Name: Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer een murien FEMI-model om de effecten van acute chorioamnionitis op neonatale darmontwikkeling te bestuderen. Deze methode gebruikt LPS-injectie om inflammatie te induceren en helpt onderzoekers de mechanismen van darmletsel en NEC te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) en de University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics.

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alle dieren werden ondergebracht in een door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) goedgekeurd vivarium aan de Universiteit van Iowa. Alle muizen waren wilde type stam C57Bl/6J.
1. Oprichting van FEMI bij zwangere muizen
<ol><li>LPS voorbereiding<ol>
<li>Gebruik LPS afgeleid van Escherichia coli O55:B5 (stamconcentratie 2 mg/ml).</li>
		<li>Verdun lps-stamconcentratie 1:100 met steriele zoutoplossing voor een werkconcentratie van 20 μg/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maternale LPS injectie<ol>
<li>Injecteer zwangere moederdieren op zwangerschapsdag e15. Dit tijdspunt is ongeveer 75% door de muriene zwangerschap, waardoor dit model ontwikkelingsgericht vergelijkbaar is met het vroege derde trimester van menselijke zwangerschappen, dat is wanneer de meerderheid van de vroeggeboorten als gevolg van chorioamnionitis optreedt.</li>
		<li>Weeg zwangere muizen onmiddellijk voorafgaand aan de injectie om de juiste LPS-dosering te bepalen.</li>
		<li>Bereken de dosis werkconcentratie met behulp van de volgende formule: 5 μL x gram lichaamsgewicht (gbw), voor een totale dosis LPS van 100 μg/kg. Gebruik voor controledieren een equivalent volume normale zoutoplossing voor injectie.</li>
		<li>Vortex LPS-oplossing driemaal gedurende 15 seconden op hoog voorafgaand aan elke injectie.</li>
		<li>Trek het LPS-volume op in een spuit van 1 ml.</li>
		<li>Houd zwangere muis in bedwang met scruffing techniek. Houd de dorsale lighouding vast en voer de injectie uit.<ol>
<li>Plaats een 30 gauge 8 mm naald afschuining over het rechter onderste kwadrant van de buik (om blaas en buikvaten te voorkomen) onder een hoek van 30\u201240°. Steek ongeveer 1/4 tot 1/2 van de lengte van de naald in.</li>
			<li>Trek de zuiger van de spuit terug om een negatieve druk te garanderen voordat u gaat injecteren. Ga verder met de injectie als er een negatieve druk aanwezig is.</li>
			<li>Controleer na injectie muizen ongeveer 30 minuten en keer vervolgens terug naar kooien voor de rest van de zwangerschap.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Levering en verzorging van nakomelingen, en darmoogst
<ol><li>Lever pups normaal via vaginale bevalling op e20. OPMERKING: Dit model heeft een verwachte dosisafhankelijke foetale verliessnelheid die te zien is in figuur 1 en wordt besproken in de onderstaande resultaten.</li>
	<li>Laat pups bij moeders blijven en ad libitum feeds ontvangen.</li>
	<li>Op de dag van de oogst, meestal postnatale dag 14 (P14), euthanaseren pups via cervicale dislocatie in overeenstemming met de protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee.</li>
	<li>Maak met behulp van een schaar en tang een verticale incisie langs de middellijn van de buik, door de huid en het buikvlies, over de hele lengte van de buik. Verwijder de dunne darm van de maag naar de cecum met een schaar en verwijder de mesenterie met een tang.</li>
	<li>Isoleer en houd de distale 1/3 van de dunne darm (sectie representatief voor menselijk ileum), waarbij de proximale dunne darm, het cecum en de dikke darm worden weggegooid.</li>
	<li>Verdeel het ileumgedeelte doormidden met een schaar.</li>
	<li>Plaats de proximale helft in een RNA-stabilisatieoplossing voor latere RNA-kwantificering.</li>
	<li>Plaats de distale helft in 10% neutrale gebufferde formaline voor diavoorbereiding.</li>
</ol>3. Darmblessure scoren
<ol><li>Sectie paraffine ingebed weefsel in 5 μm dikke plakjes en monteren op glazen dia's. OPMERKING: We sturen de specimens naar een histologiekern voor paraffine-inbedding, doorsneden en montage op dia's.</li>
	<li>Dia's deparaffiniseren volgens standaardprocedures.</li>
	<li>Vleksecties met hematoxyline en eosine volgens standaardprocedures.</li>
	<li>Scoresecties op een 3-puntsschaal voor darmletsel zoals eerder beschreven42,43.<ol>
<li>Beoordeel met behulp van lichtmicroscopie gegeneraliseerd darmletsel door twee afzonderlijke geblindeerde onderzoekers op een 3-puntsschaal die de villus-integriteit en scheiding van het keldermembraan evalueert43 (Aanvullende figuur 1). Darmletsel kan het best worden beoordeeld bij 20x vergroting en numerieke opening 0,50.</li>
		<li>Wijs een score van 0 toe om het normale slijmvlies te beschrijven.</li>
		<li>Wijs een score van 1 toe die milde verwonding beschrijft die de ontwikkeling van subepitheliale Gruenhagen's ruimte, vacuolisatie of subepitheliale lifting omvat die beperkt is tot de lamina propria of uiteinden van villi.</li>
		<li>Wijs een score van 2 toe om ernstig letsel te beschrijven, aangegeven door epitheliale lifting en vacuolisatie groter dan de helft van de villi, villi vervorming of mucosale ulceratie en desintegratie van de lamina propria.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kwantificering van Paneth- en bokaalcellen
<ol><li>Na deparaffinisatie worden vlekdia's van weefselsecties uit stap 2.8 met Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek weergegeven om zowel bokaal- als Paneth-cellen aan te duiden zoals eerder beschreven44,45 volgens de volgende stappen. OPMERKING: Hoewel Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek niet specifiek is voor Paneth- of bokaalcellen, hebben geblindeerde ervaren onderzoekers in onze ervaring een gelijkwaardige cellulaire kwantificering met behulp van deze vlek in vergelijking met cellulaire gerichte antilichamen, met aanzienlijk minder achtergrondkleuring46.</li>
	<li>Dia's als volgt deparaffiniseren, bevlekken en uitdrogen.<ol>
<li>Dompel dia's twee keer 10 minuten onder in xyleen. LET OP: Xyleen dient in een zuurkast te worden gebruikt.</li>
		<li>Spoel af met 100% EtOH.</li>
		<li>Dompel dia's 3 minuten onder in 100 % EtOH, vervolgens in 90% EtOH gedurende 3 minuten, gevolgd door 70% EtOH gedurende 3 minuten, en ten slotte dompelt u dia's in 50% EtOH gedurende 3 minuten onder.</li>
		<li>Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min. LET OP: Wijs het gedeelte uit de buurt van het stromende water om verlies van weefselmonsters te voorkomen.</li>
		<li>Filter Alcian blauwe vlekoplossing met een standaard koffiefilter.</li>
		<li>Vlek glijdt in Alcian blauwe vlek gedurende 15 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 2 min.</li>
		<li>Verdun 1 mg periodiek zuur in 200 ml dubbel gedestilleerd water. Dompel dia's gedurende 5 minuten onder in deze oplossing. Was vervolgens 1 minuut onder stromend leidingwater.</li>
		<li>Vlek met Schiff's reagens gedurende 10 min. Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min.</li>
		<li>Bevlek de dia's met hematoxyline gedurende 1 min en was vervolgens 2 min onder stromend leidingwater.</li>
		<li>Dompel ze gedurende 1 min onder in zure alcohol (1 ml zoutzuur gemengd in 99 ml van 70% EtOH).</li>
		<li>Dompel onder in Scott's kraanwater (0,1% concentratie Van NaHCO3 in leidingwater) gedurende 1 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 1 min.</li>
		<li>Droog de dia's uit.<ol>
<li>Dip elke dia 10 keer in 70% EtOH, dip dan 10 keer in 90% EtOH en 10 keer in 100% EtOH.</li>
			<li>Dompel dia's 100% EtOH onder gedurende 10 minuten, gevolgd door tweemaal onderdompelen in verse xyleen gedurende elk 3 minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plaats een druppel montagemedia op het monster en plaats er een afdeklip overheen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het tellen van de gobletcel<ol>
<li>Tel met behulp van lichte microscopie bokaalcellen (Aanvullend figuur 2). Tel voor elk stukje darmweefsel het aantal bokaalcellen en 500 epitheelcellen en druk de gobletcelverhouding uit als een verhouding per 100 epitheelcellen. Bokaalcellen kunnen het beste worden geteld bij 20x vergroting en numeriek diafragma 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paneth-celtelling<ol>
<li>Tel met behulp van lichtmicroscopie Paneth-cellen (Aanvullend figuur 2). Voor elk stukje darmweefsel, uitdrukken als een verhouding van Paneth cellen per intestinale crypte. Tel 100 darm crypten per stuk darmweefsel. Paneth cellen kunnen het beste geteld worden bij 20x-60x vergroting en numeriek diafragma 0,50-1,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Chorioamnionitis beïnvloedt 2\u20124% van termijn en 25\u201230% van preterm leveringen8,9. De impact van chorioamnionitis kan echter lang na de geboorte duren, omdat is aangetoond dat het significante effecten heeft op de foetus en neonaat10,11,12,13,14,15,</sup...

De chorionmembranen spelen een integrale rol bij de zwangerschap van zoogdieren. Ze omvatten het koraal en amnion, die meerdere functies vervullen. Ze omringen en beschermen de foetus, vergemakkelijken paracrinesignalering tussen de maternale en foetalecompartimenten 1, en creëren lokale feedbacklussen binnen de chorionmembranen, die betrokken kunnen zijn bij het initiëren van de bevalling1. Huidig begrip van de membranen geeft aan dat het amnion een structurele barrièrefunctie biedt, en het chorion biedt een immunologische buffer voornamelijk om de zich ontwikkelende foetus te beschermen tegen het maternale immuunsysteem2. Ontsteking van deze membranen staat bekend als chorioamnionitis. Historisch gezien werd de diagnose van klinische chorioamnionitis gesteld na de aanwezigheid van maternale koorts plus een of meer foetale of maternale klinische bevindingen3,4. Hoewel deze definitie klinisch nuttig is, heeft het gebrek aan precisie het onderzoek naar chorioamnionitis uitdagend gemaakt. In 2015, in een poging om de diagnose te verduidelijken, definieerde een workshop van een deskundigenpanel door het Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis als intra-uteriene ontsteking, of infectie, of beide (triple I)3. Deze verduidelijking is belangrijk omdat, hoewel microbiële geïnduceerde infectie een belangrijke oorzaak is van baarmoeder/vruchtwaterontsteking, het minder vaak voorkomt dan steriele baarmoeder/vruchtwaterontsteking5,6,7. Over het algemeen blijft chorioamnionitis een significant probleem voor de volksgezondheid, zoals blijkt uit 2\u20124% van de termijnleveringen en 25\u201230% van de te vroeg geleverde leveringen8,9.
Chorioamnionitis kan aanzienlijke effecten hebben op de foetus en neonaat. Het is goed gedocumenteerd in de literatuur dat chorioamnionitis geassocieerd is met een verhoogd risico op veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder bronchopulmonale dysplasie10, cerebrale wittestofletsel11, intraventriculaire bloeding12, retinopathie van prematuriteit13, en zowel vermoede als bevestigde vroeg beginnende neonatale sepsis14,15. Aangezien we geïnteresseerd zijn in verwondings- en herstelmechanismen van het onrijpe darmkanaal, is het belangrijk op te merken dat chorioamnionitis ook wordt geassocieerd met latere ontwikkeling van necrotiserende enterocolitis (NEC)15,16. NEC is een verwoestende gastro-intestinale ziekte van premature zuigelingen die resulteert in een ontregelde gastheerrespons op ontsteking en daaropvolgende intestinale necrose17. Elk jaar treft NEC meer dan 4000 zuigelingen in de Verenigde Staten, en tot een derde van deze zuigelingen sterft aan de ziekte18. De pathogenese van NEC omvat waarschijnlijk een combinatie van intestinale onvolwassenheid, dysregulatie van het onrijpe immuunsysteem, darmontsteking en bacteriële translocatie19, culminerend in een laatste gemeenschappelijke route van intestinale necrose. Belangrijk is dat het begin van NEC vaak weken na de geboorte optreedt en mogelijke blootstelling aan chorioamnionitis, waardoor het mechanistische verband tussen chorioamnionitis en de daaropvolgende ontwikkeling van NEC onduidelijkis 20. Een potentieel mechanisme waarmee chorioamnionitis kan bijdragen tot de pathofysiologie van NEC is door upregulatie van het maternale immuunsysteem, waardoor vervolgens een sterke foetale ontstekingsreactie ontstaat die normale foetale ontwikkelingspatronen kan verstoren21,22,23.
Meerdere zoogdiermodellen van chorioamnionitis bestaan bij knaagdieren en schapen24,25,26,27,28,29,30,31,32. Er bestaan echter weinig gegevens over de ontwikkeling van het darmkanaal na de eerste pasgeboren periode na chorioamnionitis-geïnduceerde foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Om de relatie tussen FEMI en de daaropvolgende ontwikkeling van letsel van het onrijpe darmkanaal te onderzoeken, hebben we het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde FEMI-model aangepast. Lipopolysachariden zijn een belangrijk onderdeel van het extracellulaire oppervlak op gramnegatieve bacteriën en zijn een krachtig stimulerend middel van het aangeboren immuunsysteem van meerdere eukaryotische soorten, waaronder mensen33. Maternale LPS-injectie resulteert in een steriele ontstekingscascade zonder de verstorende effecten van levende bacteriën, en het is een bekend model voor inductie van vroeggeboorte34, evenals een model van acute chorioamnionitis en het foetale inflammatoire responssyndroom (FIRS), de meest ernstige vorm van chorioamnionitis24,35. Het is ook aangetoond dat zowel cerebrale witte als grijze stof letsel veroorzaken in een schapenmodel36 en een murien model37,38,39,40. Voor zover wij weten, zijn we echter de eersten die dit model van chorioamnionitis en FEMI gebruiken om de effecten ervan op de ontwikkeling van het maagdarmkanaal na de geboorte te onderzoeken, evenals om een mogelijk mechanistisch verband te onderzoeken tussen chorioamnionitis en latere ontwikkeling van NEC41,42.

<table><tbody><tr><td>10% neutral buffered formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcian blue stain</td><td>Newcomer supply</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6/J muizen</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline kleurstof</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U Microscoop</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS# 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Schiff's reagens</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-Plex Assay</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is een veel voorkomende precipitant van vroeggeboorte en wordt geassocieerd met veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder necrotiserende enterocolitis (NEC). Een mechanistisch verband tussen deze twee aandoeningen moet echter nog worden ontdekt. We hebben een murien model van chorioamnionitis aangenomen waarbij lipopolysaccharide (LPS) wordt veroorzaakt door foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Dit model van FEMI induceert een steriele maternale, placenta en foetale inflammatoire cascade, die ook aanwezig is in veel gevallen van klinische chorioamnionitis. Hoewel er modellen bestaan die levende bacteriën gebruiken en nauwkeuriger de pathofysiologie van een oplopende infectie nabootsen die resulteert in chorioamnionitis, kunnen deze methoden indirecte effecten hebben op de ontwikkeling van het onrijpe darmkanaal en het bijbehorende ontwikkelende microbioom. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat LPS-geïnduceerde FEMI resulteert in een dosisafhankelijke toename van zwangerschapsverlies en vroeggeboorte, evenals verstoring van de normale darmontwikkeling bij nakomelingen. Verder hebben we aangetoond dat FEMI darmletsel en serumcytokinen bij nakomelingen aanzienlijk verhoogt, terwijl tegelijkertijd de bokaal- en Paneth-cellen afnemen, die beide een eerste lijn van aangeboren immuniteit tegen darmontsteking bieden. Hoewel een soortgelijk model van LPS-geïnduceerde FEMI is gebruikt om de associatie tussen chorioamnionitis en daaropvolgende afwijkingen van het centrale zenuwstelsel te modelleren, is dit protocol voor zover wij weten het eerste dat probeert een mechanistisch verband tussen chorioamnionitis en latere verstoringen in de darmontwikkeling op te helderen als een potentieel verband tussen chorioamnionitis en NEC.

Blootstelling aan FEMI op embryonale dag 15 leidt tot een dosisafhankelijk zwangerschapsverlies en een dosisafhankelijk percentage vroegtijdige arbeid (Figuur 1)42. Voor de experimenten kozen we ervoor om een LPS-dosis van 100 μg/kg te gebruiken om zwangerschapsverlies en prematuriteit (50% verlies tussen zowel prematuriteit als intra-uteriene foetale ondergang) te minimaliseren, terwijl we de foetussen blootstelden aan een significante ontstekingsbelediging.
<p c...

We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Dit FEMI-protocol maakt het mogelijk om langetermijneffecten bij neonaten na foetale blootstelling aan maternale ontsteking te onderzoeken. Dit is vooral relevant voor de ontwikkeling van necrotiserende enterocolitis, of NEC. Deze techniek bootst steriele ontsteking na die vaak wordt gezien bij chorioamnionitis, en het ontbreken van levende bacteriën kan verstorende effecten hebben op de zich ontwikkelende darm en het microbioom.De belangrijkste stap van dit protocol is de LPS-injectie om FEMI te induceren. Het is van cruciaal belang dat een geschikte LPS-dosis wordt gebruikt en dat de injectie geen intraperitoneaal trauma veroorzaakt bij de drachtige muis. Begin door de LPS-stock een op 100 te verdunnen met steriele zoutoplossing voor een werkconcentratie van 20 microgram per milliliter.Inject zwangere vrouwtjes op draagtijdsdag E15. Weeg de muizen direct voorafgaand aan de injectie om de juiste LPS-dosering te bepalen, waarbij een gelijkwaardig volume normale zoutoplossing wordt gebruikt voor controledieren. Vortex de LPS-oplossing drie keer gedurende 15 seconden op hoog.Zuig het vervolgens op in een ene-milliliter spuit. Gebruik de scruffing-techniek om de zwangere muis te bepalen en houd deze in de dorsale rugligging. Steek ongeveer een kwart tot de helft van een 30-gauge, acht-millimeter naald met de punt omhoog, boven de rechter onderbuik op een hoek van 30 tot 40 graden.Trek aan de zuigerpomp om negatieve druk te creëren. Ga dan verder met de injectie als er negatieve druk aanwezig is. Bewaak de muizen gedurende ongeveer 30 minuten en plaats ze vervolgens terug in de kooien voor de rest van de zwangerschap.Laat de pups op E20 via vaginale bevalling worden geboren en laat ze bij de moeders blijven om ad libitum te voeden. Haal de darmen op op postnatale dag 14. Gebruik schaar en pincetten om een verticale insnijding te maken langs de middenlijn van de buik, door de huid en het buikvlies, voor de volledige lengte van de buik.Verwijder de dunne darm vanaf de maag tot de blindedarm en verwijder het mesenterium. Isoleer het distale derde deel van de dunne darm, verwijder het proximale deel van de dunne darm, de blindedarm en de dikke darm. Verdeel het ileumgedeelte in tweeën met schaar.Plaats vervolgens de proximale helft in een RNA-stabilisatieoplossing voor RNA-kwantificering en de distale helft in 10% neutraal gebufferde formaline voor preparatie van de dia's. Snijd het in paraffine ingebedde weefsel in plakken van vijf micrometer dik en bevestig ze op glazen dia's. Ontparaffine de dia's en kleur de secties vervolgens met hematoxine en eosine volgens standaardprocedures.Gebruik lichtmicroscopie om algemene darmschade te beoordelen door twee afzonderlijke, geblinddoekte onderzoekers op een schaal van drie punten, waarbij de integriteit van de villi en de scheiding van de basementmembraan worden geëvalueerd. Geef een score van nul om normale mucosa te beschrijven. Geef een score van een om lichte schade te beschrijven, die de ontwikkeling van subepitheliale Gruenhagen's ruimte, vacuolisatie of subepitheliale lift beperkt tot de lamina propria of toppen van villi omvat.Geef een score van twee om ernstige schade te beschrijven, aangegeven door epitheellift en vacuolisatie van meer dan de helft van de villi, villo-distorsie of mucosale ulceratie en desintegratie van de lamina propria. Dompel de dia's twee keer gedurende 10 minuten in xyleen. Spoel ze vervolgens af met 100% ethanol.Dompel de dia's gedurende drie minuten in 100% ethanol, 90% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol. Was de dia's vervolgens vijf minuten onder stromend water, waarbij de sectie van het water wordt gehouden om verlies van weefselmonster te voorkomen. Filter de Alcian-blauw kleurstofoplossing met een standaard koffiefilter en gebruik deze om de dia's 15 minuten te kleuren.Was ze vervolgens twee minuten onder stromend kraanwater. Verdun een milligram periodi acid in 200 milliliter dubbelgedestilleerd water en dompel de dia's gedurende vijf minuten in deze oplossing. Na een minuut wassen onder stromend water, kleuren de dia's gedurende 10 minuten met Schiff's reagens en wassen ze opnieuw gedurende vijf minuten.Kleur ze vervolgens een minuut met hematoxiline en was met water gedurende twee minuten. Dompel ze een minuut in zuur alcohol, vervolgens een minuut in Scott's kraanwater, gevolgd door een wassing onder stromend kraanwater gedurende een minuut. Om de dia's te dehydrateren, dompel elke dia tien keer in 70% ethanol, 90% ethanol en vervolgens 100% ethanol.Dompel de dia's tien minuten in 100% ethanol, gevolgd door twee keer onderdompelen in vers xyleen gedurende drie minuten. Plaats een druppel montagemedium op het specimen en een dekglas erop. Tel de gobletcellen onder de microscoop.Tel voor elk stukje darmweefsel het aantal gobletcellen en 500 epitheelcellen. Druk vervolgens de gobletcellen uit als een ratio per 100 epitheelcellen. Tel de Panethcellen.Tel voor elk stukje darmweefsel de verhouding van Panethcellen per darmcrypt, waarbij 100 darmcrypts worden geteld voor elk stukje darmweefsel. Foetale blootstelling aan maternale ontsteking, of FEMI, op embryonale dag 15 leidt tot een dosisafhankelijke verlies van zwangerschap en een dosisafhankelijke frequentie van vroeggeboorte. FEMI induceert een significante darmschade bij geboorte en op acht weken leeftijd.Deze schade treedt op in afwezigheid van aanvullende stimuli voor de dieren, wat suggereert dat FEMI alleen de normale homeostase van de pasgeboren muizendarm verstoort. Het aantal slijmproducerende gobletcellen en antimicrobiële peptideproducerende Panethcellen in het distale derde deel van de dunne darm werd gekwantificeerd. Er werd gevonden dat FEMI de normale samenstelling van het darmepitheel verstoorde door verlies van beide celtypen te induceren, vergeleken met dieren zonder FEMI.Om de effecten van FEMI op de neonatale inflamm

a-murine-model-fetal-exposure-to-maternal-inflammation-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Non-Invasive Model van Neuropathogenic Escherichia coli Infectie in de Neonatale Rat

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

Encephalopathie van prematuriteit omvat de afwijkingen van het centrale zenuwstelsel die geassocieerd zijn met letsel door vroeggeboorte. Dit rapport beschrijft een klinisch relevante rattenmodel van in utero tijdelijke systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische lipopolysaccharide toediening (LPS) die chorioamnionitis nabootst, en de gerelateerde impact van infectieuze stimuli en placentale ondervoeding op de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.

Modellering Encephalopathie van Prematurity gebruik van prenatale hypoxie-ischemie met Intra-vruchtwater Lipopolysaccharide bij ratten

Deze studie een overzicht van het proces van de precieze bedragen gavaging van probiotica met neonatale muizen. De experimentele opstelling is geoptimaliseerd om te omvatten maar is niet beperkt tot probiotische doseren, methoden voor beheer, en kwantificering van bacteriën in de darmen.

Probiotische Studies in neonatale muizen met behulp van de maagsonde

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is de ernstigste gastro-intestinale (GI) ziekte die vaak voorkomt bij premature baby's, vooral baby's met een zeer laag geboortegewicht, met een hoge mortaliteit en onduidelijke pathogenese. De oorzaak van NEC kan verband houden met inflammatoire immuunregulerende systeemafwijkingen. Een NEC-diermodel is een onmisbaar hulpmiddel voor nec-ziekte-immuunonderzoek. NEC-diermodellen gebruiken meestal C57BL / 6J neonatale muizen; BALB/c neonatale muizen worden...

Een neonatale BALB / c muismodel van necrotiserende enterocolitis

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Dit protocol schetst een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) en daaropvolgende isolatie van lamina propria-immuuncellen uit de neonatale muizendunne darm.

Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

Het artikel biedt een uitgebreid protocol om een muizenmodel voor moederlijke immuunactivatie (MIA) te genereren om de effecten van vroege zwangerschapsontsteking op de neuroontwikkeling te bestuderen, inclusief belangrijke meetwaarden om betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.

Generatie van het vroeg-zwangerschapsmodel van moederlijke immuunactivatie om prenatale ontsteking op de neuroontwikkeling te beoordelen

Leer een murien FEMI-model om de effecten van acute chorioamnionitis op neonatale darmontwikkeling te bestuderen. Deze methode gebruikt LPS-injectie om inflammatie te induceren en helpt onderzoekers de mechanismen van darmletsel en NEC te begrijpen.

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen (Video) | JoVE Journal

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Meer video's verkennen