Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Veroudering wordt gekenmerkt door de tijd-afhankelijke verslechtering van meerdere cellulaire processen die uiteindelijk verhoogt de kans op organisale dood. Binnen een populatie is dit proces variabel en kunnen een aantal genetische en omgevingsfactoren het beïnvloeden. Een van de best bestudeerde en begrepen variabelen is de rol van dieet op levensduur.

Dieet beperking is een interventie die uiteindelijk vertraagt het begin van veroudering en veroudering-geassocieerde veranderingen. Dit verhoogt de levensduur en gezondheidsduur van een organisme, of de lengte van de tijd waarin een organisme een normaal, gezond leven heeft. Ons huidige inzicht heeft geleid tot de identificatie van een duidelijke reeks cellulaire veranderingen die de kenmerken van veroudering zijn genoemd, zoals de accumulatie van mutaties, ontregeling van telomeren, een verlies van eiwithomeostase, ademhalingsproblemen en reactieve zuurstofsoorten, onder anderen.

Veel van dit inzicht komt voort uit studies die veel verschillende modelorganismen gebruiken. Er zijn veel genetische schermen die genen hebben geïdentificeerd die zowel de levensduur verkorten als verlengen. En deze omvatten studies in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae, dat is de focus van deze methodologie, evenals studies in meer complexe meercellige organismen, zoals C.elegans en het murine systeem.

Van deze echter, de ontluikende gist is bijzonder vatbaar voor veroudering studies als gevolg van de korte natuurlijke levensduur en een aantal genetische benaderingen die de complexe genetische relaties kunnen ontrafelen, waardoor het een uitstekend systeem voor functionele dissectie van de genetica van veroudering. Gist kan worden gebruikt om verschillende aspecten van veroudering te bestuderen. En we zullen ons richten op chronologische levensduur, de duur dat een cel kan overleven.

Het doel van dit werk is om een eenvoudige genetische benadering te presenteren om een over-expressie suppressor scherm uit te voeren. We zullen gebruik maken van een genetische achtergrond die resulteert in een abnormaal verkorte chronologische levensduur. En we gebruiken een gerichte aanpak om genen te identificeren die de verkorte levensduur fenotype kunnen redden of onderdrukken, in een poging genen te identificeren die een normale levensduur herstellen.

De eerste genetische achtergrond is een autofagie-deficiënte stam van gist. Autofagie, dat zich losjes vertaalt als zelfetend, is een intracellulair afbraaksysteem om cytosolische producten, zoals eiwitten en organellen, aan het lysoos te leveren. Dit helpt handhaven cellulaire homeostase door het elimineren van beschadigde eiwitten, evenals degenen die hun leven hebben overleefd.

We zullen werken met een gemuteerde stam die een verwijdering van het ATG1-gen heeft. ATG1-codes voor een eiwitservine/threonine-eiwit kinase die nodig is voor blaasvorming en autofagie in de cytoplasma-to-vacuole targeting route. De ATG1 null mutant heeft een fenotype van het hebben van een abnormaal korte chronologische levensduur.

In dit verouderingslab ontwerpen en testen we op genetische factoren die de abnormaal kortere levensduur die kenmerkend zijn voor de ATG1 null mutant kunnen redden of onderdrukken. Dit kan echter ook worden uitgebreid naar andere kortstondige genetische achtergronden. De eerste stap in dit proces is het identificeren van een gen dat is gekoppeld aan het verlengen van de levensduur.

We gaan ons specifiek richten op de genen die de chronologische levensduur verlengen wanneer ze over-uitgedrukt zijn. Om dit te doen, gaan we gebruik maken van de openbaar beschikbare gegevens die toegankelijk zijn vanuit de gist genoom database. We gaan naar boven.

Zoeken op fenotype. En halverwege naar beneden, zullen we zien dat we de chronologische levensduur kunnen selecteren. Om te zoeken naar genen die de levensduur te verhogen, wat je zien is de schat aan beschikbare gegevens die genen gekoppeld aan dit specifieke fenotype heeft.

Vandaag zullen we SIR2 bestuderen, een histone lysine deacetylase die gekoppeld is aan een langere chronologische levensduur wanneer deze over-uitgedrukt is. Het eerste wat we zullen doen is toegang krijgen tot de DNA-sequentie voor het coderingsgebied, evenals de regulerende regio's die beide zijden van dit gen flankeren. We zullen 400 basisparen stroomopwaarts en stroomafwaarts nemen om er zeker van te zijn dat we alle regelgevende regio's omvatten.

We zullen deze DNA-sequentie gebruiken om PCR-primers te ontwerpen die ons in staat stellen om dit gen te klonen in onze plasmide vector. We zullen PCR gebruiken om ons gen te versterken en te klonen in de pRS315 vector. Om dit te doen, zullen we ontwerpen primers die beperking spijsvertering sites die HindIII en SacII beperking sites bevatten.

Zoals u zien, de plasmid bevat beide beperking sites, HindIII en SacII, dat zal vergemakkelijken ons klonen. U moet uw PCR-primers ontwerpen om ongeveer 21 of 22 nucleotiden van sequentie gratis te bevatten naar de regio die u wilt versterken. In aanvulling op de volgorde, zult u toevoegen aan de vijf prime end van hen de juiste beperking site, hetzij HindIII op de voorwaartse primer, of SacII op de omgekeerde primer, hier weergegeven in rood en paars respectievelijk, en verder stroomopwaarts van dat, voeg verschillende nucleotiden die het mogelijk maken de beperking enzym te binden en de beperking spijsvertering site te creëren op een hogere efficiëntie.

Kweek een vijf milliliter cultuur van het wilde type gist 's nachts na-log fase in verrijkte media, zoals YPAD. Oogst genomic DNA met behulp van een commercieel verkrijgde kit die specifiek is voor schimmel genomische isolatie. Het is belangrijk dat de kit specifiek is voor gist, omdat ze een zeer stijve en taaie celwand hebben om door te dringen.

Zymolyase behandeling is effectief in het verteren van de celwand en verhoogt sterk de genomische opbrengst. Gebruik een spectrofotometer om de kwantiteit en de kwaliteit van het DNA te bepalen. Om een amplicon te produceren die geschikt is voor klonen, is het noodzakelijk om een high fidelity PCR polymerase te gebruiken om mutaties tijdens het versterkingsproces te voorkomen.

Er zijn veel verschillende high fidelity PCR kits die commercieel beschikbaar zijn. Om de optimalisatie van de reactie te vergemakkelijken, raden we aan om een kit te kiezen die meerdere buffersystemen biedt, een die een standaard high fidelity buffer is en een die is geoptimaliseerd voor een hoog GC-gehalte in complexe amplicons. We gaan 200 nanogram van ons genomische DNA toevoegen.

We gaan vijf microliters van onze buffer toevoegen. We gaan 2 1/2 microliter van onze voorwaartse en onze omgekeerde primers toevoegen. We gaan één microliter van onze polymerase toevoegen, twee microliter DPP's.

En tot slot gaan we de hele reactie op 50 microliters met steriel gedestilleerd water qs. We voeren de reactie uit volgens het protocol dat specifiek is voor het enzym dat we gebruiken, evenals voor de primers die we in dit experiment hebben ontworpen. De PCR-reactie opruimen en concentreren.

Kweek een vijf milliliter cultuur van E.coli 's nachts in selectieve media. Pellet de cultuur door centrifugatie en gooi de supernatant. Resuspend en lyse de cellen in de meegeleverde chaotropic buffer gedurende vijf minuten.

Neutraliseer de reactie en meng de twee door inversie vijf of zes keer. Centrifugeer uw monster gedurende 10 minuten op maximale snelheid. Breng de supernatant en naar een silica kolom en wassen met de meegeleverde buffer.

Gooi de stroom door en herhaal de was met de andere geschikte buffers, met 30 seconden centrifugaties ertussen, waardoor je flow erna door wordt weggegooid. Aan het einde, centrifuge voor twee minuten meer om eventuele resterende ethanol te verwijderen en elute uw plasmid in 20 microliter elutie buffer en bepalen van de hoeveelheid en kwaliteit door spectrofotometer. Nu is het tijd om een beperking van de vector en de insert in te stellen.

Voeg 625 nanogram DNA toe, ofwel de vector of de insert, vijf microliters cutsmart buffer, een microliter van SacII, een microliter van HindIII, en QS de reactie met water om het uiteindelijke reactievolume te brengen tot 50 microliter. Incubeer de beperking verteert op 37 centigrade gedurende drie uur, gevolgd door 80 centigrade gedurende 20 minuten te verwarmen en activeren van de enzymen. Op dit punt, digests kunnen worden opgeslagen op vier graden voorafgaand aan de volgende stap.

Vervolgens gaan we een 15 microliter ligatie opzetten met behulp van ons verteerbare genomische fragment, evenals de vector die we net voltooid hebben. We beginnen met zes microliter water toe te voegen. We gaan twee microliters van onze verteerde vector toevoegen.

Dit is onze pRS315 plasmide. We gaan vier microliters toevoegen van onze insert, het SIR2 gen. We gaan twee microliters van onze ligase buffer toevoegen, voor de 10X buffer.

En tot slot voegen we één microliter van de ligase toe. We gaan dit 's nachts uitbroeden bij 16 graden, en dan doden warmte het enzym op 80 graden Celsius gedurende 20 minuten. Om te screenen op onze met succes gecreëerde plasmide, gaan we het omvormen tot E.coli.

We gaan 50 microliter chemische cellen gebruiken. We gaan ze ontdooien op ijs, en zodra ze ontdooien, gaan we onze ligatie reactie toevoegen, we gaan de volledige inhoud ervan toevoegen. We voegen 15 microliter van de ligatie toe met de wisselplaat, en we gaan ook 15 microliters van onze no-insert controle toevoegen aan een aparte reactie.

Zodra het is toegevoegd, flick de buis een paar keer om het te mengen. En we gaan dit uitbroeden op ijs. Na het voltooien van de 30 minuten incubatie op ijs, gaan we onze monsters toe te voegen in een 42 graden verwarming blok waar we zullen uitbroeden en warmte schok voor 20 seconden, die punt zullen we ze uit te nemen, en we zullen herstel media toe te voegen.

Na de hitteschok zorgen we voor een herstelperiode. We gaan onze monsters nemen en we zullen 450 microliters van SOC-media toevoegen. We zullen deze incubeer maken bij 37 graden Celsius om de plasmiden op te kunnen rapen en om het ampicilline resistentie gen te laten uitdrukken.

We zullen toestaan dat deze monsters te herstellen op 37 graden gedurende 45 minuten. Na die incubatie, zetten we een reeks verdunningen op, een tot 10, en een tot 100, en we gaan deze op LB / Amp media plaat en laat de cellen 's nachts opgroeien. We zullen ze op plaat met behulp van steriele techniek.

We nemen de juiste plaat, die we dienovereenkomstig hebben gelabeld en bevat onze selecteerbare marker. We nemen 150 microliter van onze getransformeerde E.coli. Met behulp van een steriele inenterende lus, zullen we dan voorzichtig verspreiden van de cellen over en over het geheel van de plaat, zodat we een mooie gelijkmatige verdeling.

Zodra we klaar zijn met het plating van al onze verdunningen, zullen we deze platen 's nachts uitbroeden bij 37 graden Celsius om te zien wat groeit. Na ongeveer een dag, moeten we zien kolonies opgroeien dat hopelijk de plasmide we probeerden te creëren bevatten. Ze zouden er ongeveer zo uit moeten zien.

Met behulp van steriele techniek, inenting potentiële transformatoren die groeide uit uw transformatie in vijf milliliter LB plus ampicilline volgens de eerder geschetste procedure. Isoleer de plasmiden van elke potentiële transformant en voer een beperking spijsvertering zoals eerder beschreven. Voer de reactieproducten uit op een agarosegel en vergelijk de potentiële transformanten met de lege vector.

Bewaar alle transformatoren die resulteren in excisie van een goed formaat insert voor verder onderzoek. Na met succes gemaakt onze plasmide, gaan we om te zetten in de ATG1 null gist achtergrond. We nemen 15 miljoen cellen en we gaan ze pelleteren, wat ik hier al heb gedaan.

Nadat ze hebben gepeld, verwijder de YPAD media waarin ze groeiden en was de cellen met gedestilleerd water. Daarna nemen we de cellen en we gaan ze opnieuw opsuspen in 100 millimolar lithiumacetaat. We gaan ze in 200 microliter van dat opschorten.

Resuspend de cel pellet door zachte pipetting op en neer. Splits de cellen in afzonderlijke microfugebuizen voor elk van de transformaties die u uitvoert, met behulp van 50 microliters van deze mix per transformatie. Aan elk van de transformaties moet u 240 microliters van 50% PEG toevoegen.

PEG is zeer stroperig, pipet en meet zeer zorgvuldig. Meng door pipetting na de toevoeging van de PEG en na elk van de extra componenten. Voeg vervolgens 36 microliter van een molaire lithiumacetaat, vijf microliter zalm sperma DNA, of andere drager DNA, dat is gekookt voor vijf minuten en geplaatst op ijs, en ten slotte vijf microliter van de plasmid voor elke transformatie die u zal uitvoeren.

Vortex elke buis grondig te mengen. Broed je monsters 45 minuten in op 30 graden Celsius. Warmte schok ze op 42 centigrade gedurende 10 minuten, en dan was de cellen een keer in steriel water, eindelijk resuspending hen in 200 microliters van steriel water.

Stel een tot 10 en een tot 100 verdunningen van elk van de getransformeerde stammen van gist en plaat 150 microliters op SC minus leu platen te selecteren voor de plasmiden. Spreid de cellen gelijkmatig en gelijkmatig, en laat de platen te drogen voordat omkeren en uitbroeden ze op 30 graden Celsius, waardoor ze te groeien voor 48 tot 72 uur. Zodra we ons gen met succes hebben gekloond om te testen, testen we het effect op de chronologische levensduur van het organisme.

We zullen de gist telen, het toezicht op het aantal levensvatbare kolonie vormen eenheden die blijven als een functie van de tijd. Laat de gist eerst 72 uur groeien in SC minus leucine vloeibare media met schudden op 30 graden Celsius. Met behulp van een hemocytometer, bepalen van de verdunning die nodig is om u in staat om 500 cellen plaat.

Met behulp van steriele techniek, plaat de cellen op een SC minus leu plaat, waardoor het te drogen en uitbroeden omgekeerd voor drie dagen op 30 graden Celsius, op welk punt zullen ze opgroeien en je scoren de kolonie groei en opnemen dat tijdspunt. Na het maken van de plaat, blijven uw gist incubeer op 30 graden Celsius incubeer zonder te schudden. In eerste instantie herhalen we de beplating met wekelijkse intervallen, waarbij we vaker tijdspunten nemen als onze voorlopige gegevens een onderdrukking van het verouderingsfenotype suggereren.

Om de levensvatbaarheid van het percentage te bepalen, normaliseren we naar de dag één keer punt voor analyse. Zorg ervoor dat u dezelfde verdunning bij elk interval plaat. Ga door met dit proces totdat je geen kolonies meer ziet opgroeien.

Het is handig om uw gegevens in een Excel-spreadsheet in te voeren. Dit zal u toelaten om snel te bepalen van de levensvatbaarheid van elke stam aan het einde van het experiment.