Name: Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer een flowcytometrie-gebaseerde fagocytose-test voor immunologisch malariasonderzoek met Plasmodium falciparum en THP-1-cellen. Deze methode evalueert functionele antilichaamresponsen betrouwbaar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Maiken Visti wordt bedankt voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd deels gefinancierd door een subsidie (MAVARECA II; 17-02-KU) van het Ministerie van Buitenlandse Zaken van Denemarken en beheerd door Danida Fellowship Centre. De financier had geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

De menselijke serummonsters die voor de hier gepresenteerde resultaten werden gebruikt, werden verzameld in een afzonderlijke studie19. De collectie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Universiteit van Ghana (studie 038/10-11), en door de Regional Research Ethics Committees, Capital Region of Denmark (protocol H-4-2013-083).
1. Parasietcultuur
OPMERKING: Volg de lokale regelgeving voor de behandeling van menselijke ziekteverwekkers.
<ol><li>Behoud P. falciparumparasieten volgens het standaardprotocol zoals beschreven vóór20 in parasietencultuurmedium (zie Tabel van Materialen).</li>
	<li>Houd de parasieten strak gesynchroniseerd met behulp van sorbitol behandeling zoals eerder beschreven21.</li>
	<li>Om de VAR2CSA-expressie op het oppervlak van de IE te garanderen, voert u herhaalde rondes van immuunmagnetische selectie uit met behulp van een anti-VAR2CSA-antilichaam (bijvoorbeeld PAM1.4-antilichaam, een kruisreactieve menselijke monoklonale VAR2CSA-specifieke IgG22) gekoppeld aan eiwit G-magnetische kralen23.<ol>
<li>In het kort, incubeer laat-stadium trophozoite-IEs met magnetische kralen gekoppeld aan een anti-VAR2CSA antilichaam en positief selecteren met behulp van een magneet.</li>
		<li>Breid de geselecteerde parasieten in de cultuur uit voor een paar cycli tot parasitemia minstens 5% is.</li>
		<li>U ook parasieten selecteren die zich binden aan de door plastic geïmmobiliseerde CSA (de receptor voor VAR2CSA) zoals eerder beschreven24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om var2CSA expressie op de geselecteerde parasieten te verifiëren voer flow cytometrie zoals eerder beschreven25.<ol>
<li>In het kort, label de laat-stadium trophozoite-IEs met hetzelfde antilichaam gebruikt voor de magnetische selectie (stap 1.3) gevolgd door een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam.</li>
		<li>Meet de IE oppervlaktereactiviteit door stromingscytometrie. Succesvolle antilichaamselectie resulteert normaal gesproken in een parasietpopulatie die VAR2CSA uitdrukt bij de meeste parasieten (≈80%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de fagocytose test, gebruik gezuiverde mid- tot laat stadium trophozoite-IEs. Voer zuivering uit met behulp van magnetische scheiding zoals eerder beschreven26. OPMERKING: Om het stadium van de parasieten nauwkeurig te bepalen, voert u Giemsa-vlekken uit op bloeduitstrijkjes, gevolgd door lichte microscopieobservatie. Volg standaardprocedures en morfologische richtlijnen zoals beschreven vóór27. Late-stage zuivering kan ook worden uitgevoerd met behulp van dichtheid gradiënt medium. De IE-opbrengst is in onze ervaring echter lager en daarom heeft magnetische zuivering de voorkeur.<ol>
<li>Voor magnetische scheiding, draai de parasietcultuur (5-10% parasitemia) op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en schort de celpellet opnieuw op in 10 mL parasietcultuurmedium.</li>
		<li>Voeg de parasietsuspensie toe aan een CS-kolom gekoppeld aan een magneet (zie Tabel met materialen)en laat deze langzaam door de kolom gaan. Trophozoite-IEs zijn paramagnetisch (door de aanwezigheid van hemozoïne) en blijven in het kolomgaas.</li>
		<li>Was de kolom met 50 mL parasiet cultuur medium en elute de IEs uit de magnetische kolom met behulp van 50 mL van parasiet cultuur medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Draai het eluaat van 1,5,3 op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg en schort opnieuw op in 1 mL van het parasietcultuurmedium.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal IEs (gemakkelijk te herkennen aan lichtmicroscopie als erytrocyten met donker hemozoïnepigment) en totaal celnummer om de uiteindelijke parasieten te berekenen (percentage IE's). OPMERKING: Gebruik alleen parasieten met ten minste 80% zuiverheid (80% IEs).</li>
	<li>Op basis van het aantal serum/antilichaammonsters dat voor het testen gepland is, schat u de totale benodigde hoeveelheid IE's en schaalt u de parasietculturen dienovereenkomstig op. Een 75 cm2 kweekkolf met 25 mL cultuur bij 5% hematocriet en 5-10% parasitemia moet voldoende IEs opleveren om een volledige 96 putplaat te draaien. Voor een volledige plaat (42 monsters plus 6 controles in duplicaat) is minimaal 1,5 mL parasietsuspensie nodig bij 3,3 x 107 IEs/mL.</li>
</ol>2. THP-1 cellen
LET OP: De THP-1 cellijn wordt gebruikt in deze test. Deze monocytcellijn is afgeleid van een patiënt met monocytische leukemie28 en kan worden gekocht bij ATCC. Onderhoud de cellijn volgens de instructies van de aanbieder in THP-1 kweekmedium (zie Tabel van Materialen).
<ol><li>Voor regulier onderhoud start u de THP-1 celkweek op 2-4 x 105 cellen/mL en subcultuur wanneer de celconcentratie 8 x 105 cellen/mL bereikt. OPMERKING: Sta niet toe dat de celconcentratie meer dan 1 x 106 cellen/mL bedraagt en houd het passagenummer bij. Vermijd het gebruik van cellen die voorbij passage 25. De gemiddelde verdubbelingstijd van de THP-1 cellijn varieert tussen 19-50 uur. Bepaal de verdubbelingstijd van de celbatch voordat u met de fagocytose-experimenten begint. Dit zal helpen om ruwweg de noodzakelijke hoeveelheid cultuur te schatten die nodig is om een bepaald aantal serummonsters te testen (bijvoorbeeld voor een volledige 96 putplaat is 10 mL cultuur op 5 x 105 cellen/mL nodig).</li>
	<li>Controleer periodiek de THP-1 cellen op de oppervlakteexpressie van de Fcγ-receptoren I (CD64), II (CD32) en III (CD16) zoals eerder beschreven15.<ol>
<li>Kortom, bevlek de THP-1 cellen (afzonderlijk) met anti-CD64, anti-CD32 en anti-CD16 fluorescerend gelabelde antilichamen(Tabel van materialen) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (1:100 verdunning bereid in 2% FBS in PBS).</li>
		<li>Was drie maal met 2% FBS in PBS en meet oppervlaktevlekken door middel van stromingscytometrie. OPMERKING: De THP-1 cellen zijn negatief voor CD16 en positief voor CD32 en CD64 zoals eerder gemeld29,30 ( Figuur1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de fagocytosetest, het opzetten van een THP-1 cel kweekkolf met 2,5 x 105 cellen / mL de dag voor het experiment te leveren ongeveer 5 x 105 cellen / mL op de dag van de test. OPMERKING: Zorg ervoor dat 4-6 x 105 cellen/mL aanwezig zijn op de dag van de test.</li>
</ol>3. Phagocytosetest (figuur S1)
<ol><li>Voor aanvang van de test blokkeren (>1 h) twee ronde-bodem 96 putplaten (een voor de opsonisatie en een voor de fagocytose) met behulp van 150 μL per put van steriele 2% FBS in PBS. LET OP: Label plaat 1 als opsonisatieplaat en gebruik deze zowel voor ethidium bromide (EtBr) kleuring en opsonisatie. Label plaat 2 als fagocytose plaat en gebruik zowel voor THP-1 celbeplating als voor de fagocytosestap.</li>
	<li>Parasiet kleuring en opsonisatie<ol>
<li>Neem de IE-suspensie die in 1,6 is opgesteld en pas het aantal cellen aan tot 3,3 x 107 IEs/mL door het toevoegen van parasietcultuurmedium en EtBr om een uiteindelijke concentratie van 2,5 μg/mL (1:40 verdunning, uit een 0,1 mg/mL-voorraad) te bereiken. OPMERKING: EtBr bevlekt het parasiet-DNA, waardoor detectie door stromingscytometrie mogelijk is. LET OP: EtBr is een mutageen en huid, oog en ademhalingsirritatie. Gebruik de juiste bescherming en gooi afval volgens de lokale regelgeving.</li>
		<li>Verwijder de blokkerende oplossing van een van de 96 putplaten (opsonisatieplaat), veeg de plaat en verwijder vloeibaar overtollig over een stuk handdoekpapier.</li>
		<li>Voeg 30 μL per put van de IE-suspensie hierboven in de bovenste helft van de plaat toe. Laat een goed leeg en voeg 30 μL van parasiet cultuur medium (zonder IEs voor de THP-1 alleen controle). (Figuur S2A). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.</li>
		<li>Voeg 170 μL per put van parasiet cultuur medium. Draai de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.</li>
		<li>Was de EtBr-gelabelde IE's nog twee keer met behulp van 200 μL per put van parasiet cultuur medium spinnen van de plaat op 500 x g gedurende 3 min bij kamertemperatuur. De supernatant van de eerste was kan worden verwijderd door het vegen van de plaat. Verwijder de supernatant voorzichtig uit de tweede wasbeurt met behulp van een meerkanaals pipet om ervoor te zorgen dat het volledige volume wasmiddel wordt verwijderd. Verstoor de pellet niet.</li>
		<li>Schort de EtBr-gelabelde IE's opnieuw op in 30 μL antilichaam/plasma/serumoplossing bereid bij de gewenste concentraties in het parasietcultuurmedium.</li>
		<li>Vermeld altijd de volgende besturingselementen(Figuur S2B):een controle zonder IEs/THP-1-cellencontrole (parasietcultuurmedium); een controle zonder antilichamen of plasma/serum (niet-gesoniseerde controle); een positieve controle met behulp van het commercieel verkrijgbaar konijn anti-menselijke erythrocyten antilichaam bij 1:100 verdunning (zie tabel van materialen); twee negatieve plasma/serumcontroles bij 1:5 verdunning (een malaria-naïeve pool en een pool van malaria-blootgestelde mannetjes); en een positieve serumcontrole bij 1:5 verdunning (een pool van malaria-blootgestelde vrouwen, die eerder zwanger waren (bij voorkeur multigravidae)). OPMERKING: Een verdunning van 1:100 voor de positieve controle lijkt consistent te werken in verschillende batches van gekocht antilichaam (gegevens die niet worden weergegeven). Het wordt echter aanbevolen om variaties tussen batches uit te sluiten door meerdere verdunningen te testen telkens wanneer een nieuwe partij antilichaam wordt gebruikt.</li>
		<li>Incubeer gedurende 45 minuten in het donker bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>THP-1 cellen preparatentie en fagocytose<ol>
<li>Terwijl de IE's worden opsonized (3.2.8), beginnen met de voorbereiding van de THP-1 cellen.</li>
		<li>Haal de THP-1 cellen uit de kweekkolf, draai ze naar beneden (500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur), decanteer de supernatant en hang de pellet opnieuw op in THP-1 celkweekmedium.</li>
		<li>Spin opnieuw (500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur), decanteer de supernatant en hang de celpellet opnieuw op in 1 mL THP-1 celkweekmedium.</li>
		<li>Bepaal het aantal cellen in de hierboven voorbereide oplossing en voeg meer medium toe om een uiteindelijke concentratie van 5 x 105 cellen/mL te verkrijgen.</li>
		<li>Verwijder de blokkerende oplossing van de resterende 96 putplaat (fagocytoseplaat) door de plaat te vegen en vloeibaar overtollig over een stuk handdoekpapier te verwijderen.</li>
		<li>Voeg 100 μL per put van de THP-1 celsuspensie toe die in 3.3.4 is bereid en teruggezet in de celkweek incubator(Figuur S2C).</li>
		<li>Zodra de incubatietijd van het antilichaam/plasma/serum is verstreken, voegt u 170 μL per put van het parasietcultuurmedium toe. Draai de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.</li>
		<li>Was de opsonized IE's nog twee keer met behulp van 200 μL per put van parasiet cultuur medium, spinnen de plaat op 500 x g gedurende 3 min bij kamertemperatuur. De supernatant van de eerste was kan worden verwijderd door het vegen van de plaat. Verwijder de supernatant voorzichtig uit de tweede wasbeurt, met behulp van een meerkanaals pipet om ervoor te zorgen dat het volledige volume wasmiddel wordt verwijderd. Verstoor de pellet niet.</li>
		<li>Ten slotte opnieuw op te schorten de opsonized IEs in 100 μL van voorverwarmde THP-1 cel cultuur medium. Breng 50 μL opsonized IE-suspensie over naar elke put in de fagocytoseplaat. Aangezien er in totaal 100 μL IEs is, kan elke verdunning van antilichamen/serum worden uitgevoerd in duplicaten in de fagocytoseplaat(figuur S2D) OPMERKING: De hoeveelheid IE's en THP-1 cellen die in de test worden gebruikt, komt overeen met een 10:1-verhouding.</li>
		<li>Incubeer gedurende 40 minuten in het donker bij 37 °C, 5% CO2. LET OP: Laat de fagocytose niet langer dan 40 minuten doorgaan.</li>
		<li>Stop de fagocytose door centrifugatie bij 4 °C (500 x g, 5 min) en gooi het supernatant weg door de plaat te vegen. Voeg 150 μL ammoniumchloridelysingoplossing(Tabel van materialen) toeen meng door pipetteren, incubeer gedurende precies 3 min. LET OP: Deze stap zal lyse de erythrocyten die niet zijn fagocytosed door de THP-1 cellen.</li>
		<li>Stop de lysis door 100 μL ijskoude 2% FBS in PBS toe te voegen. Draai de plaat op 4 °C (500 x g gedurende 3 minuten) en verwijder de supernatant door de plaat over een geschikte afvalcontainer te vegen.</li>
		<li>Was drie maal met 200 μL per put ijskoude 2% FBS in PBS die de plaat op 4°C (500 x g gedurende 3 min) draait. Na de laatste wasbeurt, opnieuw op te schorten in 200 μL van ijskoude 2% FBS in PBS en onmiddellijk analyseren door stroom cytometrie. OPMERKING: Eerdere publicaties hebben celfixatie gebruikt in 2% paraformaldehyde voorafgaand aan flow cytometrie31, maar de hier gepresenteerde resultaten werden onmiddellijk na de voltooiing van de test verworven. Het uitstellen van stroomcytometriegegevensverwerving door de plaat op te slaan bij 4°C wordt niet aanbevolen, omdat het percentage EtBr+ THP-1 cellen snel vervalt(figuur S3).</li>
	</ol></li>
	<li>Stroom cytometrie acquisitie en analyse OPMERKING: Elke stroomcytometer die 96 putplaatformaat ondersteunt en de juiste lasers/filters heeft om EtBr-fluorescentie te meten, kan worden gebruikt.<ol>
<li>Voor de overname, poort op THP-1 cellen met behulp van een lineaire forward-scatter (FSC) vs lineaire side-scatter (SSC) plot met behulp van de putten waren geen IEs werden toegevoegd (Figuur 2A) en verwerven 10.000 gebeurtenissen op deze poort.</li>
		<li>Meet fluorescentieintensiteit voor EtBr (FL3-Log) op de THP-1 poort met behulp van een histogram plot.</li>
		<li>Voor gating, eerste poort op THP-1 cellen in een FSC vs SSC dichtheid plot, met behulp van de putten waren geen IEs werden toegevoegd (Figuur 2A). Zet vervolgens een positieve poort in een FL3 (EtBr) histogram, met behulp van de THP-1 cellen (geen IEs toegevoegd) en de niet-opsonized controle (Figuur 2B).</li>
		<li>Kopieer deze poorten in alle andere monsters getest in dezelfde plaat en bepalen het percentage etbr-positieve THP-1 cellen (THP-1 cellen die hebben gefagocytized ten minste een IE). Voor elk van de geteste monsters kan fagocytose worden gerapporteerd als de absolute waarden (percentage EtBr+ THP-1 cellen) of als relatieve fagocytose berekend als percentage met behulp van de positieve controle als maximum.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Malaria+Report+-+2018%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li>
<li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Malaria+Day+2009%3A+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li>
<li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancy-associated+malaria%3A+Parasite+binding%2C+natural+immunity+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li>
<li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li>
<li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases%3A+a+few+needles+and+many+haystacks%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li>
<li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li>
<li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li>
<li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection%2C+anemia%2C+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li>
<li>Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes%3A+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491(2011).</li>
<li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414(2011).</li>
<li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665(2012).</li>
<li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li>
<li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1%CE%B1+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li>
<li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li>
<li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1%2C+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262(2018).</li>
<li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li>
<li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li>
<li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li>
<li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic%2C+conformational+epitopes+in+VAR2CSA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li>
<li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li>
<li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068(2017).</li>
<li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li>
<li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. Manassas, Virginia. (2013).</li>
<li>WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+Du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc%27yRIl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li>
<li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+research%22%5BJournal%5D)">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol is eerder beschreven en gebruikt12,15,17,31 om de capaciteit van antilichamen te meten die gericht zijn op het oppervlak van P. falciparum-II's om opsonisatie en fagocytose te induceren door THP-1-cellen. De hier gepresenteerde resultaten richten zich op natuurlijk verworven VAR2CSA-specifieke antilichamen in het plasma/serum van vrouwen die in een ...

Malaria is een door vector overgedragen ziekte die bij de mens wordt veroorzaakt bij infectie met vijf verschillende soorten van het geslacht Plasmodium. De meest voorkomende soort is P. falciparum, dat ook verantwoordelijk is voor de meest morbiditeit en mortaliteit1. Malaria klinische presentatie varieert van asymptomatische of goedaardige infecties tot gecompliceerde / ernstige ziekte, de laatste komt meestal voor bij kinderen jonger dan vijf jaar. Blootstelling aan P. falciparum leidt niet tot steriele immuniteit, maar personen die in endemische gebieden leven, ontwikkelen langzaam immuniteit tegen de klinische ziekte. Bescherming is afhankelijk van leeftijd/blootstelling en de immuniteit wordt normaal gesproken verworven tijdens de eerste 5-10 jaar van het leven2. Volwassen vrouwen zijn een belangrijke uitzondering, omdat ernstige malaria kan optreden tijdens de zwangerschap in een klinische presentatie bekend als placentamalaria (PM). PM is een belangrijke oorzaak van abortus, doodgeboorte, vroegtijdige bevalling, laag geboortegewicht, foetale dood, en moederbloedarmoede. Weerstand tegen PM ontwikkelt zich over opeenvolgende zwangerschappen3. Bescherming tegen PM wordt geassocieerd met de verwerving van antilichamen tegen VAR2CSA-type PfEMP14,5, een besmet erythrocyte (IE) oppervlakteantigenen dat zich bindt aan chondroitin sulfaat A (CSA) waardoor IE-sekwestratie in de placenta mogelijk wordt. Antilichamen bemiddelen bescherming bij het uitvoeren van verschillende functionele activiteiten (beoordeeld in6,7) waaronder opsonisatie van IEs om fagocytose te induceren. Vroege in vitro studies toonden aan dat antilichamen de groei van P. falciparum kunnen beperken in aanwezigheid van monocyten via fagocytose8,9. Recentere studies hebben aangetoond dat hogere niveaus van fagocytose-inducerende antilichamen worden geassocieerd met betere zwangerschapsresultaten (in de context van HIV-co-infectie)10,11, wat de relevantie van deze effectorfunctie in de natuurlijk verworven immuunrespons aangeeft.
Hier presenteren we een protocol om deze functie van antilichamen aanwezig in menselijk plasma / serum te meten, met behulp van in vitro gekweekte IT's uitdrukken VAR2CSA samen met de monocyten lijn THP-1. De test is eerder gebruikt11,12,13,14,15,16,17,18 en wordt beschouwd als een verbeterde en gemakkelijkere aanpak in vergelijking met eerdere microscopie gebaseerde protocollen8, omdat het mogelijk maakt het testen van een groter aantal antilichaam monsters in een enkele run met behulp van kleinere volumes van antilichamen en het vermijden van vervelende en bevooroordeelde microscopie tellen. Hoewel de test is gebruikt door meerdere laboratoria en de uitvoering ervan is eenvoudig genoeg, het vereist een zorgvuldige planning en voorbereiding, daarom, een gedetailleerd protocol zou de toepassing ervan door laboratoria en onderzoekers ontbreekt eerdere ervaring. We gebruiken als voorbeeld laat-stadium-gesynchroniseerde IEs uitdrukken VAR2CSA opsonized met antilichamen aanwezig in serum verzameld van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie.

<table><tbody><tr><td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Elke soortgelijke plaat kan worden gebruikt, zorg ervoor dat deze compatibel is met het flowcytometer-instrument dat u wilt gebruiken</td></tr><tr><td>AlbuMAX-II</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>AlbuMAX-II (5%)</td><td>-</td><td>-</td><td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td></tr><tr><td>Anti-Red Blood Cells antibody</td><td>Abcam</td><td>ab34858</td><td>Bereid 2&#956;l aliquoten en bevries op -20&deg;C. Gebruik één aliquot per experiment.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>P8622</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Bereid een stockoplossing van 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Bewaren beschermd tegen licht</td></tr><tr><td>FC500 flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Elke flowcytometer die het formaat van 96-well platen ondersteunt en de juiste lasers/filters heeft om EtBr-fluorescentie te meten, kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>Voor gebruik verwarmen en inactiveren.</td></tr><tr><td>FITC mouse anti-human CD16</td><td>BD Biosciences</td><td>555406 of 556618</td><td></td></tr><tr><td>FITC mouse anti-human CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>552883</td><td></td></tr><tr><td>FITC mouse anti-human CD64</td><td>BD Biosciences</td><td>555527</td><td></td></tr><tr><td>FlowLogic software</td><td>Inivai technologies</td><td></td><td>Elke flowcytometrieanalyse kan worden gebruikt, bijvoorbeeld FlowJo of Winlist</td></tr><tr><td>Gentamicin (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma</td><td>H9377</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution</td><td>-</td><td>-</td><td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td></tr><tr><td>MACS CS-column and accesories</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Parasite culture medium</td><td>-</td><td>-</td><td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&micro;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10000U en 10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 culture medium</td><td>-</td><td>-</td><td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td></tr><tr><td>Vario MACS magnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen plasmodium falciparum parasieten door een flow cytometrie-gebaseerde test

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Het protocol beschrijft hoe een op stroom gebaseerde phagocytosetest van Plasmodium falciparum-geïnfecteerdeerytrocyten (IEs) op te zetten en uit te voeren, opmeting door natuurlijk verworven IgG-antilichamen die specifiek zijn voor VAR2CSA. VAR2CSA is het parasietantgeen dat bemiddelt bij de selectieve inbeslagname van IE's in de placenta die een ernstige vorm van malaria kan veroorzaken bij zwangere vrouwen, placentamalaria (PM). Bescherming tegen PM wordt bemiddeld door VAR2CSA-specifieke antilichamen die vermoedelijk functioneren door het remmen van placenta-inname en/of door het opsoniseren van IE's voor fagocytose. De test maakt gebruik van laat-stadium-gesynchroniseerde IEs die zijn geselecteerd in vitro om VAR2CSA, plasma / serum-antilichamen uit te drukken van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit, en de fagocytische cel lijn THP-1. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie. De test biedt eenvoudige en hoge doorvoer evaluatie, met een goede reproduceerbaarheid, van een belangrijk functioneel aspect van antilichaam-gemedieerde immuniteit in malaria. Het is daarom nuttig bij de evaluatie van de klinische immuniteit tegen P. falciparum malaria, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de tropen, met name in Afrika bezuiden de Sahara.

Hier presenteren we in detail een protocol dat eerder is beschreven31 en gebruikt11,12,13,14,15,16,17,18 om de capaciteit van antilichamen gericht op het oppervlak van P. falciparum II's te meten tot opsonisatie en fagocytos...

Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Dit protocol maakt het mogelijk om het vermogen van antilichamen te meten om opsoniseren en induceren de fagocytose van plasmodium falciparum geïnfecteerde erytrocyten. Antilichamen die aanwezig zijn in het serum van personen die van nature zijn blootgesteld aan parasietinfectie, evenals antilichamen die worden veroorzaakt door immunisatie met parasietantigenen, kunnen worden getest. Het aantonen van de procedure met mij zal Maiken Visti, een technicus van mijn laboratorium.Om een THP-1 celcultuur op te zetten voor een fagocytosetest, zaad de dag voor het experiment de cellen in een 25 centimeter kwadraat kweekkolf en een concentratie van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in THP één celcultuurmedium. Op de dag van het experiment, ten minste een uur voor het experiment blok tot ronde-bodem 96-put platen met 150 microliters van steriele 2%FBS in PBS per put. Voor de oogst en zuivering van trophozoiet met midden tot laat stadium, geïnfecteerde erytrocyten, bereid ongeveer 1,2 milliliter verpakte P falciparumparasietencultuur voor in 10 milliliter parasietenkweekmedium, met ten minste 5%parasitemia en voeg toe aan een magnetische kolom.Was de kolom met 50 milliliter paras

measuring-naturally-acquired-phagocytosis-inducing-antibodies-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Deze werkwijze onderzoekt de bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering...

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

This video demonstrates a method for quantifying the phagocytosis of FITC-labeled pathogenic fungal spores by human leukocytes. Phagocytosed spores are discerned from cell-adherent spores through counterstaining, followed by flow cytometric analysis.

Quantitative Flow Cytometric Measurement of Fungal Spore Phagocytosis by Human Phagocytes

This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.

In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Leer een flowcytometrie-gebaseerde fagocytose-test voor immunologisch malariasonderzoek met Plasmodium falciparum en THP-1-cellen. Deze methode evalueert functionele antilichaamresponsen betrouwbaar.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test (Video) | JoVE Journal

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

Meer video's verkennen