Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Dit protocol maakt visualisatie en tracking van interspecies bacteriële interacties op het niveau van een cel in de tijd. Deze technieken belangrijkste voordeel is de toepasbaarheid op het bestuderen van bacteriële interacties, met inbegrip van cel tracking, genexpressie en levensvatbaarheid vlekken. Bovendien kunnen de voorwaarden worden aangepast om verschillende organismen te bestuderen.

Om te beginnen, bereiden agarose pads door het smelten van 2%laag smelten agarose in 10 milliliter bacteriële groeimedia in een schone 50 milliliter Erlenmeyer kolf. Magnetron de kolf in korte intervallen tot de agarose is in oplossing, dan laat het afkoelen in een 50 graden Celsius waterbad gedurende ten minste 15 minuten. Lijn een silicium uitgesneden met de opening in een 35 millimeter schotel, draai dan de schotel en tik licht het silicium uitgesneden met een spatel om het vast te stellen aan de schotel en om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Zodra de agarose is afgekoeld, pipette 915 microliters van gesmolten agarose in de mal en laat het pad drogen. Verwarm de microscoop milieukamer ten minste twee uur voor het opzetten van het experiment op de experimentele temperatuur. Bereid vochtigheidsdoekjes voor door een pluisvrij doekje stevig op te rollen.

Plaats de opgerolde veeg in een steriele petrischaal en voeg 500 microliter steriel water direct aan de doekjes. Verwarm de doekjes, pads en een steriele schaal van 35 millimeter tot de experimentele temperatuur om alle materialen in evenwicht te brengen. Zodra de pads droog zijn, pipet een microliter van co-cultuur gelijkmatig over de bodem van een voorverwarmde steriele 35 millimeter glazen coverslip schotel.

Verwijder de siliconen uitgesneden uit de agarose schimmel met behulp van steriele pincet, kantelen naar de zijkant en schuif een licht gebogen spatel onder de rand van de agarose pad om het te laten vallen op een steriele petriplate deksel. Breng de pad naar de schotel met de bacteriële cellen onderkant naar beneden door het schuiven van een 90 graden schuine spatel onder het pad en het plaatsen van het op de top van de ingeënte cover slip. Gebruik de spatel om de pad te laten spoelen tegen de cover slip en druk voorzichtig op eventuele luchtbellen.

Verwijder overtollig vocht uit de vochtige doekje en plaats het rond de rand van de schotel, zorg ervoor dat het niet raakt het pad. Het monster is nu klaar voor beeldvorming. Voorafgaand aan ingeënte pads, het opzetten van de microscoop door het uitvoeren van kleur verlichting om alle beeldframes uit te lijnen.

Zodra de ingeënte schotel klaar is, bekijk de schotel met 100X doelstelling en focus op de bacteriële resultaten. Klik op de faseoptie in de beeldsoftware en pas het percentage DIA-LED-licht dat wordt uitgezonden aan door de lichtbron te selecteren en de balk op de lichtpercentageschaal te schuiven. U ook handmatig een belichtingstijd invoeren.

Sla de instellingen voor het fasekanaal op door met de rechtermuisknop op het fasekanaal te klikken en de optie Huidige microscoopinstelling toewijzen te selecteren. Als u fluorescentie gebruikt, selecteert u het fluorescentiekanaal van belang en stelt u het percentage uitgestraald fluorescentielicht in en past u de belichtingstijd aan zoals eerder beschreven. U ook de bieddiepte wijzigen om het dynamisch bereik aan te passen door een van de andere opties in het vervolgkeuzemenu te selecteren.

Sla de instellingen voor het fluorescentiekanaal op door met de rechtermuisknop op het fluorescentiekanaal te klikken en de optie Huidige microscoopinstelling toewijzen te selecteren. Klik op het tabblad XY op het vak in de kolom puntnaam om de geselecteerde XY-positie van belang op te slaan. Klik vervolgens op het PFS-vak onderaan het tabblad om het perfecte focussysteem in te schakelen.

Focus de cellen en klik op de pijl in de KOLOM PFS om de focus van de XY-positie op te slaan. Herhaal dit proces voor alle andere XY-posities. Sla de instellingen voor de XY-posities op onder het fasetabblad zoals eerder is aangetoond.

Klik op het tabblad Tijd en schakel het selectievakje in om het aanschafinterval, de frequentie en de weergaveduur in te schakelen. Klik vervolgens op het tabblad golflengte en schakel het selectievakje in om kanalen te selecteren die moeten worden gebruikt in de weergave- en kanaalintervalfrequentie. Wanneer u met de instellingen wordt gevist, klikt u op Nu uitvoeren om de time lapse-beeldvorming te starten.

Vergelijk met de P.aeruginosa cellen in monocultuur die gegroepeerd blijven in vlotten wanneer in co-cultuur met S.aureus, P.aeruginosa heeft verhoogd eencellige beweeglijkheid naar S.aureus kolonies. P.aeruginosa enkele cellen zullen omringen en uiteindelijk binnenvallen S.aureus kolonies. Te veel of te weinig vochtigheid tijdens het experiment en verkeerd gedroogde pads zijn twee veel voorkomende problemen die leiden tot drift als gevolg van de pad verschuiven en slepen van de cellen uit het gezichtsveld.

Foto bleken en foto toxiciteit kan leiden tot cellen om eerst, los hun fluorescentie dan stoppen met delen en uiteindelijk sterven in de volgende frames. Cellen die in eerste instantie te dicht in de nabijheid liggen, hebben mogelijk niet voldoende tijd om een gradiënt van uitgescheiden signalen vast te stellen waarop andere soorten kunnen reageren. Bacteriële cel levensvatbaarheid kan worden gevisualiseerd door het toevoegen van propidium jodide aan de agarose pads.

Groene cellen geven levende cellen aan die actief GFP uitdrukken, terwijl rode cellen duiden op dode propidium jodide gekleurde cellen na behandeling met P.aeruginosa cel vrij supernatant. De beweging van individuele P.aeruginosa cellen wordt gevolgd vanuit het frame waarin een cel het vlot verlaat door het frame waarin de cellen het S.aureus-cluster bereiken. De afstand tussen het P.aeruginosa vlot en het S.aureus-cluster zorgt voor de Afstand van de Euclidische, terwijl de totale spoorlengtes de geaccumuleerde afstand bieden.

De richting van elke cel wordt berekend als een verhouding tussen de afstand tussen de euclidische cellen en de geaccumuleerde afstand. Wild type P.aeruginosa beweegt zich naar wilde type S.aureus met aanzienlijk hogere richtsalheid dan naar S.Aureus zonder agr-gereguleerde afgescheiden factoren die nodig zijn voor directionele beweeglijkheid. Bij een poging tot dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat elke onderzoeker nodig heeft om de omstandigheden te optimaliseren voor het drogen van agarose pads in live imaging op basis van geografische locatie, laboratoriumomgeving en hun specifieke experiment.

Deze techniek onthullen interacties tussen Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus, eerder verduisterd tijdens onze onderzoeken naar hun gedrag in bulkcultuur, waardoor we dichter bij het begrijpen komen hoe deze organismen op elkaar inwerken tijdens infecties.