Name: Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer chronische craniale vensterimplantatie voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire dynamica in muizen. Deze methode maakt repetitieve in vivo Two-Photon microscopie mogelijk om celinteracties en morfologische veranderingen in de hersenen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van het Eyo lab voor het bespreken van de ideeën gepresenteerd in dit manuscript. Wij danken Dr. Justin Rustenhoven van het Kipnis Lab aan de Universiteit van Virginia voor het geschenk van NG2DsRed muizen33. Dit werk wordt ondersteund door financiering van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health to U.B.E (K22 NS104392).

Alle stappen zijn in overeenstemming met de richtlijnen vastgesteld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Muisvoorbereiding voor schedelowimplantatie
LET OP: Verschillende transgene muislijnen met fluorescerende tags zijn geschikt voor beeldvorming.
<ol><li>Gebruik CX3CR1GFP/+ muizen26 om microglia in vivo te visualiseren. Typisch, jonge tot jonge volwassen 4 tot 10 weken oude muizen die 17-25 g wegen worden gebruikt. OPMERKING: Hoewel deze aanpak zelfs geschikt is voor voorspende muizen, kan de noodzaak om de muizen terug te keren naar hun kooi met hun moeders voor het voeden, het herstel bemoeilijken als de moeder na de operatie niet voldoende voor pups zorgt. Daarom wordt het gebruik van muizen na het spenen aanbevolen.</li>
	<li>Verdoven de muis met behulp van isoflurane (5% stroom in zuurstof voor inductie gedurende 1 min) in een verdovingskamer. Controleer of de muis geen beweging of trillende reacties op teen- en/of staartknijpers laat zien. Neem de muis uit de kamer en in de open lucht grondig scheren het haar op het hoofd tussen de oren van ongeveer het ooghoogte naar de top van de nek regio met behulp van een haartrimmer. OPMERKING: De concentratie van gebruikte isofluran zou afhangen van de grootte van de inductiekamer. Daarom kan voor kleinere kamers 3-4% isoflurane worden gebruikt om anesthesie effectief te induceren, terwijl grotere kamers tot 5% nodig hebben.</li>
	<li>Verplaats de muis naar de stereotactische chirurgie station neuskegel voor anesthesie (1,5-2% voor onderhoud voor de operatie), stabiliseren van het hoofd met behulp van oordoppen, en onderhouden van de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur warm te houden.</li>
	<li>Smeer beide ogen met oogzalf. Injecteer 100 μL van 0,25% bupivicaine (om lokale analgesie te bieden aan de muis die 8-12 uur zal duren) en 100 μL van 4 mg/mL dexamethasone (om de ontsteking die het gevolg kan zijn van de operatieprocedure te verminderen) onderhuids op de incisieplaats. Laat de muis minstens 5 minuten zitten voordat u naar de volgende stap gaat.</li>
	<li>Maak de geschoren kop schoon met drie afwisselende wattenstaafjes betadine en 70% alcohol. Maak een middellijn hoofdhuid incisie met behulp van chirurgische mes of schaar uit te breiden van de achterkant van de schedel regio tussen de oren naar de frontale gebied tussen de ogen. De resterende huid wordt gesneden om de schedel bloot te leggen.</li>
	<li>Reinig het bindweefsel tussen de hoofdhuid en de onderliggende schedel met 3% waterstofperoxide (H2O2)en lokaliseer het te beelden hersengebied met stereotactische coördinaten. OPMERKING: Er is vaak wat bloeden (stap 1.5) van de incisie op het schedeloppervlak. Deze bloeding verdwijnt meestal vanzelf binnen 3-5 min. Schoonmaken met de peroxide helpt. Voorafgaande behandeling van bupivacaine (stap 1.4) wordt ook opgemerkt om de hoeveelheid bloeden gedurende deze tijd te beperken.</li>
</ol>2. Muis craniale venster implantatie chirurgie
<ol><li>Boor een cirkelvormige opening ~4 mm in de schedel met behulp van een tandboorbit (0,7 mm tipdiameter) en verwijder dit deel van de schedel voorzichtig met behulp van puntige tangen. Voor het beeldvorming van de somatosensorische cortex van 6-8 weken oude muizen, lokaliseren het centrum van de craniotomie op -2,5 achterste en ± 2,0 laterale naar bregma. Bevochtig tijdens het boren regelmatig de schedel met steriele zouten en wattenstaafjes om de hersenen af te koelen, botresten schoon te maken en het schedelbot te verzachten voor eventuele verwijdering. OPMERKING: De coördinaten voor de craniotomie zouden variëren afhankelijk van het interessegebied en de leeftijd van de muizen.</li>
	<li>Nadat de schedel is verwijderd, voorzichtig plaats een klein afdekglas (grootte #0 op 0,1 ± 0,02 mm dikte) bevochtigd met zout in de craniotomie. Droog overtollige zoutoplossing af met een steriele doek.</li>
	<li>Met behulp van een puntige applicator (zoals een pipetpunt of het puntige uiteinde van een gebroken houten wattenstaafje), breng cyanoacrylaatlijm rond het raam en laat het hechten aan de hersenen en schedel. Breng de primer lijm op de rest van de schedel en genezen met een uitharding licht voor 20-40 s. Bereid een put rond het raam met de uiteindelijke lijm en genezen met een uitharding licht voor 20-40 s.</li>
	<li>Lijm eerst een kleine hoofdplaat op de schedel op het contralaterale halfrond van de craniotomie met de primerlijm als primer en vervolgens met de uiteindelijke lijm. Cure beide met het uitharden licht voor 20-40 s per stuk. LET OP: Hechtingen zijn niet nodig als de schedel tijdens deze procedure volledig bedekt is met de lijm.</li>
</ol>3. Na de operatie
<ol><li>Laat de muis wakker worden bij afwezigheid van anesthesie (herstel gedaan op een verwarmingskussen verkort de hersteltijd) en breng hem terug naar zijn kooi zodra het volledig wakker is. Injecteer één onderhuidse dosis buprenorfine SR (0,5 mg/kg) als postoperatieve analgesie die voldoende is voor 72 uur.</li>
	<li>Om een gezond herstel van de operatie te vergemakkelijken, geeft u de muis een extra zacht voedsel, dat in de vorm van regelmatige vaste chow in water kan zijn om de chow of voedsel in de vorm van een gel te verzachten. LET OP: Een eenmalige levering van het zachte voedsel direct na de operatie is voldoende.</li>
	<li>Controleer de muis dagelijks op gezondheid en goed herstel voor de eerste 72 uur van de operatieprocedure. Daarna, uitvoeren van beeldvorming vanaf al 2 weken vanaf het venster implantatie chirurgie. OPMERKING: Als het goed wordt gedaan, herstellen muizen goed met normaal ambulante gedragingen, voldoende kooiverkenning, goede hydratatie, stabiele gewichtstoename en uitgebreide interacties met andere muizen in de kooi en andere items in de kooi. Muizen met lethargie, uitdroging en meer dan 10% gewichtsverlies na de operatie worden geëuthanaseerd en verwijderd uit de studie.</li>
</ol>4. Twee-foton hersenen mapping voor de eerste beeldvorming
<ol><li>Verdoof de muis (Isoflurane, 5 % inductie en 1,5 % onderhoud). Stabiliseer de kop met behulp van schroeven om de kopplaat te monteren op de twee-foton microscoop stadium, wordt gehandhaafd op een verwarmingsplaat op 35 °C. Injecteer intraperitoneally 100 μL bloedvatkleurstof zoals Rhodamine B (2 mg/mL). OPMERKING: Beeldvorming kan ook worden gedaan in wakkere muizen zonder verdoving. Recente studies wijzen er echter op dat anesthesie de microgliale surveillancedynamiek27,28,29 beïnvloedt en dat hoofdfixatie voor twee fotonbeeldvorming bij wakkere muizen de stress verhoogt, zelfs tijdens chronische beeldvorming gedurende ten minste 25 dagen (zie Juczewski et al., 2020)30.</li>
	<li>Reinig het oppervlak van het schedelvenster voorzichtig met een wattenstaafje in 70% ethanol. Doe een paar druppels water of zout op het schedelvenster en verlaag de objectieve lens in de oplossing, omdat het doel een onderdompelingslens is.</li>
	<li>Hand-teken een grove kaart om de belangrijkste bloedvat oriëntatiepunten in een lab notebook aan te duiden tijdens het kijken door het oculair door epiflorescence. Gebruik deze tekening om de specifieke regio's te identificeren tijdens twee fotonbeeldvorming. U ook foto's maken van de bloedvaten via een camera die op de microscoop is gemonteerd of via een handcamera of telefoon. OPMERKING: Deze met de hand getekende beelden en foto's moeten het opnieuw bezoeken van dezelfde brede regio's onder de microscoop vergemakkelijken voordat twee fotonbeeldvorming. Dit zijn geen nauwkeurige beeldmapping.</li>
	<li>Verzamel onder twee fotonbeelden beelden van florescente cellen en vaten als dat nodig is. Maak zorgvuldige aantekeningen met de juiste coördinaten om ervoor te zorgen dat de precieze regio's opnieuw kunnen worden bekeken voor latere beeldvorming. Verzamel verschillende gezichtsvelden in deze eerste beeldvormingssessie, bijvoorbeeld om elke 1-2 μm z-stackbeelden te verkrijgen via een volume weefsel. OPMERKING: Tijdens het verzamelen van beelden door twee foton, het bloedvat oriëntatiepunten worden gebruikt voor grof in kaart brengen. Als fijne mapping nodig is, worden YFP-gelabelde dendrieten van Thy1-YFP31 muizen gebruikt.<ol>
<li>Gebruik deze aanbevolen parameters voor beeldvorming: een golflengte van 880-900 nm is optimaal; voor GFP en/of dsRed / Rhodamine excitatie wordt een 565 nm dichroic spiegel met 525/50 nm (groen kanaal) en 620/60 nm (rode kanaal) emissiefilters gebruikt; voor GFP- en YFP-scheiding wordt een 509 nm dichroic spiegel met 500/15 en 537/26 nm emissiefilters gebruikt; het vermogen in de hersenen wordt gehandhaafd op 25 mW of lager; beeldresolutie is 1024 x 1024 pixels, het gezichtsveld genomen met een 25X 0.9 NA doelstelling op een 1,5X zoomfactor is 295,24 x 295,24 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aan het einde van de beeldvorming, neem de muis van het podium, laat het wakker worden van anesthesie en terug te keren naar zijn huis kooi tot een toekomstige imaging sessie.</li>
</ol>5. Beeldvorming met twee foto's en re-imaging
<ol><li>Voor toekomstige volgende beeldvormingssessies, die van enkele uren tot maanden na de eerste beeldvormingssessie overal kunnen zijn, verdoven de muis (Isoflurane, 5% inductie en 1,5% onderhoud), monteren op de twee-fotonmicroscoop, handhaven op een verwarmingsplaat en re-inject 100 μl een bloedvatkleurstof zoals Rhodamine B (2 mg/mL).</li>
	<li>Open de eerder verkregen afbeeldingen in ImageJ en identificeer deze met behulp van deze afbeeldingen en de notities van de vorige sessie en identificeer deze zorgvuldig.</li>
	<li>Herhaal dit zolang het beeldvenster duidelijk is of essentieel voor de omvang van de studie.</li>
</ol>

<ol><li>Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Translational+Disease+Modeling+Using+Human+iPSC-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons.</a> Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microfluidic+Models+for+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Croushore, C. A., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+studying+neurotransmitters+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission.</a> Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).</li>
<li>Wu, V. W., Schwartz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+for+reactive+gliosis%3A+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives.</a> J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tool+to+test+long-term+effects+of+chemicals+on+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Brain+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Brain Slice Cultures.</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59(2018).</li>
<li>Heine, C., Franke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+co-culture+systems+to+study+axon+regeneration+in+the+dopaminergic+system+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).</li>
<li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecualar+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45(2019).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo%3A+watching+the+brain+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Akassoglou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+CNS+Injury+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease.</a> Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).</li>
<li>Tran, C. H., Gordon, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+and+microvascular+imaging+in+awake+animals+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy.</a> Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).</li>
<li>Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Microglial+Calcium+Signaling+in+Brain+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366(2017).</li>
<li>Bennett, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Ontogeny+and+CNS+Environment+Establishes+Microglial+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity.</a> Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology.</a> Science. 353 (6301), 760-761 (2016).</li>
<li>Kipnis, J., Filiano, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology+in+2017%3A+The+central+nervous+system%3A+privileged+by+immune+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).</li>
<li>Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome%3A+stress%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The microbiome: stress, health and disease.</a> Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).</li>
<li>Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome-The+Missing+Link+in+the+Gut-Brain+Axis%3A+Focus+on+Its+Role+in+Gastrointestinal+and+Mental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521(2018).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Two-Photon+Imaging+of+Anesthesia-Specific+Alterations+in+Microglial+Surveillance+and+Photodamage-Directed+Motility+in+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12R-Dependent+Translocation+Mechanisms+Gate+the+Changing+Microglial+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape.</a> Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+progenitors+balance+growth+with+self-repulsion+to+achieve+homeostasis+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).</li>
<li>Berthiaume, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Pericytes+In+Vivo+Maintains+Capillary+Coverage+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+persistent+dendritic+spines+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo.</a> Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).</li>
<li>Wang, C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8 (6), 67680(2013).</li>
<li>Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+genetic+access+to+transiently+active+neurons+via+TRAP%3A+targeted+recombination+in+active+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations.</a> Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neurogenesis+in+the+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus.</a> Science. 359 (6376), 658-662 (2018).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+fluorescence+microscopy+imaging+of+neural+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo.</a> Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+neural+activity+from+the+cortical+surface+during+hippocampal+epileptiform+events+in+the+rat+brain+using+electrical+impedance+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography.</a> Neuroimage. 209, 116525(2020).</li>
<li>Kulkarni, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Voltage+Imaging+with+Sulfonated+Rhodamine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De komst van in vivo twee-foton beeldvorming heeft mogelijkheden geopend om de overvloed van cellulaire interacties en dynamiek die zich voordoen in de gezonde hersenen te verkennen. Eerste studies gericht op het gebruik van de open schedel craniotomie benadering van beeld neuronale dendrieten door zowel acute als chronische beeldvorming37,38. Dit kan ook worden gebruikt om neuro-immuun interacties in de hersenen te verduidelijken. Dit protocol beschrijft een met...

Het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt beheerst door een complex samenspel van interacties tussen verschillende ingezeten celtypen, waaronder neuronen, glia en aan bloedvaten geassocieerde cellen. Traditioneel werden neurale cellen bestudeerd in geïsoleerde, co-gekweekte1,,2,,3,4,5 (in vitro) of uitgesneden hersenweefsel (ex vivo)6,7,8,9,10 contexten. Echter, er is behoefte aan verder te begrijpen neurale cel gedrag en interacties in de inheemse omgeving van de intacte hersenen in vivo. In dit protocol beschrijven we een methode om in vivo regio's van belang in kaart te brengen en deze regio's nauwkeurig opnieuw te beelden in toekomstige beeldvormingssessies om de complexe interacties tussen de verschillende CNS-celtypen gedurende langere perioden bij te houden.
De ontwikkeling van in vivo beeldvormingsbenaderingen heeft aanzienlijke voordelen opgeleverd voor het juiste begrip van neurale functie11,12,13,14,15. Met name deze benaderingen bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele in vitro en ex vivo benaderingen. Ten eerste hebben in vivo beeldvormingssystemen fysiologisch relevante cel- en weefselcomponenten zoals de vasculatuur met het volledige repertoire van cellulaire interacties om een volledig begrip van neurale netwerkfysiologie te bieden. Ten tweede, recente bevindingen suggereren dat wanneer verwijderd uit hun eigen omgeving, bepaalde neurale cellen (zoals microglia) belangrijke kenmerken van hun identiteit en dus fysiologie16,17 die kunnen worden bewaard in de in vivo instelling te verliezen. Ten derde bieden in vivo beeldvormingssystemen de mogelijkheid voor stabiele longitudinale onderzoeken van weken tot maanden om cellulaire interacties van CNS te bestuderen. Ten slotte bieden in vivo-systemen, gezien het groeiende bewijs voor bijdragen van het perifere immuunsysteem18,,19 en het microbioom20,21 in de CNS-fysiologie, een platform om dergelijke bijdragen en effecten op CNS-cellen te ondervragen. Dus, benaderingen die longitudinale in vivo beeldvorming gebruiken om neuro-immuun fysiologie en interacties in gezonde, gewonde en zieke toestanden te bestuderen zijn een grote aanvulling op traditionele benaderingen.
In dit protocol beschrijven we een betrouwbare benadering van verschillende celtypen in de hersenen, waaronder microglia, neuronen en NG2+ cellen als voorbeelden. Er zijn twee benaderingen ontwikkeld om neurale cellen in vivo te visualiseren: de uitgedunde schedelbenadering en de open schedel met een craniale raambenadering. Hoewel uitgedunde schedelbenaderingen in gebruik zijn en de voorkeur hebben omdat ze enkele van de nadelen van de open schedelbenadering overwinnen, zoals gliacelactivering, hoger dan fysiologische wervelkolomdynamiek en het gebruik van ontstekingsremmende middelen22,23,24,25, uitgedunde schedelbenaderingen vertonen ook een paar kritische nadelen. Ten eerste is de dunner wordende procedure een zeer delicate procedure die veel onderzoekers moeilijk vinden om te perfectioneren, vooral wanneer het opnieuw uitdunnen noodzakelijk is. Dit is het geval omdat het vaak moeilijk is voor onderzoekers om na te gaan dat ze de schedel hebben uitgedund tot een ~ 20 μm diepte. Ten tweede, voor adequate vergelijkingen tussen muizen, dunner zou moeten identiek zijn en een verscheidenheid van dunner wordend succes tussen beeldvorming sessies of muizen kunnen compliceren visualisatie van neurale structuren. Ten derde, wanneer ze worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming, kunnen dieren met uitgedunde schedels slechts voor een beperkt aantal sessies worden gebruikt wanneer het opnieuw uitdunnen van de schedel wordt gebruikt. Forth, aangezien sommige van het botweefsel nog steeds overblijft, duidelijkheid in de diepte van de beeldvorming kan worden aangetast van de uitgedunde schedel benadering waardoor grote visualisatie van meer oppervlakkige, maar niet zo veel met diepere regio's. In het licht hiervan kunnen diepere hersenstructuren zoals de hippocampus niet succesvol worden afgebeeld met de uitgedunde schedelbenadering. Deze overwegingen doen de noodzaak van alternatieve en complementaire benaderingen aan de orde die deze zorgen kunnen wegnemen.
Als alternatief voor de uitgedunde schedelbenadering, maakt de open schedelvensterimplantatiebenadering gebruik van een procedure waarbij de schedel wordt vervangen door een optisch heldere glazen coverslip. Dit zorgt voor een vrijwel onbeperkt aantal beeldvormingssessies. Bovendien, gezien de vervanging van de schedel door de glazen coverslip, deze methode zorgt voor een duidelijk kijkvenster van fluorescerend getagde hersencellen voor uitgebreide perioden van uren tot maanden en, daarom, kan worden gebruikt om celactiviteit en interacties die relevant zijn voor fysiologie, veroudering en pathologie te bestuderen.
Over het algemeen beschrijven we stappen die kunnen worden gevolgd om chronische craniale vensters te implanteren door middel van een stereotaxic craniotomie die in vivo beeldvorming van hersengebieden van belang mogelijk maakt. We beschrijven ook hoe de schromelijk stabiele hersenen vasculatuur of de fluorescerende gelabelde dendrieten kunnen worden gebruikt om een grove of een fijne kaart te genereren, respectievelijk van de hersenen regio's van belang. Deze aanpak kan vervolgens worden gebruikt voor herhaalde beeldvorming gedurende meerdere sessies. Het belang van deze techniek ligt daarom in zijn vermogen om de langetermijnveranderingen of stasis in hersenelementen in beeld te brengen, waaronder de opstelling, morfologie en interacties van de verschillende cellulaire typen.

```html
<table><tbody><tr><td>Coverglass (3mm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0726</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm (Krazy Glue)</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&amp;qid=1583856837&amp;s=pet-supplies&amp;sr=8-2</td><td></td></tr><tr><td>Demi Ultra LED-hardingslichtsysteem</td><td>Dental Health Products, Inc</td><td>910860-1</td><td></td></tr><tr><td>Tandboormachine</td><td>Osada: www.osadausa.edu</td><td>EXL-M40</td><td></td></tr><tr><td>Boortje</td><td>Fine Science Tools</td><td>#19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Henry Schien</td><td>1338333</td><td></td></tr><tr><td>iBond Total Etch (Primer lijm)</td><td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td><td>66040094</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Millipore Sigma</td><td>81-88-9 (R6626)</td><td></td></tr><tr><td>Tetris Evoflow lijm (Laatste lijm)</td><td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td><td>#595956</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Brav Mini+</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&amp;linkCode=df0&amp;hvadid=167141013968&amp;hvpos=&amp;hvnetw=g&amp;hvrand=12368793083893626704&amp;hvpone=&amp;hvptwo=&amp;hvqmt=&amp;hvdev=c&amp;hvdvcmdl=&amp;hvlocint=&amp;hvlocphy=9008337&amp;hvtargid=pla-332197544154&amp;psc=1</td><td></td></tr></tbody></table>
```

nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt gereguleerd door een complex samenspel van neuronale, gliale, stromale en vasculaire cellen die de juiste functie vergemakkelijken. Hoewel het bestuderen van deze cellen in isolatie in vitro of samen ex vivo nuttige fysiologische informatie biedt; opvallende kenmerken van neurale celfysiologie zullen worden gemist in dergelijke contexten. Daarom is er behoefte aan het bestuderen van neurale cellen in hun oorspronkelijke in vivo omgeving. Het hier beschreven protocol beschrijft repetitieve in vivo twee-foton beeldvorming van neurale cellen in de knaagdierschors als een hulpmiddel om specifieke cellen gedurende langere perioden van uren tot maanden te visualiseren en te bestuderen. We beschrijven in detail het gebruik van de schromelijk stabiele hersenvacuatuur als een grove kaart of fluorescerend gelabelde dendrieten als een fijne kaart van bepaalde hersengebieden van belang. Met behulp van deze kaarten als een visuele sleutel, laten we zien hoe neurale cellen nauwkeurig kunnen worden verplaatst voor latere repetitieve in vivo beeldvorming. Met behulp van voorbeelden van in vivo beeldvorming van fluorescerende microglia, neuronen en NG2+ cellen, toont dit protocol het vermogen van deze techniek aan om repetitieve visualisatie van cellulaire dynamiek in dezelfde hersenlocatie over langere perioden mogelijk te maken, die verder kan helpen bij het begrijpen van de structurele en functionele reacties van deze cellen in normale fysiologie of het volgen van pathologische beledigingen. Waar nodig kan deze aanpak worden gekoppeld aan functionele beeldvorming van neurale cellen, bijvoorbeeld met calciumbeeldvorming. Deze benadering is vooral een krachtige techniek om de fysieke interactie tussen verschillende celtypen van het CNS in vivo te visualiseren wanneer genetische muismodellen of specifieke kleurstoffen met duidelijke fluorescerende tags beschikbaar zijn om de cellen van belang te labelen.

Om de microgliale dynamiek in vivo te visualiseren, werden dubbele transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP muizen gebruikt. De Thy1-YFP H-lijn wordt gebruikt in tegenstelling tot de Thy1-GFP M-lijn om te voorkomen dat de overlap van microglia (GFP) en neuronen (YFP) florescentie overlapt. Alternatieve benaderingen kunnen gebruik maken van een reporter lijn waarin microglia zijn gelabeld met bijvoorbeeld tdTomato en vervolgens de Thy1-GFP M lijn kan worden gebruikt. Een nadeel van de H-lijn is dat YFP veel neu...

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Dit protocol laat zien hoe in Vivo Two-Photon microscopie kan worden gebruikt om repetitieve visualisatie van cellulaire dynamiek te doen, in dezelfde hersenlocatie gedurende langere perioden. Het voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om de veranderingen op lange termijn in cellulaire elementen van de hersenen in beeld te brengen, inclusief de rangorde, morfologie en fysieke interacties tussen het verschillende celtype van het CZS. Deze techniek kan vooral nuttig zijn bij het uitlokken van celcel-cel interacties, celdynamica, en morfologische veranderingen tijdens de hersenen plasticiteit, en neurodegeneratie.Begin met het voorbereiden van een jonge of jonge volwassene, vier tot 10 weken oud, een CX3CR1 GFP heterozygoot muis, die 17 tot 25 gram weegt, voor een craniale vensterimplantatie. Na het verdoven van de muis, gebruik maken van een haartrimmer om het haar te scheren op zijn hoofd, tussen de oren, ongeveer, van het oogniveau, naar de bovenkant van de nek regio. Verplaats de muis naar de stereotactische chirurgie station, neus kegel, en stabiliseren van het hoofd met behulp van oordoppen.Houd de muis gedurende de hele procedure op het verwarmingskussen. Smeer beide ogen met oliezalf, dan injecteren 100 microliter van 0,25%bupivacaine, en 100 microliter van vier milligram per milliliter dexamethasone, onderhuids op de incisie site. Wacht minstens vijf minuten voordat u verdergaat.Bloed de geschoren kop, met drie afwisselende wattenstaafjes betadine, en 70% alcohol. Maak dan een middellijn hoofdhuid incisie met een chirurgisch mes of schaar. Uit te breiden van de achterkant van de schedel regio, tussen de oren, naar het frontale gebied tussen de ogen.Snijd de resterende huid om de schedel bloot te leggen. Bloed het bindweefsel tussen de hoofdhuid en de onderliggende schedel met 3% waterstofperoxide en lokaliseer het te beelden hersengebied met stereotactische coördinaten. Boor een cirkelvormige opening, ongeveer vier millimeter in de schedel, met behulp van een tandheelkundige boor bit.Tijdens het boren, regelmatig bevochtigd de schedel met steriele zoutoplossing en wattenstaafjes om de hersenen te koelen. Ruim botresten op en verzacht het schedelbot. Wanneer u klaar bent, verwijder dan voorzichtig dit gedeelte van de schedel met puntige tangen.Nadat de schedel is verwijderd, zorgvuldig plaats een klein afdekglas, bevochtigd met zout in de craniotomie. Droog overtollige zoutoplossing af met een steriele doek. Met behulp van een puntige applicator, van toepassing cyanoacrylaat lijm rond het raam, en laat het hechten aan de hersenen en schedel.Breng de primer lijm op de rest van de schedel, en genezen met een uitharding licht gedurende 20 tot 40 seconden. Maak een put rond het raam met de uiteindelijke lijm, en genezen met een uitharding licht voor 20 tot 40 seconden. Lijm een kleine hoofdplaat op de schedel, op de contralaterale hemisfeer, de craniotomie, met de primerlijm, en vervolgens met de laatste lijm, die beide 20 tot 40 seconden uithard.Nadat de muis wakker wordt, injecteer een onderhuidse dosis buprenorfine SR als postoperatieve analgesie, wat 72 uur voldoende zal zijn. Herleef de muis met extra zout voedsel om een gezond herstel te vergemakkelijken. Beeldvorming kan al twee weken na de implantatieoperatie worden uitgevoerd.Gebruik schroeven om de kopplaat te monteren op de twee-foton microscoop stadium, die moet worden gehandhaafd op 35 graden Celsius met een verwarmingsplaat. Injecteer de muis onderhuids met 100 microliter bloedvatverf, zoals Rhodamine B.Voorzichtig reinigen van het oppervlak van het schedelvenster met een wattenstaafje, gedeponeerd in 70%ethanol. Doe een paar druppels water of zout op het raam en laat de objectieflens in de oplossing zakken.Zorg ervoor dat de laser is uitgeschakeld als het doel is het verlagen, en trek een cursus kaart om de belangrijkste bloedvat oriëntatiepunten aan te duiden, terwijl het kijken door het oculair. Gebruik deze tekening om de specifieke regio's te identificeren tijdens de beeldvorming met twee foto's. Verzamel beelden van fluorescerende cellen en vaten met behulp van twee-foton beeldvorming.Zie het tekstmanuscript voor beeldvormende parameters, maak zorgvuldige aantekeningen met de juiste coördinaten, om ervoor te zorgen dat de precieze regio's opnieuw kunnen worden bekeken voor een volgende beeldvorming. Teken als verschillende gezichtsvelden in deze eerste beeldvormingssessie, Aan het einde van de beeldvorming, haal de muis van het podium, laat hem wakker worden uit anesthesie en breng hem terug naar zijn thuiskooi. Gebruik de verkregen notities en afbeeldingen voor het opnieuw beeldvorming van de gebieden tijdens de volgende sessies.Dit protocol werd gebruikt om Microglial Dynamics In Vivo te visualiseren, in Taiwan YFP-H lijnmuizen. Specifieke dendrieten, diende als stabiele oriëntatiepunten voor het fijn in kaart brengen van hersengebieden. Terwijl dendrieten zijn een stabiele, sommige microglia bewegen dagelijks.Enkele transgene CX3CR1/GFP muizen, werden gebruikt om microglia te volgen voor maximaal acht weken. Injecties van rhodamine B, werden gebruikt om de vasculatuur te labelen, tijdens elke beeldvormingssessie. Terwijl de vasculatuur stabiel blijft, zijn de microglia dynamisch.De CX3CR1/GFP muizen, werden gebruikt om microglia te volgen voor en na ernstige aanvallen. De vasculaire bedstructuur werd gehandhaafd, maar het microglia cellulaire netwerk, en positielandschap waren voorbijgaand. Grotere veranderingen werden waargenomen binnen 24 tot 48 uur na aanvallen.Dubbele transgene CX3CR1/GFP en NG2DS-Red muizen, werden gebruikt om microglia te volgen, en NG2 naar positieve cellen In Vivo. Zonder etikettering van de vasculatuur, microglia evenals vat geassocieerde parasieten, en oligodendrocyten precursor cellen, of OPCs, werden geïdentificeerd. Parasieten hebben langwerpige processen die volgen langs de vaatwand, en OPC's tonen meestal grotere cellichamen die zich in de hersenen parenchyma, weg van de vasculatuur.Wanneer rhodamine B werd gebruikt, kon de helderdere fluorescentie van parasieten worden onderscheiden van de zwakkere fluorescentie van luminale rhodamine, ondanks vergelijkbare opwinding tijdens beeldvorming. Dagelijkse beeldvorming toonde aan dat parasieten stabiel waren gepositioneerd, terwijl OPC's en microglia dynamisch waren. Het is belangrijk om zorgvuldig te observeren van het gebied dat wordt gevisualiseerd, om een representatieve kaart te tekenen die zo nauwkeurig mogelijk is, en de stappen aan te geven die zijn genomen om de andere locaties te bereiken met betrekking tot het startpunt.In de volgende beeldvormingssessies zijn deze stappen, de handgetekende kaarten en de eerder gemaakte afbeeldingen van cruciaal belang om dezelfde locaties herhaaldelijk te identificeren. Deze techniek heeft onderzoekers toegestaan om neuron-glia interacties, neuro-immuun interacties, en neuro-cel dynamiek van langere perioden in zowel gezondheid en pathologie te verduidelijken.

precise-brain-mapping-to-perform-repetitive-vivo-imaging-neuro-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Magnetic resonance imaging (MRI) is uitgegroeid tot een steeds populairder middel voor de behandeling van het fenotype van genetisch veranderde muizen. Dit artikel illustreert de methoden die nodig zijn om high-throughput fenotypering van genetisch veranderde muizen met behulp van meerdere MRI-muis te bereiken.

Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

Source:  Bisht, K., et al. Precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates fluorescence imaging of neuro-immune dynamics in a transgenic mouse with a skull implant. Vascular and neuronal stability is imaged alongside dynamic microglial changes, reflecting immune responses to neuronal activity.

Fluorescence Imaging of Neuro-Immune Dynamics Using a Skull Implant

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Seriële tweefotontomografie (STPT) beeldvorming is een techniek om een weefselmassa in zijn driedimensionale vorm in beeld te brengen door tweefotonbeeldvorming te combineren met automatische faseregeling en microtoom slicing. Hier beschrijven we een protocol voor de implementatie ervan voor zijdeaapjes om hun structurele kenmerken beter te begrijpen.

Seriële twee-fotontomografie van het hele zijdeaapje brein voor neuroanatomische analyses

We hebben een Duplex in situ hybridisatietest opgezet om insulinereceptorisovormen IR-A en IR-B in de plexus choroid muizen in kaart te brengen, waardoor de beperkingen van traditionele methoden worden overwonnen. Deze benadering met hoge resolutie onthult isovormspecifieke expressie en biedt nieuwe inzichten in insulinesignalering in de hersenen en mogelijke isovormgerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.

Nauwkeurige visualisatie van insulinereceptoren A en B in de hersenen van muizen met een RNA in situ hybridisatietest

Leer chronische craniale vensterimplantatie voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire dynamica in muizen. Deze methode maakt repetitieve in vivo Two-Photon microscopie mogelijk om celinteracties en morfologische veranderingen in de hersenen te bestuderen.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Meer video's verkennen