Planarian Scrunching als een kwantitatieve gedragsuitlezing voor schadelijke stimuli sensing

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om planair gedrag en de sec-mechanismen die aan dit gedrag ten grondslag liggen te verduidelijken door kwantitatieve gedragsanalyse te combineren met moleculaire en chemische verstoringen. Deze techniek is gemakkelijk toegankelijk voor alle vaardigheidsniveaus omdat het geen geavanceerde instrumenten of gespecialiseerde software vereist om kwantitatieve gedragsuitlezingen van vrij bewegende planarianen te krijgen. Scrunching kan worden gebruikt om uitzondering te bestuderen in planarianen, en dient als gevoelig eindpunt om te testen, verstoren van het zenuwstelsel functie veroorzaakt door Xenobiotica en ziekte.

Begin met het plaatsen van een dimbaar LED-paneel op een vlakke ondergrond, die een uniforme witte achtergrond biedt en kan worden gebruikt als een verstelbare lichtbron om het juiste contrast te verkrijgen. Plaats een 100 millimeter petrischaal arena op het LED-paneel. Monteer een camera op een ring staan boven de arena en de aanpassing van de positie, hoogte en focus als dat nodig is, zodat de hele arena is gecentreerd binnen het gezichtsveld en is in focus.

Vul de arena met ongeveer 25 milliliter van de juiste belichtingsmedia om maximaal volume te hebben, schakel het LED-paneel in en schakel alle andere lichtbronnen uit die de opnamekwaliteit negatief kunnen beïnvloeden. Drop een planarian in het midden van de arena met behulp van een transfer Pipette. Bij het testen van een chemische oplossing, breng de planarian met zo weinig van planarian water mogelijk, zodat de concentratie van de chemische stof niet significant wordt veranderd.

Begin met het opnemen van gegevens als beeldsequenties in een native Fiji-indeling. Voor glijdende experimenten, record een tot twee minuten van glijden gedrag, voor scrunching of peristaltiek experimenten, record lang genoeg om ten minste drie opeenvolgende oscillaties die zich in een rechte lijn vast te leggen. Nadat het experiment is voltooid, beëindigt u de opname.

Als de planarian de grens van de arena bereikt zonder te voldoen aan de beëindiging criterium, pipet de planarian terug naar het centrum van de arena. Open de ruwe afbeeldingsreeks voor een experiment in Fiji, converteer deze naar acht bits en gebruik het pijlgereedschap of de schuifregelaar onder aan de afbeeldingsstack om door de beeldreeks te pannen. Als u een periode en regio van belang wilt extraheren, trekt u een interessegebied dat het volledige pad van een planarian omvat met behulp van het rechthoeksgereedschap.

Klik met de rechtermuisknop op de afbeeldingsstapel en selecteer dupliceren, schakel het selectievakje in waar dubbele stapel. Voer de eerste en laatste frames van de volgorde van de rente in en klik op oke. Voor glijden experimenten, extract een periode van glijden waar de planarian beweegt ten minste twee keer zijn lichaamslengte voor scrunching of peristaltiek experimenten.

Haal een instantie eruit wanneer de vedaris een minimum van drie opeenvolgende en volledige lichaamsschommelingen ondergaat in een rechte lijn. Pas een drempelwaarde toe op de gedupliceerde afbeeldingsstapel om de afbeelding te binariseren en de planarian uit de achtergrond te halen, pas de schuifbalken aan zodat de hele vloaris in het rood wordt gemarkeerd. De exacte waarden zijn afhankelijk van de beeldkwaliteit.

Laat de vakken voor donkere achtergrond, stapel histogram en niet opnieuw bereik ongecontroleerd. Blader door de afbeeldingsstapel om een goed drempelbereik te garanderen en klik vervolgens op toepassen. Stel in de conversiestack naar een binair venster de methode in op standaard en de achtergrond op licht.

Schakel alle vakjes in dit venster uit en klik op oke. Een binarized beeld dat een zwarte planarian op een witte achtergrond toont zal verschijnen. Zorg ervoor dat de hele planarian zichtbaar is in alle frames van de beeldreeks.

Stel metingen in door op analyseren te klikken en metingen in te stellen. Schakel de vakjes in voor gebied, het midden van de massa, de stapelpositie en de pasvorm van de ellips en klik vervolgens op oke. Selecteer de open afbeeldingsstapel en selecteer analyseren en analyseren van deeltjes.

Selecteer in het venster Deeltjes analyseren de optie weergeven en maskers om een nieuwe stapel te openen met alle objecten die zijn gedetecteerd met de gekozen parameters. Stel een groottefilter in om ongewenste ruis te verwijderen door het geschatte gebied van de planarian in te voeren. Schakel vervolgens de selectievakjes in voor weergaveresultaten en maak de resultaten duidelijk en klik op oke.

Pan door de stapel maskerafbeelding met behulp van de schuifregelaar onder aan het paneel om ervoor te zorgen dat er geen ruis of frames zijn zonder een planarian. Sla in het resultatenvenster de gegevens op met bestand en sla op als, de CSV-extensie aan de bestandsnaam toevoegt om de gegevens op te slaan als door komma's gescheiden waarden. Zodra de gegevens voor de afbeeldingsstack zijn opgeslagen, sluit u de respectievelijke resultaten van de afbeeldingsstapel en maskervensters.

Om scrunching via schadelijke temperatuur te veroorzaken, hitteplanarie water in een glazen beker tot 65 graden Celsius op een hete plaat. Plaats een planarian in het midden van de arena, en wacht tot het zich rechtop oriënteert en begint glijden, dan beginnen met opnemen. Gebruik een P 200 Pipet om langzaam en consequent pipette 100 microliters van de voorverwarmde vóór vór vaal water, post faryngeal op de staart van de planarian om scrunching te induceren.

Stop de opname, zodra scrunching is gestopt. Plaats de planarian in een herstel container en de media uit te wisselen in de Petri schotel met verse kamertemperatuur planarian water, als het uitvoeren van meer experimenten. Om scrunching via amputatie te induceren, breng een planarian naar het centrum van de arena en wacht tot de planaire oriënteert zich rechtop en begint glijden.

Begin dan met opnemen, amputeerde de planarian met een schoon scheermesje. Ervoor zorgen dat de snijlocatie consistent is voor experimenten. Stop de opname zodra het voorste stuk is gestopt met scrunching.

Verwijder beide stukken, plaats ze in een aparte container en laat ze zeven dagen regenereren. Geamputeerde planarianen kunnen opnieuw worden opgenomen in de thuiscontainer zodra ze geregenereerd zijn. Dit protocol werd gebruikt om te testen of in de buurt van UV-licht blootstelling, induceert scrunching in S.mediterranea en D.japonica planarians, terwijl D.japonica planarians scrunch, wanneer blootgesteld aan de buurt van UV-licht, S.mediterranea planarians ofwel vertonen staart dunner of geen reactie.

Een kwantificering van de scrunching parameters voor de D.japonica planariërs die ten minste drie opeenvolgende rechte lijn scrunches tentoongesteld, onthult kenmerken knarsende parameters voor deze soort In tegenstelling blootstelling aan 250 micromolar cinnamaldehyde onbekende TRPA een agonist in muizen, veroorzaakt scrunching en S.mediterranea. Terwijl D.japonica planarianen een mengsel van slang-achtige en oscillerende beweging onderbroken door glijden of krachtige kop draait. Een kwantificering van de monsters met ten minste drie opeenvolgende oscillaties, leverde aanzienlijk lagere waarden op voor drie van de vier parameters die dan verwacht voor scrunching in D.japonica, wat aangeeft dat de waargenomen oscillatoriebeweging niet scrunching is.

RNAi bevestigt de specificiteit van scrunching en reactie op cinnamaldehyde blootstelling in S.mediterranea. Binnen 180 seconden na blootstelling in planarian water, alle controle RNAi planarian scrunched. Vergeleken met geen van DE SMTRPA één RNAi planarians die aantonen dat S.mediterranea scrunching in cinnamaldehyde SMTRPA vereist.

Het is essentieel om consistent te zijn en hoe de dieren worden gemanipuleerd om lawaai te verminderen en reproduceerbaarheid in de gedragsmetingen te garanderen. Deze projecten kunnen worden uitgebreid met lichaamsvormanalyse, die het mogelijk zou maken voor identificatie en kwantificering van andere planarian gedragingen die hier niet worden vastgelegd.