Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen
8 juli 2020
microRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA's bij IgA-nefropathie.
Deze methode kan worden gebruikt om eenvoudig de verandering van microRNA's in IGA-nefropathie te verifiëren met behulp van een klein diermodel, waardoor het mogelijk wordt om IGA-nefropathie te bestuderen zonder een menselijke nierbiopsie. Het protocol kan nieuwe inzichten bieden in de genetica van IGA-nefropathie, wat mogelijk kan helpen bij de ontdekking van nieuwe diagnostische en therapeutische methoden voor de nierziekte. Na controle of de muis goed verdoofd is, gebruik chirurgische schaar en pincetten om een middenlijnsnede van drie tot vier centimeter in de buikwand van de muis te maken en beide kanten van de nier te identificeren.
Snij de ribben en het middenrif in om het hart bloot te leggen. Na het snijden van het rechter atrium, injecteer PBS in het linker ventrikel totdat de kleur van de nier verandert in bleek geel, wat aangeeft dat het hele lichaam van de muis is geperfundeerd met PBS. Snijd de nierarterie, niervene en urineleider door en verwijder de nier.
Homogeniseer de 30 milligram niermonsters met behulp van een siliconen homogenisator en 700 microliter fenol guanidine-gebaseerd lyseragens op kamertemperatuur. Breng het lysate over naar de biopolymeerversnipperende spinkolom en centrifugeer het gedurende twee minuten bij 15.000 G op kamertemperatuur. Ga verder met RBNA-zuivering volgens de richtlijnen in het manuscript.
Na de laatste wassing, voeg 30 microliter nuclease-vrij water toe aan de op silica membraan gebaseerde spinkolom en centrifugeer het gedurende een minuut bij 8.000 G om het RNA elueren. Voor cDNA-synthese, bereid een master mix voor met twee microliter nucleïnezuurmix, twee microliter reverse transcriptase mix en vier microliter buffer in een totaal van acht microliter per monster. Voeg acht microliter van de master mix toe aan elk putje van een achtputtenbuisje.
Verdun totaal RNA in nuclease-vrij water. Voeg vervolgens 12 microliter van de totaal RNA oplossing toe aan elk putje van het buisje. Plaats de monsters in de thermocycler en incubeer ze gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door vijf minuten bij 95 graden Celsius.
Om kwantitatieve real-time PCR uit te voeren, bereid de master mix volgens de richtlijnen in het manuscript voor en voeg vervolgens 22,5 microliter van de master mix toe aan elk putje van een 96-wels reactieplaat. Voeg 2,5 microliter van het bereide cDNA toe aan elk putje. Plaats de reactieplaat in het real-time PCR-instrument.
Programmeer het vervolgens voor een initiële activering bij 95 graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 94 graden Celsius gedurende 15 seconden, annealing bij 55 graden Celsius gedurende 30 seconden en extensie bij 70 graden Celsius gedurende 30 seconden. Kwantificeer genexpressie met behulp van de delta-delta CT-methode. Dit protocol werd gebruikt om de expressieniveaus van microRNA's in de nieren van HIGA-muizen te onderzoeken, waarbij de nieren van Balb/c-muizen als controle werden gebruikt.
De expressieniveaus van drie IGA-nefropathie-geassocieerde microRNA's werden gemeten. Relatieve microRNA-expressieniveaus van de twee groepen werden vergeleken met behulp van een T-test met een P van minder dan 0,05 als statistisch significant. miR-155-5p werd 3,3 keer hoger tot expressie gebracht in de HIGA-groep vergeleken met de controlegroep, en miR-21-5p werd 1,58 keer hoger tot expressie gebracht.
miR-1461-5p expressie verschilde niet significant tussen de twee groepen. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om een masker, handschoenen en een pet te dragen en om de laboratoriumtafel en gereedschappen schoon te houden om te voorkomen dat nuclease in de omgeving het experiment beïnvloedt. Deze experimentele methode wordt momenteel in praktisch gebruik genomen in ons laboratorium.
Het doel is om nieuwe diagnostische en therapeutische methoden voor IGA-nefropathie te ontwikkelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een betrouwbare methode voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een muismodel voor IgA-nefropathie. De methode maakt het mogelijk om de betrokkenheid van microRNA's bij IgA-nefropathie te onderzoeken zonder dat menselijke nierbiopsieën noodzakelijk zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- MicroRNA-onderzoek
- Diermodellen
Achtergrond
- IgA-nefropathie is een nieraandoening die wordt gekenmerkt door de depositie van IgA in de glomeruli.
- MicroRNA's spelen een belangrijke rol in de pathogenese van diverse ziekten, waaronder nierstoornissen.
- Inzicht in de expressie van microRNA kan leiden tot nieuwe inzichten in ziektemechanismen.
- Huidige methoden voor het bestuderen van microRNA's vereisen vaak invasieve procedures.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het bepalen van microRNA-niveaus in een muismodel voor IgA-nefropatie.
- Het faciliteren van onderzoek naar de genetische aspecten van IgA-nefropatie.
- Het verkennen van potentiële diagnostische en therapeutische benaderingen voor nierziekten.
Gebruikte methoden
- Gebruik van HIGA-muizen als model voor IgA-nefropathie.
- Toediening van anesthesie aan de muis voorafgaand aan de operatie.
- Chirurgische technieken voor toegang tot de nieren, inclusief een midline-incisie en het verwijderen van organen.
- Perfusie van de muis met PBS ter voorbereiding op de extractie van de nieren.
Belangrijkste resultaten
- De ontwikkelde methode maakt een eenvoudige verificatie van microRNA-veranderingen bij IgA-nefropathie mogelijk.
- De inzichten die met deze methode worden verkregen, kunnen leiden tot nieuwe diagnostische instrumenten.
- Potentieel voor het ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van IgA-nefropathie.
- Eliminatie van de noodzaak voor menselijke nierbiopten in preliminaire studies.
Conclusies
- Deze methode vergroot het inzicht in de betrokkenheid van microRNA bij IgA-nefropathie.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de genetica van nierziekten.
- De aanpak kan een aanzienlijke impact hebben op toekomstige diagnostische en therapeutische ontwikkelingen.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om de microRNA-expressie te profileren in een gevalideerd muismodel voor IgA-nefropathie, ter ondersteuning van targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in programma's voor nierziekten. Door een reproduceerbare methode te bieden voor het detecteren van veranderde miRNA-niveaus zonder menselijke biopten, faciliteert het de vroege ontdekking van biomarkers en therapeutische targets met een verbeterde voorspellende betrouwbaarheid. De aanpak sluit aan bij inspanningen in de ontdekkingsfase om ziektemechanismen te onderzoeken en kandidaten te prioriteren voor preklinische ontwikkeling.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door ziektespecifieke veranderingen in de miRNA-expressie te kwantificeren in HIGA-muizen ten opzichte van controlegroepen.
- Operationele waarde: Biedt een betrouwbare workflow voor functionele targetvalidatie met behulp van qRT-PCR om de niveaus van miR-155-5p, miR-21-5p en miR-146a-5p te meten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door miRNA's met statistisch significante fold-changes (bijv. 3,3-voudig voor miR-155-5p) te identificeren als potentiële biomarkers of targets.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare miRNA-expressiegegevens die geschikt zijn voor assay-standaardisatie in discovery-screeningcampagnes.
- Operationele waarde: Stelt een gestandaardiseerd RNA-zuiverings- en cDNA-syntheseprotocol vast dat compatibel is met high-throughput qRT-PCR-platforms.
- Assay-gereedheid: Genereert genormaliseerde CT-waarden met behulp van de delta-delta CT-methode, waardoor vergelijking tussen monsters en hit-bevestiging mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Maakt gebruik van een ziekterevlevant HIGA-muismodel om bevindingen uit de ontdekkingsfase te koppelen aan preklinische validatie van miRNA-gemedieerde pathways.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt het mogelijk om veranderingen in de miRNA-expressie te beoordelen die gekoppeld zijn aan IgA-depositie, waardoor ambiguïteit in het doelmechanisme vóór de identificatie van lead-candidates wordt verminderd.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door consistente, kwantificeerbare readouts uit nierweefsel over verschillende studiegroepen te leveren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het voortraject van de vroege ontdekking, waarbij zij hypothesetoetsing bij targetvalidatie ondersteunt en kwantitatieve resultaten genereert voor screenings- en analyseworkflows die beslissingen over lead-identificatie informeren.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt verduidelijking van signaalpaden mogelijk door verschuivingen in miRNA-expressie te meten die geassocieerd zijn met de pathogenese van IgA-nefropathie in een genetisch muismodel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve miRNA-gegevens die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van verbindingen op doelpaden in downstream-assays.
- Analytics: Genereert delta-delta CT-waarden en fold-change-metrieken waarmee teams condities kunnen vergelijken en de statistische significantie kunnen beoordelen met behulp van T-testen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt miRNA-bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit door gebruik te maken van een gevalideerd IgA-nefropathiemodel met fenotypische relevantie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Stelt een herbruikbaar RNA-extractie- en qRT-PCR-protocol vast dat toepasbaar is op meerdere miRNA-doelen in diverse projecten over nierziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe meting van miRNA-dysregulatie in een ziektestraatmodel.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde parameters voor RNA-zuivering, cDNA-synthese en qRT-PCR (bijv. 8,000 G centrifugatie, 37°C incubatie).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door statistisch significante expressiegegevens (p<0.05) te leveren om targets met een sterke associatie met de ziekte te prioriteren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van miRNA-gebaseerde biomarkers of therapeutische targets mogelijk op basis van de grootte van de fold-change en reproduceerbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in rodentchirurgie, RNA-handling en qRT-PCR om nuclease-degradatie te voorkomen en de integriteit van de monsters te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot homogenisatieapparatuur, een centrifuge, een thermocycler en een real-time PCR-instrument met fluorescentiedetectie.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor de RNA-input (30 mg nier), reagentvolumes (700 μL lysisreagens) en cycluseringscondities (95°C activatie, 40 cycli).
- Vereist aanpassing van primer-sets voor specifieke miRNA-targets, terwijl consistente annealing- (55°C) en extensietemperaturen (70°C) worden gehandhaafd.
- Beperkt tot endpoint RNA-analyse; biedt geen ruimtelijke of single-cell resolutie binnen nierweefsel zonder aanvullende methodologieën.
