeksel wordt waargenomen als de PED naar buiten begint te projecteren, waardoor een herkenbare uitstekende knop ontstaat. De late knop wordt gedefinieerd wanneer de breedste diameter van het pre-exopher domein ongeveer 1/3 groter is dan de diameter van de vernauwing van de soma-exopher hals(figuur 1C). Exophers kunnen worden uitgeworpen in bijna elke richting van de soma, maar de meeste exophers verlaten posteriorly uit het cellichaam en blijven in ongeveer hetzelfde brandpuntsvlak als de oorsprong soma.
De exopher kan zich van de oorspronge soma bewegen aangezien de hals van de knop in een dunne gloeidraad vernauwt. Exophers kunnen via deze gloeidraad aan de soma blijven vastzitten(figuur 1D, pijl)en kunnen later losraken. Cellulaire inhoud zoals calcium, aggregaten en mitochondriën kan via deze gloeidraad worden overgebracht naar de bijgevoegde exopher5,hoewel het grootste deel van geëxtrudeerd materiaal in het exophercompartiment wordt geplaatst door de massale ontluikende gebeurtenis. Exophers worden als volwassen beschouwd wanneer er geen zichtbare verbindingsbuis of dunne gloeidraad is en de exopher volledig gescheiden is van de verzendende soma(figuur 1E).
Exophers geproduceerd door C. elegans aanraken neuronen onmiddellijk tegenkomen de hypodermis, het weefsel dat de aanraking neuron omringt. Meestal lijkt de exopher vesicle te reizen binnen de hypodermis naar achteren naar de staart, en kan vrij ver van de soma voordat exopher inhoud lijken gericht op afbraak (bijvoorbeeld, de afstand kan ~ 100 μm uit de buurt van de soma (Figuur 1F)). De fluorescerende blaasje breekt in veel kleinere blaasjes binnen de hypodermis, het nemen van een verschijning aangeduid als "sterrennacht" (Figuur 1G en figuur 2). In de "sterrenhemel nacht" stadium, punctate fluorescerend materiaal kan worden waargenomen verspreid over de hypodermale syncytium in vele kleinere punten van fluorescentie in vergelijking met de oorspronkelijke eenzame exopher. Starry nacht kan kijken punctate onder lage vergroting en met een hogere vergroting, kan kijken punctate en / of netwerk in de hypodermis. Het fluorescerende signaal van de sterrennacht is meestal dimmer dan de exopher en de neuronaal uitgedrukte fluorescentie(figuur 2B-C). De verspreiding van mCherry in vele punctate vikjes wordt verondersteld om fagogsome rijping en fusie met het endosomale/lysosomale netwerk van de hypodermale cel te impliceren. Sommige exopher materialen zijn waarschijnlijk afgebroken in het hypodermale lysosomale netwerk, maar restsoorten die bestand zijn tegen afbraak (zoals mCherry aggregaten) worden uit de hypodermis gegooid in het pseudocoelom, een vloeistofcompartiment dat cellulair puin kan bevatten. Het fluorescerende materiaal wordt later ingenomen door afgelegen aaseters cellen genaamd coelomocyten (Figuur 2C), die zich kunnen concentreren, opslaan, en opnieuw poging degradatie van mCherry.
Het fenomeen van geaggregeerde extrusie en overdracht lijkt bewaard over phyla, die is gemeld in genetische modellen zoals C. elegans5,,6,7 en D. melanogaster8,9 en in meerdere zoogdiermodellen. Exopher-achtige extrusies zijn gemeld voor zoogdiercellen10, een observatie die suggereert dat geconserveerde mechanismen kunnen liggen bij geaggregeerde en organelle uitzetting. Exopher productie kan dus een bewaard mechanisme van cellulair puin beheer dat een fundamentele, maar voorheen niet-erkende, tak van neuronale proteostase en mitochondriale kwaliteitscontrole vormt, die, wanneer onevenwichtig, actief zou kunnen bijdragen aan neurodegeneratieve ziekte. Identificatie van de moleculen die betrokken zijn bij puin discriminatie en sorteren, vervoer naar een duidelijke subcellulaire locale, extrusie, vorming / splitsing van de buisvormige verbinding die de soma en late exopher, en erkenning van de grote geëxtrudeerde blaasje voor afbraak op afstand door een naburige cel blijven voor toekomstige werkzaamheden. Studies in nematode- en vliegmodellen zullen van cruciaal belang zijn voor het definiëren van mechanismen van verzameling en overdracht van geaggregeerde organen en organellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van onbevooroordeelde genetische benaderingen en krachtige celbiologische instrumenten die door deze modellen worden aangeboden om deelnemende moleculen in fysiologische context te identificeren.
Kritische eerste stappen in het ontcijferen van mechanismen die werkzaam zijn in de exopherbiologie omvatten het definiëren van protocollen voor reproduceerbare in vivo exopher kwantificering. De C. elegans model biedt een bijzonder voordeel voor dergelijke inspanningen, omdat het lichaam transparant is en exophers gemakkelijk kunnen worden waargenomen wanneer ze fluorescerend gelabelde eiwitten of organellen bevatten. Exophers zijn gemeld te worden gegenereerd door C. elegans dopaminerge neuronen PDE en CEP, ASE en ASER sensorische neuronen, en kleurstof-vullende amphid neuronen5. Omdat exophers geproduceerd door touch receptor neuronen zijn het best gekarakteriseerd, de focus hier ligt op het gebruik van touch neuronen voor exopher analyse. De basisbenadering kan echter worden toegepast om de exopherproductie vanuit elke cel te meten. Protocollen voor het detecteren en kwantificeren van exophers geproduceerd door C. elegans touch receptor neuronen die transgenisch uitdrukken mCherry eiwit worden geschetst, met een nadruk op ladingen die kunnen worden gecontroleerd en temporele beperkingen in scoren. Dit artikel definieert benaderingen in de richting van in vivo exopher identificatie, en de kwantificering van milieu-en genetische voorwaarden die exopher productie moduleren. Protocollen benadrukken kritische aandacht voor constante niet-stressomstandigheden voor de bepaling van de productie van basisexopher en voor vergelijkingen tussen genotypen.

<table><tbody><tr><td>95B Scientific CMOS camera</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 µL low retention tips</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipette</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 µL low retention tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% natriumhypochloriet</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugeerbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2 L erlenmeyerkolven</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische pipette</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 µL low retention tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL serologische pipette</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2′-deoxyuridine 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm steriele Petri-schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>absoluut ethanol</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans stam wild type</td><td>Geleeverd door CGC</td><td>N2</td><td>C. elegans stam</td></tr><tr><td>calciumchloride dihydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>dinatriumfosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli stam OP50</td><td>Geleeverd door CGC</td><td>Op50</td><td>E coli stam</td></tr><tr><td>FBS10 Standard microscoop</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 Standard met platenbasis, 100/100 trinoculaire kop en Flip zoom</td></tr><tr><td>glaspipet 270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating Spreaders</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB-medium capsules</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI - Laser Diode Illuminator</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>monokaliumfosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard schuddende incubator</td><td>Infors HT</td><td>INFO28573</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L Centrifuge potten</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipette</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipette</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipette</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen microbeads</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus vloer gemonteerde centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>Herbruikbare ringvormige cytologieslides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP uitgedrukt in aanraakneuronen</td></tr><tr><td>natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Autoclaaf</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry uitgedrukt in aanraakneuronen</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 uitgedrukt in aanraakneuronen</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP uitgedrukt in aanraakneuronen</td></tr><tr><td>ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>autofagiemarker uitgedrukt in aanraakneuronen</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo neuronal aggregaat en organelle extrusie in large exopher vesicles in c. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxiciteit van verkeerd gevouwen eiwitten en mitochondriale disfunctie zijn cruciale factoren die de leeftijd geassocieerde functionele neuronale achteruitgang en neurodegeneratieve ziekte tussen soorten bevorderen. Hoewel deze neurotoxische uitdagingen al lang worden beschouwd als cel-intrinsiek, ondersteunt aanzienlijk bewijs nu dat verkeerd gevouwen menselijke ziekte-eiwitten afkomstig uit één neuron kunnen verschijnen in naburige cellen, een fenomeen dat wordt voorgesteld om pathologie te bevorderen die zich verspreidt bij menselijke neurodegeneratieve ziekte.
C. elegans volwassen neuronen die aggregerende eiwitten uitdrukken, kunnen grote (~4 μm) met mem be omgeven vesicles extruderen die het geaggregeerde eiwit, mitochondriën en lysoosoom kunnen omvatten. Deze grote akels worden "exophers" genoemd en onderscheiden zich van exosomen (die ongeveer 100x kleiner zijn en verschillende biogenese hebben). Het weggooien van cellulair puin in exophers kan optreden door een bewaard mechanisme dat een fundamenteel, maar voorheen niet-herkende, tak van neuronale proteostase en mitochondriale kwaliteitscontrole vormt, relevant voor processen waarbij aggregaten zich verspreiden in menselijke neurodegeneratieve ziekten.
Terwijl exophers zijn meestal bestudeerd bij dieren die hoge kopie transgene mCherry uitdrukken binnen aanraking neuronen, deze protocollen zijn even nuttig in de studie van exophergenesis met behulp van fluorescerende getagde organellen of andere eiwitten van belang in verschillende klassen van neuronen.
Hier beschreven zijn de fysieke kenmerken van C. elegans exophers, strategieën voor hun detectie, identificatiecriteria, optimale timing voor kwantificering, en dierlijke groei protocollen die controle voor spanningen die kunnen moduleren exopher productieniveaus. Samen moeten details van de hier beschreven protocollen dienen om een standaard vast te stellen voor kwantitatieve analyse van exophers in laboratoria. Dit document beoogt als middel in het gebied voor laboratoria te dienen die moleculaire mechanismen proberen uit te werken waardoor exophers worden geproduceerd en waarmee exophers worden gereageerd door naburige en verre cellen.

Dit protocol beschrijft benaderingen voor detectie en kwantificering van grote geaggregeerde en/of organelle extrusies (~4 μm) geproduceerd door C. elegans cellen in de vorm van membraangebonden exofofen. We beschrijven stammen, groeiomstandigheden, scorecriteria, timing en microscopie overwegingen die nodig zijn om dissectie van dit puin uitzetting mechanisme te vergemakkelijken.

Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

We karakteriseren de in vivo mechanismen van aggregaat en organelle extrusie van neuronen via een proces genaamd exophergenesis, slecht begrepen biologie die waarschijnlijk relevant is voor neurodegeneratieve ziekte pathologie verspreid. Deze benaderingen zijn noodzakelijk voor het bereiken van reproduceerbare scoren van geëxtrudeerde neuronale exophers en tonen een platform voor de mechanistische dissectie van cellulaire afval eliminatie via neuronale overdracht naar naburige cellen. Het definiëren van de in vivo mechanismen van hoe neuronen uitwerpen aggregaten daadwerkelijk kan invloed hebben op het ontwerp van nieuwe strategieën om te helpen bij de behandeling van menselijke neurodegeneratieve aandoeningen.Voor basale omstandigheden, huis C.Elegans van dezelfde biologische leeftijd bij een constante temperatuur van 20 graden Celsius. Voor levende beeldvorming van de intracellulaire dynamiek en kenmerken van exophergenese, plaats tot 20 dieren op een agarospad op een glazen microscoopplaat en immobiliseer de dieren. Plaats voorzichtig een afdekking slip over de verlamde wormen en plaats de dia op het podium van een confocale fluorescentie microscoop.Gebruik een 10 tot 40x doelstelling om het gewenste Z-vlak in Brightfield te identificeren, waarbij aantekeningen worden gemaakt van de positionering van de worm, de kop staartoriëntatie en de vulva-locatie, die oriëntatiepunten zijn voor latere neuronale en exopher-identificatie. Verblijf in hetzelfde Z-vlak, overschakelen naar widefield fluorescentie bekijken op 10 tot 40x voor de gekozen cytosolic verslaggever, en scroll binnen de Z-as om de diepte van het dier en de fluorescentie expressie in het brandpuntsvlak te observeren. De kop zal een fluorescerende zenuwring hebben, en de meer puntige staart zal een tot twee zichtbare achterste zijwaartse aanraking neuron somas bevatten.Hogere vergroting met een 63x lens kan helpen om de zenuwring, neuronale processen, en soma lichamen te identificeren. Het is eerst nuttig om de zenuwring in het hoofd van het dier en laterale neuronale processen te identificeren. Om dit te doen, beginnen bij het hoofd van de worm en langzaam scrollen door de Z-as om het vlak van de zenuwring waar de neuronale processen zijn bevestigd te identificeren.Zodra de zenuwring is geïdentificeerd, in fluorescentie weergave volgen de bijgevoegde neuronale proces lateraal in de achterste richting in de richting van de vulva, waar de soma zal duidelijk zijn. Zodra de ronde soma lichaam of lichamen zijn in focus, is het belangrijk om alle neuronen in de buurt te identificeren. Voor touch neuron identificatie, eerst vinden de ALML, ALMR, en AVM soma, die moet de helderste signalen en gemarkeerd door een ronde cel lichaam aan het einde van het proces.Zodra de meest in-focus neuronale soma is gelokaliseerd, gebruik maken van de AVM-cel, een ventrale cel, om te helpen toewijzen van de oriëntatie. Als het AVM-neuron zich in hetzelfde vlak bevindt als de ALM, rust het dier op zijn kant en het laterale neuron is de ALMR. Als de AVM neuron is niet in hetzelfde vlak als de ALM in kwestie, de dichtstbijzijnde touch neuron aan het brandpuntsvlak is de ALML neuron.Ook nuttig is het identificeren van de PVM neuron, dat is een ventrale touch neuron gelegen in de buurt van de staart. Het focusvlak van de PVM geeft aan of het voorste aanraakneuron de ALML of ALMR is. Als de ALM in kwestie zich in hetzelfde vlak bevindt als de PVM, dan is het waargenomen aanraakneuron het ALML-neuron.Na de meest in-focus ALM is geïdentificeerd en toegewezen, is het belangrijk om de posities van de andere soma lichamen in de buurt van het gebied van belang en in alle Z-vliegtuigen te bepalen, om ze niet te verwarren met exophers. Zodra de aanraking neuron van belang is gevestigd, de ALMR of ALML, inspecteren het neuron voor grote uitstekende exopher domeinen, groot genoeg om te worden beschouwd als een knop exopher, dat is ten minste een vijfde van de grootte van de oorsprong soma. Als er geen knop of exopher domein wordt waargenomen, verder inspecteren van de neuronale soma voor een bijgevoegde dunne gloeidraad afkomstig van het soma lichaam.Bijgevoegde exophers hebben de neiging om dichter bij de oorsprong soma en in een soortgelijke Z-vlak. Om een ongebonden exopher te identificeren, zoek naar geconcentreerde verdreven fluorescerende eiwitten, die vaak helderder zijn dan de soma. Hoewel hier afgebeeld, is er een grote exopher.Er kunnen meer dan één fluorescerende entiteit zijn die afkomstig is van een enkele soma. Kijk voor ongebonden exophers in verschillende brandpuntsvlakken en in de verre laterale regio van waar de oorsprong soma werd gevonden. De exophers meestal uitsteken uit de buurt van de soma in een achterste richting van het neuronale proces.Controleer op grote bolvormige objecten die niet zijn gepositioneerd en geïdentificeerd als neuronale soma's. Hoewel exophers zijn meestal sphyrical structuren, kunnen ze worden afgebroken na verloop van tijd, het verwerven van een meer onregelmatige vorm. Zoek naar de aanwezigheid van sterrenhemelnachtgebeurtenissen en bijvoorbeeld naar meerdere exopher-gebeurtenissen.Om te voorkomen dat er sprake is van een misname en out-of-plane-soma voor een exopher, is het van cruciaal belang om alle nabijgelegen soma-lichamen te identificeren, zelfs onscherpe soma's aan het begin van de observatie. Een uitgebreide of puntige soma kan worden waargenomen, maar een uitbreiding zonder een duidelijke vernauwingsplaats mag niet als exopher worden gescoord. Verwerp kleine opgeloste knoppen die niet bereiken een vijfde van de grootte van de soma in exopher gebeurtenis kwantificering.Hoewel volwassen neurites kunnen dramatisch uitbreiden met de leeftijd, en fluorescerende eiwitten kunnen migreren naar het distale uiteinde van dergelijke structuren, niet tellen neurite uitwassen als exophers. Om fluorescerende entiteiten te identificeren die geen exophers zijn, moet u elke autofluorescentie uitsluiten, die kan worden verward met sterren nachts vesiculaire puin onder widefield fluorescentie. Om embryonale fluorescerende signalen uit te sluiten, schakelt u tussen fluorescentie en brightfield-verlichting en controleert u op associatie van het signaal met eieren in de baarmoeder.Deze tabel biedt een samenvatting van verschillende touch neuron uitgedrukt tl-verslaggevers die zijn gebruikt om exopher productie te controleren. Ladingen waarvan bekend is dat ze worden geëxtrudeerd in exophers omvatten aggregaten zoals Q128, een fusie van menselijke Huntington uitgebreide polyglutamine herhalingen, lysosomen GFP gelabeld met lysosomale geassocieerde membraan eiwit, en mitochondriën gelabeld met matrix-gelokaliseerde GFP. Cytoplasmatische GFP wordt niet sterk verdreven en wordt bij voorkeur in de soma bewaard, hoewel GFP kan worden gebruikt om exophers zwak te visualiseren.In het algemeen begint exopher productie door de ALMR neuron-uitdrukkende mCherry onder basale omstandigheden op dag één van volwassenheid en varieert van ongeveer vijf tot 25% van de ALMRs onderzocht binnen de belangrijkste exopher productie tijdsbestek van volwassen dag een tot drie. Bijzondere spanningen en genetische verstoringen kunnen de exopherproductie binnen ALMR-neuronen sterk verhogen. Het is van cruciaal belang om alle nabijgelegen neuronen te lokaliseren voordat het inspecteren van het neuron van belang en de omgeving voor exopher domeinen, intacte exophers, of sterrenhemel nacht gebeurtenissen.Wanneer u zich comfortabel voelt met het handmatig identificeren van exophers, kunnen verbeterde doorvoermethoden voor grootschalige screening met behulp van hoge inhoudsbeeldvorming worden gebruikt, waardoor hele genoomanalyse en mechanistische exophergenesis dissectie mogelijk zijn.

quantitative-approaches-for-scoring-vivo-neuronal-aggregate-organelle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie...

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

Grootschalige 2D elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is de toepassing van EM met nanoschaalresolutie op weefselbreed niveau. Hier beschrijven we een universele methode voor nanotomy toegepast om de larvale hersenen van de zebravis te onderzoeken in gezondheid en bij niet-invasieve hersenletsels.

Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

In dit artikel laten we zien hoe we een zevenpuntenscoresysteem kunnen gebruiken om veranderingen in dopaminerge neuron dendrietmorfologie in C. elegansconsequent te kwantificeren . Dit systeem is bedoeld voor analyses van dopaminerge neurodegeneratie-assays met behulp van genetische, chemische en op leeftijd gebaseerde modellen van neurodegeneratieve aandoeningen.

Kwantificering van dopaminerge neuron morfologische verandering en degeneratie in Caenorhabditis elegans

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Leer kwantitatieve methoden voor het scoren van neuronale aggregaat- en organel-extrusie via exophergenese in C. elegans. Deze technieken ondersteunen onderzoek naar afvalverwijdering in neuronen en neurodegeneratieve ziekten.

Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Meer video's verkennen