Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel en resulteert in neuronale verlies. Talrijke aanwijzingen suggereren dat de interactie tussen glia en urinoir cellen de druk effecten uitoefenen na een ischemische gebeurtenis. Om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen.

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke culturele medium maakt de oprichting van neuron of astrocyten verrijkt culturen of neo-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid. Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor, gebaseerd op een co-cultuursysteem, waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multi-well platen. De twee culturen worden gehandhaafd een deel door kleine paraffinebollen.

Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandeling op elk celtype mogelijk, wat een voordeel is in veel studies. Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.

Begin met rattenembryonal cortex isolatie. De embryo's werden verkregen uit een familie van ratten op 15 dagen van de dracht en worden geplaatst in een steriele Falcon buis met PBS. Nog steeds in de dooier zakje embryo's worden geplaatst in een petrischaal met koude PBS.

Met behulp van een schaar en pincet wordt de dooierzak gebroken en wordt het embryo verwijderd en in een andere petrischaal met koude PBS over een ijslaag geplaatst. Het is noodzakelijk om heel voorzichtig te zijn bij het breken van de dooierzak om het embryo niet te beschadigen. Plaats het embryo onder een ontledenmicroscoop, bevestig het embryo voorzichtig met behulp van een twizzer.

De initiële incisie moet parallel zijn aan de cortex. Pas op dat u het dier niet onthoofdt. De hoofdhuid en worden zorgvuldig verwijderd om het corticale hersenweefsel niet te beschadigen.

Deze volgende incisie scheidt de cortex. Verwijder de bloedvaten aanwezig in het weefsel. Ten slotte, met behulp van een pipet, breng het corticale weefsel naar een Falcon buis met PBS.

De eencellige suspensie wordt verkregen door mechanische vertering van het corticale hersenweefsel met behulp van tips met afnemende diameter. Zorg ervoor dat het weefsel goed gehomogeniseerd is Na de spijsvertering, centrifuge het materiaal op 400 Gs gedurende drie minuten. Gooi het supernatant weg en verhoog het sediment in kweekmedium, dat eerder werd opgewarmd tot 37 graden.

Bereken het totale aantal cellen dat in de suspensie aanwezig is met behulp van een Neubauer-kamer en bereid de verdunning voor op de voldoende celdichtheid. Ten slotte, zaad de cellen in de multi-well en incubeer op 37 graden. Om het materiaal voor te bereiden op het co-cultuursysteem, verwarmt u de paraffine in een verwarmingsblok totdat het vloeibaar wordt.

Dan, met behulp van een stereo-glas Pasteur pipet bereiden kleine bollen over de cover slips die eerder werden geplaatst in een multi-well, en bekleed met Poly-D-Lysine. 24 uur voordat de twee culturen in contact worden gebracht, verander het kweekmedium van neuronen en astrocyten om het aan te vullen MET OF zonder warmte geïnactiveerde FBS. Wanneer de twee culturen klaar zijn voor gebruik, breng het neuron, zittend in de cover slips met paraffine bollen naar putten met behulp van astrocyten met behulp van een pincet eerder ondergedompeld in 70%ethanol.

Na het plaatsen van beide celtypen in contact, wacht acht tot 12 uur en start vervolgens de verschillende stimuli en procedures. De zuurstof- en glucosedeprivatie wordt uitgevoerd in een cultuur met zeven dagen groei. Verwijder het kweekmedium en was de cellen twee keer met HBSS-medium zonder glucosesuppletie.

Zorg ervoor dat al het medium met glucose wordt gewassen. Verzegel de Hypoxia kamer en voeg het gasmengsel met 95% stikstof en 5% kooldioxide gedurende vier minuten met een stroom van 20 liter gedurende minuten om de aanwezige zuurstof in de kamer te vervangen. Stop vervolgens de stroom en plaats de Hypoxia-kamer in een couveuse op 37 graden.

Na de periode van zuurstof- en glucosedeprivatie, vervang het medium, HBSS zonder glucosesuppletie met het juiste kweekmedium voor de resterende procedures en broed de cellen uit op 37 graden. Om het type corticale cultuur te karakteriseren, voerden we immunohistochemie uit in de drie soorten corticale culturen om het aantal cellen te beoordelen dat GFPA of MAP2 uitdrukte, die markers zijn die op grote schaal worden gebruikt voor respectievelijk astrocytische en neuronale cellen. Deze analyse toonde aan dat toen dit protocol, we in staat waren om een zuiver verrijkte cultuur van astrocyten te verkrijgen met ongeveer 97% van de cellen die GFAP uitdrukken.

Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur, hebben we geverifieerd ongeveer 78% van de cellen uitdrukken MAP2. We identificeren echter ongeveer 18% van de negatieve GFAP- en MAP2-cellen. Voor de neuron-glia corticale cultuur, Het werd waargenomen dat ongeveer 49% van de cellen zijn MAP2 positief.

31% is GFAP positief. En 20% ze zijn niet aansprakelijk voor GFAP noch MAP2. Zeven dagen na de corticale cultuur inrichting, de neuron-glia cultuur en de neuron-verrijkte cultuur werden onderworpen aan een OGD procedure voor 4 en 6 uur.

Na deze procedure werden cellen gelabeld met MAP2 en vervolgens werd het aantal MAP2 positieve cellen gekwantificeerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. In neuron-glia cultuur, het werd waargenomen een daling van ongeveer 30% in het aantal neuronen, toen de cultuur werd voorgelegd aan een OGD periode van 4 uur. Na een OGD-periode van 6 uur neemt de uitbreiding van de laesie toe, tot ongeveer 60% van het neuronale verlies.

Met betrekking tot de verrijkte cultuur van neuronen blootgesteld aan OGD, het werd waargenomen ongeveer 41%en 64% daling van het aantal MAP2 cellen. Bovendien werd opgemerkt dat in de neuron-verrijkte cultuur, was er een lichte toename van de schade uitbreiding in vergelijking met de neuron-glia cultuur ook blootgesteld aan OGD gedurende 4 uur. Tot slot, hier vertegenwoordigen een in vitro model om ischemische beroerte gevestigd in een eenvoudige, snelle en dure en reproduceerbare manier te bestuderen.

Bovendien, de beschreven methode maakt het ook mogelijk om neuronen en astrocyten verrijkte primaire culturen te implementeren, maar ook een neuron-glia cultuur. Dus, het verstrekken van een grote in-vitro model voor het modelleren van verschillende hersenziekten met een hoger niveau van complexiteit, dan vereeuwigde cellijnen en pure neuronale of gliaculturen.