Name: Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Ontdek een fosfaatproteomische methode voor het profileren van osmotische stresssignalering in Arabidopsis. Deze techniek biedt diepgaande inzichten in fosfoproteïne-veranderingen bij planten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen, Grant XDB27040106.

1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Oogst de met controle en spanning behandelde zaailingen (1 g) in een aluminiumfolie en vries de monsters in vloeibare stikstof. OPMERKING: Een hogere eiwitconcentratie wordt meestal waargenomen van twee weken oude zaailingen dan die van volwassen planten. Eén gram zaailingen genereert ongeveer 10 mg eiwitlysaat, wat voldoende is voor de MS-analyse. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 16.000 x g in stap 1.</li>
	<li>Maal bevroren zaailingen tot een fijn poeder met behulp van een vijzel en stamper gevuld met vloeibare stikstof.</li>
	<li>Voeg 1 ml lysisbuffer toe ((6 M guanidine-HCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) met 10 mM Tris (2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP), 40 mM 2-chloroacetamide (CAA), proteaseremmer en fosfaatremmercocktails) aan de mortier en meng met behulp van stamper.</li>
	<li>Breng de plant lysaat over in een buis van 1,5 ml en verwarm gedurende 5 minuten op 95 °C.</li>
	<li>Leg de buis 10 minuten op ijs. Soniceer de buis 10 s op ijs, pauzeer gedurende 10 s en herhaal driemaal.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 20 minuten en aliquot 150 μL plantlysaat in een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 600 μL 100% methanol toe aan de buis. Vortex en draai door de buis.</li>
	<li>Voeg 150 μL 100% chloroform toe aan de buis. Vortex en draai door de buis.</li>
	<li>Voeg 450 μL ddH2O toe aan de buis. Vortex en centrifugeren de buis gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Gooi de bovenste waterige laag weg. Voeg 600 μL 100% methanol toe aan de buis. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten en gooi de oplossing vervolgens weg.</li>
	<li>Was eiwitkorrels met 600 μL 100% methanol. Gooi de oplossing weg en droog de eiwitkorrel aan de lucht.</li>
	<li>Resuspendeer eiwitkorrels in 600 μL vergistingsbuffer (12 mM natriumdeoxycholaat (SDC)/12 mM natriumlaurylsarcosinaat (SLS) in 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Soniceer de buis totdat de suspensie is gehomogeniseerd.</li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-kit en pas de concentratie aan op 4 μg/μL met de vergistingsbuffer. Breng 100 μL van het lysaat (400 μg eiwitten) over in een nieuwe buis.</li>
	<li>Voeg 292 μL triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) en 8 μL Lys-C (2,5 eenheid/ml) toe aan de buis. Incubeer de buis gedurende 3 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 100 μL van 50 mM TEAB met 8 μg trypsine toe aan de buis. Incubeer de buis gedurende 12 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 25 μL 10% trifluoracetinezuur (TFA) toe aan de buis. Vortex en centrifugeren de buis gedurende 20 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de supernatant over in een geconditioneerde ontaltingskolom voor ontsalting. Droog het eluaat met een vacuümcentrifugeconcentrator. OPMERKING: Activeer de hars met 1 ml methanol gevolgd door 1 ml 0,1% TFA in 80% acetonitril (ACN). Was het organische oplosmiddel met ten minste 3 ml van 0,1% TFA in 5% ACN. Laad verzuurde peptidemonsters bereid in stap 1.16 in de kolom en was de kolom vervolgens met ten minste 3 ml van 0,1% TFA in 5% ACN. Meer wasbeurten kunnen nodig zijn voor monsters met hoge zoutconcentraties. Elute de fosffopeptiden met 1 ml van 0,1% TFA in 80% ACN.</li>
</ol>2. Tandem Mass Tag (TMT) etikettering
<ol><li>Resuspendeer de gedroogde peptiden in 100 μL van 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES), pH 8,5.</li>
	<li>Los het TMT-reagens van elk kanaal (0,8 mg) op in 40 μL watervrij ACN. Draai de TMT-reagensbuis gedurende 5 minuten en draai deze naar beneden.</li>
	<li>Breng 40 μL TMT over in de monsterbuis en broed gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: In dit experiment werden kanaal 126 tot 128 geëtiketteerd met drie biologische replica's van planten zonder mannitolbehandeling, en het kanaal 129 tot 131 werd geëtiketteerd met drie biologische replica's van planten met mannitolbehandeling.</li>
	<li>Voeg 8 μL hydroxylamine van 5% toe en incubeer gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Meng 6 monsters in een tube van 5 ml en voeg 14 μL van 10% TFA toe.</li>
	<li>Voeg 3.876 μL van 0,1% TFA toe aan de buis. Vortex en draai naar beneden.</li>
	<li>Breng de oplossing over naar een geconditioneerde ontsaltingskolom voor ontsalting. Droog het eluaat met een verdamper.</li>
</ol>3. Voorbereiding van de IMAC-podiumtip
<ol><li>Gebruik een 16 G stompe naald om een polypropyleen fritschijf te penetreren. OPMERKING: Houd de frees loodrecht op het oppervlak van de schijf en rol de frees een paar keer om er zeker van te zijn dat de schijf volledig is verwijderd. Plaats de schijf in een Petrischaal voor opslag. Plaats de naald in een pipettip van 200 μL en duw de frit met een zuiger in de punt.</li>
	<li>Druk de frit voorzichtig in de punt met een zuiger om het uiteinde van de punt te doken.<ol>
<li>Plaats de fritschijf in uiteinden met dezelfde druk, wat zorgt voor een betere reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van de productie van fasetips is belangrijk voor een constante tegendruk, wat van invloed is op de timing van de centrifugestappen en de reproduceerbaarheid tussen technische replica's.</li>
		<li>Als de traptips een hoge tegendruk vertonen tijdens de conditioneringsstap, gooi dan de tips weg om mogelijke verstopping van de tip tijdens het laden van monsters te voorkomen. Het kan zijn dat de schijf te hard in positie is gedrukt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Draai de Ni-NTA spinkolom om en plaats deze op een buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Gebruik een zuiger om de frit van Ni-NTA kralen zachtjes te drukken en duw de kralen in de buis. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de frit voorzichtig duwt om het mogelijke kraalverlies of adsorptie op de spinkolom te voorkomen.</li>
</ol>4. Voorbereiding van hp-RP fase tip
<ol><li>Bereid hp-RP-traptip voor zoals beschreven voor IMAC-traptip met behulp van een C8-schijf. OPMERKING: Oefen geen grote kracht uit op de schijf, omdat dit kan leiden tot een dicht opeengepakte frit en de tegendruk van de trappunt kan verhogen. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 1.000 x g gedurende 5 minuten in stap 4.</li>
	<li>Schortel 1 mg C18 kralen in 100 μL 100% methanol en passeer de kralenoplossing door de punt.</li>
	<li>Voeg 20 μL buffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) toe aan de podiumtip en passeer buffer 8 door de punt door middel van centrifugatie.</li>
	<li>Voeg 20 μL buffer A (200 mM NH4HCO2) toe aan de fasetip en passeer buffer A door de punt door middel van centrifugatie. OPMERKING: Breng de centrifuge tijdens het gebruik in evenwicht en zorg ervoor dat de Hp-RP-trapstip niet volledig is gedroogd.</li>
</ol>5. Voorbereiding van spinadapter
<ol><li>Gebruik een scherp pincet om een gat in het midden van het deksel van een buis van 1,5 ml te prikken.</li>
	<li>Steek de IMAC-traptip of hp-RP-trapstip in het gat van de spinadapter. OPMERKING: Zorg ervoor dat de punt van het podium niet dicht bij de onderkant van de spinadapter ligt.</li>
</ol>6. Phosphopeptide verrijking met behulp van IMAC stadium tip
<ol><li>Schortel de 10 mg Ni-NTA kralen op met 400 μL laadbuffer (6% azijnzuur (AA), pH 3.0) en laad alle kralenoplossing in per punt. Passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie. OPMERKING: Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 200 x g gedurende 3 minuten in stap 6 naast stap 6.8.</li>
	<li>Laad 100 μL ethyleendiaminetetraaceaanzuur (EDTA) van 50 mM om de nikkelionen uit de IMAC-fasetip te verwijderen en de oplossing door centrifugeren door de punt te laten gaan.</li>
	<li>Laad 100 μL laadbuffer op de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.</li>
	<li>Laad 100 μL van 50 mM FeCl3 in 6% AA naar de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie. Fe3+ ionen cheleren naar IMAC stage tip.</li>
	<li>Laad 100 μL laadbuffer om de fasetip te conditioneren en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.</li>
	<li>Laad 100 μL laadbuffer met monsterpeptiden bereid in stap 2.7 tot de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie. OPMERKING: Neem een nieuwe buis als spinadapter om de doorstroming van het monster te verzamelen en bewaar de doorstroming in de vriezer voor toekomstige analyse.</li>
	<li>Laad 100 μL wasbuffer (4,5% AA en 25% ACN) in de fasetip en passeer de oplossing door de punt door middel van centrifugatie.</li>
	<li>Voer de tweede wasbeurt uit met laadbuffer. Laad 100 μL laadbuffer op de traptip en passeer de oplossing door de punt met 1000 × g centrifuge gedurende 3 minuten. OPMERKING: Zorg ervoor dat de wasbuffer wordt vervangen door een laadbuffer in de fasetip om het verlies van fosfopeptiden tijdens de elutiestap te elimineren. Evenwicht van de IMAC-fasepunt voorafgaand aan fosfopeptide-elutie om ervoor te zorgen dat de concentratie ACN lager is dan 5%.</li>
	<li>Knip de IMAC-podiumtip aan de voorkant bij met een schaar en plaats de bijgesneden IMAC-podiumtip in de Hp-RP-tip. Zorg ervoor dat de twee lagen podiumtips het deksel van de centrifuge niet raken.</li>
</ol>7. Fosfopeptide fractionering met hp-RP C18 fase tip
<ol><li>Voeg 100 μL elutiebuffer (200 mM ammoniumfosfaat (NH4H2PO4)) toe aan de bijgesneden IMAC-fasetip en passeer de oplossing door de twee lagen fasepunten door middel van centrifugeren. OPMERKING: Als de oplossing niet door de traptip gaat, verhoogt u de snelheid van het naar beneden draaien. Alle centrifugatiestappen vinden plaats bij 1.000 x g gedurende 5 minuten in stap 7. Alle Hp-RP-buffers staan vermeld in tabel 1.</li>
	<li>Gooi de IMAC-traptip weg met een pincet en voeg 20 μL buffer A toe aan de Hp-RP-traptip en passeer de buffer door de punt door middel van centrifugatie. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle elutiebuffer door de IMAC-fasetip gaat voordat u deze weggooit.</li>
	<li>Voeg 20 μL buffer 1 toe aan elutefractie 1 en verzamel het eluaat in een nieuwe buis door centrifugatie. Herhaal het proces met buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8 om elke fractie in een nieuwe buis te verzamelen. Droog het uiteindelijke eluaat van elke fractie met behulp van een vacuümconcentrator. OPMERKING: Bereid nieuwe fractioneringsbuffers voor. Neem 8 nieuwe buizen als spinadapter van elke fractie. Verzamel het eluaat van elke fractie in een andere spinadapter. Fosfiumpeptiden zijn niet stabiel onder basisomstandigheden, dus droog de eluaten onmiddellijk door een concentrator of verzuurd met 10% TFA.</li>
</ol>8. LC-MS/MS-analyse en gegevensanalyse
<ol><li>Voeg 5 μL van 0,1% mierenzuur (FA) toe en analyseer het monster met een massaspectrometer.</li>
	<li>Voer een verloop van 90 minuten uit met 6-30% buffer B (80% ACN en 0,1% FA) voor elke fractie.</li>
	<li>Fragmenteer de top 10 gelabelde peptiden met behulp van high collision energy dissociation (HCD). Voltooi een databasezoekopdracht om fosforyleringssites te identificeren.</li>
	<li>Laad de onbewerkte bestanden in de MaxQuant-software, geef de experimenten een naam en stel breuken en PTM in. OPMERKING: De tutorial van MaxQuant software is te vinden op https://www.maxquant.org/.</li>
	<li>Selecteer reporter ion MS2 in het type LC-MS/MS run en 6plex TMT als isobarische labels. Schakel filter op PIF-functie in en stel de min PIF in op 0,75.</li>
	<li>Selecteer Acetyl (Protein N-term), Oxidation (M) en Phospho (STY) in het paneel met variabele wijzigingen. Selecteer Carbamidomethyl (C) als vaste wijzigingen.</li>
	<li>Stel de spijsverteringsmodus in als specifiek, selecteer Trypsine/P als spijsverteringsenzym en twee gemiste decolleté.</li>
	<li>Stel psm false discovery rate (FDR) en eiwit FDR in op 0,01. Stel de minimumscore voor gemodificeerde peptiden in op 40.</li>
	<li>Voeg Arabidopsis thaliana database toe aan het paneel van fasta bestanden en voer database zoeken uit.</li>
	<li>Laad het txt-bestand van Phospho (STY) sites naar de Perseus software terwijl het zoeken wordt gedaan. OPMERKING: De gedetailleerde tutorials van Perseus software zijn te vinden op https://www.maxquant.org/perseus/.</li>
	<li>Filter de omgekeerde fosforyleringsplaatsen eruit. Filter de niet-gelokaliseerde fosforyleringslocaties uit met lokalisatiekans 75% als afsluiting.</li>
	<li>Gebruik de intensiteiten van fosforyleringslocaties voor statistische analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cellular+and+molecular+responses+to+high+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Plant+Physiology+Plant+Molecualr+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cellular and molecular responses to high salinity.</a> Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).</li>
<li>Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+tolerance+in+plants%3A+Changes+at+the+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level.</a> Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).</li>
<li>Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+networks+in+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Enzymes%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway.</a> Enzymes. 35, 27-56 (2014).</li>
<li>Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+challenges+in+plant+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+proteome-wide+targets+of+protein+kinases+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).</li>
<li>Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+decuple+mutant+reveals+the+importance+of+SnRK2+kinases+in+osmotic+stress+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+identifies+SnRK2+protein+kinase+substrates+and+reveals+the+effectors+of+abscisic+acid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).</li>
<li>Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nine+sucrose+nonfermenting+1-related+protein+kinases+2+activated+by+hyperosmotic+and+saline+stresses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).</li>
<li>Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+technologies+and+applications+in+plant+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 430(2015).</li>
<li>Hsu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+plant+phosphoproteomics+workflow+and+its+application+to+Tomato+signaling+in+response+to+cold+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress.</a> Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068(2018).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+affinity+chromatography+revisited%3A+pH%2Facid+control+toward+high+selectivity+in+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).</li>
<li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Ruprecht, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+reproducible+phosphopeptide+enrichment+using+iron+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+%28Fe-IMAC%29+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns.</a> Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).</li>
<li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+enrichment+by+aliphatic+hydroxy+acid-modified+metal+oxide+chromatography+for+nano-LC-MS%2FMS+in+proteomics+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications.</a> Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+phosphoproteomic+enrichment+through+complementary+metal-directed+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+identification+of+phosphopeptides+from+putative+basophilic+kinase+substrates+using+Ti+%28IV%29+based+IMAC+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment.</a> Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-pH+reverse+phase+stageTip+for+sensitive+small-scale+membrane+proteomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling.</a> Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+the+TOR+Kinase+and+ABA+receptor+balances+plant+growth+and+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response.</a> Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAF-SnRK2+kinase+cascade+mediates+early+osmotic+stress+signaling+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants.</a> Nature Communications. 11 (1), 613(2020).</li>
<li>Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phosphoproteomics+reveals+in+vivo+insulin+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).</li>
<li>Bekker-Jensen, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+shotgun+strategy+for+the+rapid+generation+of+comprehensive+human+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes.</a> Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).</li>
<li>Possemato, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+phosphoproteomic+profiling+using+titanium+dioxide+and+immunoaffinity+enrichments+reveals+complementary+phosphorylation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events.</a> Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).</li>
<li>Hogrebe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+common+quantification+strategies+for+large-scale+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics.</a> Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+of+Arabidopsis+Highly+ABA-Induced1+identifies+AT-Hook-Like10+phosphorylation+required+for+stress+growth+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).</li>
<li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Het dynamisch bereik en de complexiteit van plantproteoom en fosfaatproteom zijn nog steeds een beperkende factor tot diepte van fosfaatproteomics analyses. Ondanks het vermogen van single run LC-MS/MS-analyse om 10.000 fosforyleringslocaties21,22te identificeren, is de dekking van het hele fosfaat van de installatie nog steeds beperkt. Daarom is een fosfaatprotemische workflow vereist die een hoge gevoeligheid en superieure scheidingsefficiëntie biedt bij het pr...

Hoge zoutgehalte, lage temperatuur en droogte veroorzaken osmotische spanningen, wat een belangrijke milieufactor is die de productiviteit van planten beïnvloedt1,2. Eiwitfosforylatie is een van de belangrijkste post-translationele modificaties die signaalperceptie en transductie bemiddelen in de reactie van planten op osmotische stress3,4,5. SNF1-gerelateerde eiwitkinase 2s (SnRK2s) zijn betrokken bij de osmotische stresssignalering6. Negen van de tien leden van de SnRK2-familie vertonen een aanzienlijke activering als reactie op osmotische stress7,8. De snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant met mutaties in alle tien SnRK2 vertoonde overgevoeligheid voor osmotische stress. In snrk2-dec mutant wordt de osmotische stress-geïnduceerde accumulatie van inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3),abscisinezuur (ABA) biosynthese en genexpressies sterk verminderd, wat de vitale rol van SnRK2s in osmotische stressreactiesbenadrukt 6. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe SnRK2s kinases deze biologische processen reguleren. Profilering van de fosfaatprotemische veranderingen als reactie op osmotische stress is een efficiënte manier om deze kloof te overbruggen en de osmotische stress-geactiveerde verdedigingsmechanismen in planten af te baken.
Massaspectrometrie (MS) is een krachtige techniek voor het in kaart brengen van plantfosfaat9. Karakterisering van plantfosfaatproteomics blijft echter een uitdaging vanwege het dynamische bereik van plantenproteoom en de complexiteit van plantlysaat4. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden we een universele plantfosfoproteomische workflow, die ongewenste interferenties zoals van fotosynthetische pigmenten en secundaire metabolieten elimineert en de diepe dekking van plantfosfaat10mogelijk maakt. Verschillende fosfopeptideverrijkingsmethoden zoals geïmmobiliseerde metaalionaffiniteitschromatografie (IMAC) en metaaloxidechromatografie (MOC) zijn ontwikkeld voor het verrijken van fosfopeptiden voorafgaand aan MS-analyse11,12,13,14,15,16. Zure niet-fosfiumpeptiden co-zuiveren met fosfopeptiden zijn de belangrijkste interferenties voor fosfopeptide detectie. Voorheen hebben we de pH-waarde en organische zuurconcentratie van de IMAC-belastingsbuffer gestandaardiseerd om de binding van niet-fosfopeptiden te elimineren, om meer dan 90% verrijkingsspecificatie te verkrijgen die de prefractiestap11omzeilt.
Monsterverlies in het meerstapsproces van fosfopeptideverrijking en fractionering belemmert de gevoeligheid van de identificatie van fosfopeptiden en de diepte van de fosfaatprotemische dekking. Stop-and-go-extractie tips (fase tips) zijn pipet tips die kleine schijven bevatten om het uiteinde van de punt te doppen, die kunnen worden opgenomen met chromatografie voor peptide fractionering en reiniging17. Monsterverlies tijdens de fasepuntprocedure kan worden geminimaliseerd door monsteroverdracht tussen de buizen te voorkomen. We hebben met succes fasetip geïmplementeerd in Ga3 +- IMAC en Fe3 +- IMAC om laag overvloedige meerdere gefosforyleerde peptiden te scheiden van afzonderlijk gefosforyleerde peptiden, wat de diepte van menselijk fosfoproteom15verbeterde. Bovendien heeft het gebruik van een hoge pH-omgekeerde fase (Hp-RP) fasetip de bredere dekking van het proteoom van het menselijk membraan aangetoond in vergelijking met die van sterke kationenuitwisseling (SCX) en sterke anionenuitwisseling (SAX) chromatografie18. Daarom kan de integratie van IMAC- en Hp-RP-trapstiptechnieken de dekking van plantfosfoproteom verhogen met eenvoud, hoge specificiteit en hoge doorvoer. We hebben aangetoond dat deze strategie meer dan 20.000 fosforyleringslocaties van Arabidopsis-zaailingen identificeerde, wat een verbeterde diepte van plantfosfaat19vertegenwoordigt.
Hier rapporteren we een op tips gebaseerd fosfaatprotemofoonprotocol voor fosfaatprotemische profilering in Arabidopsis. Deze workflow werd toegepast om de fosfaatprotemische verstoring van wilde-type en snrk2-dec mutant zaailingen te bestuderen als reactie op osmotische stress. De fosfaatprotemische analyse onthulde de fosforyleringslocaties die betrokken zijn bij kinaseactivering en vroege osmotische stresssignalering. Vergelijkende analyse van wild-type en snrk2-dec mutante fosfaatgegevens leidde tot de ontdekking van een Raf-achtige kinase (RAF)-SnRK2 kinase cascade die een sleutelrol speelt in osmore stresssignalering in hoge planten.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tube</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes</td></tr><tr><td>200 &micro;L pipet tip</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-chloroacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>ammonium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>ammonium phosphate monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>blunt-ended needle</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16</td></tr><tr><td>C18-AQ beads</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &micro;m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore disk</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>data analysis software</td><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Frits</td><td>Agilent</td><td>12131024</td><td>Frits for SPE Cartridges</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iron (III) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>mass spectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>nano LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA spin column</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>plunger</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 &mu;l)</td></tr><tr><td>search engine software</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>https://www.maxquant.org</td></tr><tr><td>SEP-PAK Cartridge 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Triethylammonium bicarbonate buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Eiwitfosforylatie is cruciaal voor de regulatie van enzymactiviteit en genexpressie onder osmotische conditie. Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde phosphoproteomics heeft de manier van het bestuderen van plantsignaaltransductie veranderd. De eis van veel uitgangsmaterialen en een langere meettijd van de lidstaten om de diepte van de dekking te bereiken, was echter de beperkende factor voor de studie met een hoge doorvoer van wereldwijde fosfaatprotemische veranderingen in planten. Om de gevoeligheid en doorvoer van plantaardige fosfoproteomics te verbeteren, hebben we een stop and go extractie (stage) tip gebaseerde phosphoproteomics aanpak ontwikkeld in combinatie met Tandem Mass Tag (TMT) etikettering voor de snelle en uitgebreide analyse van plantfosforylatie perturbatie als reactie op osmotische stress. Gebruikmakend van de eenvoud en hoge doorvoer van fasepunttechniek, duurt de hele procedure ongeveer een uur met behulp van twee tips om fosfopeptideverrijking, fractionering en monsterreinigingsstappen af te ronden, wat een gebruiksvriendelijke en hoge efficiëntie van de aanpak suggereert. Deze aanpak biedt niet alleen een diepgaande analyse van de fysfoproteomics (> 11.000 fosfopeptide-identificatie), maar toont ook de superieure scheidingsefficiëntie (< 5% overlap) tussen aangrenzende fracties aan. Verder is multiplexing bereikt met behulp van TMT-etikettering om de fosfaatprotemische veranderingen van wilde en snrk2 decuple mutante planten te kwantificeren. Deze aanpak is met succes gebruikt om de fosforyleringsgebeurtenissen van Raf-achtige kinases te onthullen als reactie op osmotische stress, die licht werpt op het begrip van vroege osmotische signalering in landplanten.

Om de prestaties van deze workflow aan te tonen, hebben we gebruik gemaakt van IMAC stage tip in combinatie met Hp-RP stage tip fractionatie om de fosfaatproteomische veranderingen in wild-type en snrk2-dec mutant zaailingen met of zonder mannitol behandeling gedurende 30 minuten te meten. Elk monster werd uitgevoerd in biologische drievouden en de experimentele workflow is weergegeven in figuur 1. De verteerde peptiden (400 μg) van elk monster werden geëtiketteerd met één TMT-6plex...

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Deze strategie is een krachtig hulpmiddel voor het uitgebreid bestuderen van de wereldwijde veranderingen van planten-fosfoproteomen, als reactie op biotische of abiotische stress. Deze techniek maakt diepgaande fosfoproteomics-analyse mogelijk, op een gebruiksvriendelijke en hoogdoorvoerige manier. Voor de bereiding van de IMAC-stagetip, gebruik een 16 gauge stomp eindigende naald, om een propyleen frit-schijf te doorboren, en gebruik een plunjer om de frit voorzichtig in de tip te drukken.Plaats vervolgens een omgekeerde nikkel-NTA spinkolom op een 1,5 milliliter buis, en gebruik de plunjer om de frit van nikkel-NTA-kralen voorzichtig in de buis te drukken. Voor fosfopeptide-verrijking, gebruikt een IMAC-stagetip, voeg 400 microliters laadbuffer toe aan de nikkel-NTA-kralen, en laad het volledige volume van de kraallossing in één IMAC-stagetip. Laat de oplossing door de tip passeren door centrifugatie en laad 100 microliters van 50 millimolair EDTA, om de nikkelionen van de tip te strippen door centrifugatie.Behandel de tip met 100 microliters laadbuffer door centrifugatie. Behandel vervolgens de tip met 100 microliters van 50 millimolair ijzerchloride in 6% azijnzuur, door centrifugatie. Condisioneer de stage met 100 microliters laadbuffer, door centrifugatie.Gevolgd door centrifugatie met 100 microliters laadbuffer, aangevuld met de monsterpeptiden. Na centrifugatie, spoel de tip twee keer, met 100 microliters wasbuffer per spoeling, gevolgd door één spoeling met 100 microliters laadbuffer. Aan het einde van de centrifugatie, gebruik schaar om de voorkant van de IMAC-stagetip bij te snijden en plaats de bijgesneden tip in de high pH, omgekeerde fase tip.Voor fosfopeptide-fractionering, gebruik een hoge pH omgekeerde fase C18 stagetip, laat 100 microliters elutiebuffer door beide lagen van stagetips passeren, door centrifugatie. Aan het einde van de spin, gebruik pincetten om de IMAC-stagetip weg te gooien, en voeg 20 microliters Buffer A toe, aan de hoge pH omgekeerde fase stagetip. Na centrifugatie, voeg 20 microliters Buffer 1 toe, aan de verzamelde fractie, en verzamel het eluaat in een nieuwe buis, door centrifugatie.Herhaal het proces met Buffers 2 t/m 8, totdat alle acht fracties zijn verzameld. Droog vervolgens het uiteindelijke eluaat van elke fractie in een vacuüm concentrator. In deze representatieve analyse werden in totaal 8.107 en 7.248 Fosfopeptiden geïdentificeerd uit wild type, en SnRK2 decuple mutanten monsters respectievelijk, wat de efficiëntie van de workflow aantoont in het verstrekken van diepgaande dekking voor het bepalen van de globale visie van signaaltransductie in Arabidopsis.Vergelijking van het aantal geïdentificeerde fosfopeptiden over acht fracties onthulde de aanwezigheid van weinig fosfopeptiden in de eerste twee fracties, maar het merendeel van de fosfopeptiden was gelijkmatig verdeeld over de laatste zes fracties. Dit suggereert dat deze benadering de mogelijkheid biedt om complexe fosfopeptiden van het planten-fosfoproteoom te scheiden. Evaluatie van de overlap van fosfopeptiden tussen twee aangrenzende fracties, gaf aan dat minder dan 5%van de fosfopeptiden overlapten, in de aangrenzende fracties.Na mannitol-behandeling, waren 433 fosforyleringsplaatsen verhoogd in het wild type monster. Terwijl 380 plaatsen verhoogd waren in het SnRK2 decuple mutanten monster. Onder deze, vertoonden 312 fosfoplaatsen inductie in wild type, maar niet in SnRK2 dec mutante planten.Het is belangrijk om dezelfde hoeveelheid druk te gebruiken om de frit-schijf in de tips te laden, om een betere reproduceerbaarheid van de analyse te garanderen. Binnenkort kan kationenuitwisselingschromatografie worden gebruikt, als alternatieve maatregel, voor het fractioneren van de verrijkte fosfopeptiden, om een bredere dekking van het planten-fosfoproteoom te verkrijgen.

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.

Verzameling en analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.

Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Een eenvoudige, veelzijdige en goedkope in vitro hydrocultuur systeem werd met succes geoptimaliseerd, inschakelen van grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden. Dit systeem vergemakkelijkt de toepassing van chemische stoffen in een oplossing en hun efficiënte absorptie door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies.

Een flexibele goedkope hydrocultuur systeem voor de beoordeling van de Plant reacties op kleine moleculen onder steriele omstandigheden

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Ontdek een fosfaatproteomische methode voor het profileren van osmotische stresssignalering in Arabidopsis. Deze techniek biedt diepgaande inzichten in fosfoproteïne-veranderingen bij planten.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

Meer video's verkennen