Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Dit protocol biedt een celcultuurplatform waar de eigenschappen van extracellulaire matrix zoals stijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie nauwkeurig kunnen worden gecontroleerd op een kosteneffectieve en facile manier. De methode is kosteneffectief en vereist geen speciale training of faciliteiten. Het is ook compatibel met meerdere cellulaire kwantificering methoden zoals immunofluorescente vlekken en westerse vlek.

Deze techniek biedt een mechanistisch begrip van Schwann celbiologie. Met extra inzicht in biomateriaal ontwerp voor het zenuwstelsel regeneratie, kan worden toegepast op elke verankering afhankelijke cellen. Het meest uitdagende deel van dit protocol, is microcontact afdrukken.

Voorafgaand aan het begin van het protocol, microcontact afdrukken op substraat met behulp van een florescent om het eiwit tag om visueel te controleren van de uiteindelijke afdruk aan het patroon. Begin met het krachtig mengen van de PDMS base elastomeer en uithardingsmiddelen met een pipetpunt totdat bellen homogeen verspreid zijn in het mengsel. Verwijder vervolgens de bellen met vacuüm uitdroging.

Plaats een druppel van het uitgedroogde PDMS-mengsel op een vierkante of cirkelvormige coverslip en draai de coverslip op een spincoater op 2, 500 tpm gedurende 30 seconden. Incubeer de coverslip in een oven op 60 graden Celsius, gedurende een tot twee uur, of bij kamertemperatuur 's nachts. Om een micro patroon substraat voor te bereiden, plaats een patroon silicium wafer in een cirkelvormige 150 millimeter diameter bij 15 millimeter hoogte Petri schotel en giet onverpakte PDMS op de wafer.

Gestolde de PDMS in een oven op 60 graden Celsius 's nachts. Laat de PDMS afkoelen tot kamertemperatuur. Gebruik dan een chirurgische scalpel om stempels van 30 bij 30 millimeter vierkanten te snijden die de correcte patronen bevatten die ervoor zorgen om de siliciumwafer niet te beschadigen.

Steriliseer de PDMS-stempels en afstembare afdekbonnen door ze gedurende 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Om de werkzaamheid van het micropatroon te bevestigen, droogt u het oppervlak van de PDMS-stempels met behulp van een gefilterde luchtstroom en pipet 15 microgram per milliliter BSA-oplossing om de gehele patroonzijde van de stempel te bedekken. Broed de stempels met de BSA-oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur om eiwitad adsorptie mogelijk te maken en droog de stempels vervolgens aan om de BSA-oplossing te verwijderen.

Gebruik de gefilterde luchtstroom om het oppervlak van de afstembare afdekslipjes te drogen. Breng de gedesssorimeter van de stempel in overeenstemming met de afstembare coverslip om BSA-adsorptie op het coverlipoppervlak mogelijk te maken en druk de stempel gedurende vijf minuten voorzichtig tegen de coverlip. Bestudeer het micropatroon met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een FITC-filter.

Om celkleefgebieden af te drukken in plaats van fluorescerende patronen vervangen laminine voor BSA-eiwit. Haal de stempels van de afdekbonen en breng de deksel slips in een gesteriliseerde zes-put plaat. Voeg twee milliliter van 0,2%Pluronic F-127 oplossing in elke put om het oppervlak van de cover slip te dekken en de plaat incubeer voor een uur bij kamertemperatuur.

Aspirate de F-127 oplossing en was de cover glijdt vijf keer met PBS, een keer met de cel cultuur medium, dan zaad van de Schwann cellen bij een zaaien dichtheid van 1000 cellen per vierkante centimeter. 45 minuten na het zaaien van cellen, verwijder de cel cultuur medium en was de cover glijdt twee keer met PBS om te voorkomen dat meerdere cellen zich aan hetzelfde patroon. Houd cellen in de gewenste celkweekomgeving gedurende 48 uur voor kwantificering.

Als u celkubstraten met lijnpatroon wilt maken voor het onderzoeken van uitgelijnde cellen, maakt u de stempels volgens de handschriftrichtingen en snijdt u ze naar de gewenste afmetingen. Bereid twee petrischaaltjes bedekt met een tuneable PDMS-oppervlak zoals eerder beschreven, en voer microcontactafdrukken uit om cellijmgebieden met lijnpatroon op een van de gerechten af te drukken. Vul na het verwijderen van de stempels de petrischaal met vier milliliter van 0,2%Pluronic F-127-oplossing en incubbate het een uur lang uit.

Spoel elke kant van de PDMS-stempel drie keer af met 70% ethanol en droog deze met lucht. Draai de PDMS-stempels en druk het niet-gepatterde celkleefgebied af op de tweede petrischaal zoals eerder beschreven. Na het uitbroeden van de gerechten met de F-127 oplossing, verwijder de oplossing en was de gerechten drie keer met PBS en eenmaal met verse celkweek medium.

Dan zaadcellen op de gerechten, en onderhouden ze op de gewenste omstandigheden voor 48 uur voor de voorbereiding van lysates. Om lysates voor te bereiden, was de cellen met ijskoude PBS gedurende twee minuten, voeg vervolgens 80 microliter ripa-oplossing, bereid volgens de handschriftaanwijzingen, toe aan elk celkleefgebied en broed de cellen gedurende 25 minuten uit op een ijsblok. Schraap de Schwann cellen vijf minuten met de celschraper en verzamel het lysaat in een gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Centrifuge het lysaat gedurende 15 minuten op 12 duizend keer G en vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng het naar een schone microcentrifuge buis. Laminin gecoate substraten resulteerde in een hogere proliferatie tarief in vergelijking met collageen en fibronectin gecoate substraten.

Schwann cellen op substraten met laminine coating en verschillende moduli toonde aan dat relatief zachtere substraten verminderde celproliferatie tarieven. De cellen werden ook geanalyseerd voor eiwitexpressie. Transcriptional factor c-Jun expressie werd upregulated als substraten werd zachter.

Echter, het was aanzienlijk downregulated op de zachtste substraten. Op stijve substraten resulteerden collageengecoate substraten in de hoogste c-Jun expressie, omdat substraten zachter werden, laminine toonde de hoogste niveaus van c-Jun. De cellen werden vervolgens bevlekt met rhodamine-phalloidin om de rol van cel verspreiding en gebied in c-Jun expressie te verkennen.

Toen celkleeflijnen werden gecreëerd op de substraten van de celkweek, nam de nucleaire beeldverhouding van cellen die op het patroonsubstraat waren gezaaid, toe ten opzichte van die van cellen op niet-gepaste substraten. Expressie van zowel c-Jun en p75 neurotrofine receptor waren upregulated in dichte cellen met een kleiner verspreidingsgebied. Line-patroon cellen resulteerde ook in een hogere expressie van zowel c-Jun en p75 NTR in vergelijking met niet-gepaterde cellen.

Microcontact geprinte celkleefgeometrieën zijn gemaakt om het verspreidingsgebied en de rek van cellen nauwkeurig te controleren en tegelijkertijd cel- en celinteracties te elimineren. Het verhogen van de cellulaire aspect ratio veroorzaakt nucleaire verlenging te verhogen. De uitdrukking van c-Jun werd upgereguleerd door zowel cellulaire rek als celsprekende remming.

Immunofluorescentie kleuring voor zowel kernen als actine bevestigde dat cel verspreiding gebied en rek werden precies gecontroleerd door middel van deze micropatterning methode. Deze techniek maakte een manier om onze tunable substraten te gebruiken als methode om de celbiologie van Schwann en de signalering in de context van regeneratie en kanker mechanistisch te analyseren.