Name: Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Leer een betrouwbare methode om nier-residente CD8+ T-cellen te isoleren voor flowcytometrie-analyse. Deze techniek versnelt onderzoek naar effector- en geheugen-T-celreacties na infecties en auto-immuunresponsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidies AI125701 en AI139721, Cancer Research Institute CLIP programma en American Cancer Society subsidie RSG-18-222-01-LIB aan N.Z. Wij danken Karla Gorena en Sebastian Montagnino van Flow Cytometry Facility. Gegevens gegenereerd in de Flow Cytometry Shared Resource Facility werden ondersteund door de University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), NIH / NCI subsidie P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] op UTHSCSA), en UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).

Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, moeten worden goedgekeurd door het desbetreffende Comité voor institutionele dierverzorging en -gebruik (IACUC). Alle hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door IACUC UT Health San Antonio.
1. Adoptieoverdracht van P14 T-cellen naar C57BL/6-ontvangers en LCMV-infectie
<ol><li>Gebruik P14 muizen op 6-12 weken oud. Zorg ervoor dat het geslacht van donor P14 TCR transgene muis moet overeenkomen met het geslacht van C57BL/6 ontvanger muizen. Anders zullen cellen zoals mannelijke T-cellen die overgaan op vrouwelijke muizen resulteren in immuungemedieerde afstoting van circulerende donor T-cellen in ongeveer 12 dagen14.</li>
	<li>Zuiver naïeve CD8+ T-cellen uit de milt en lymfeklieren van een P14 TCR transgene muis met behulp van muis CD8+ T-celzuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.<ol>
<li>Kort, ontleden milt en lymfeklieren, mash de monsters om eencellige suspensie te genereren.</li>
		<li>Om te verrijken voor naïeve T-cellen, voeg biotine-anti-CD44 antilichaam tijdens de eerste antilichaam incubatie stap13. OPMERKING: Negatieve selectie commerciële kit gebruikt in deze stap bevat twee belangrijke componenten voor twee stappen van incubatie (dat wil zeggen, biotine-antilichaam mengsel incubatie en streptavidin-magnetische kraal incubatie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en 1.000 tot 10.000 gezuiverde P14 T-cellen in 200 μL PBS te injecteren in elk geslacht dat overeenkomt met C57BL/6-ontvanger via de staartader. OPMERKING: Gedetailleerd staartaderinjectieprotocol wordt beschreven in stap 2.</li>
	<li>Op de volgende dag ontvangen alle C57BL/6 ontvangers 2 x 105 pfu LCMV Armstrong verdund in 200 μL PBS via een intraperitoneale route.</li>
</ol>2. Intravasculaire etikettering van CD8+ T-cellen
LET OP: Afhankelijk van de onderzoeksinteresses kunnen na een infectie verschillende tijdstippen worden gekozen. Een voorbeeld van dag 30 na infectie (dag 30 na stap 1.4) wordt aangetoond, die vaak wordt beschouwd als een vroeg geheugen tijdpunt voor CD8 T celrespons.
<ol><li>Verdun biotine anti-CD8α antilichaam tot 15 μg/mL in PBS. Zorg ervoor dat elke muis 200 μL PBS krijgt met 3 μg antilichaam. OPMERKING: Biotine anti-CD8 antilichaam wordt hier gebruikt, zodat het flexibeler zal zijn om het uiteindelijke FACS-kleurplaat te ontwerpen. Fluorescerend kleurstof-gelabeld antilichaam kan direct worden gebruikt. Het is echter belangrijk om verschillende klonen van monoklonale antilichamen te gebruiken voor intraveneuze etikettering versus FACS-kleuring.</li>
	<li>Verwarm de staartader van muizen goed met een bovengrondse warmtelamp gedurende 5-10 minuten om de aderen te verwijden. LET OP: Er moet extra op worden gelet om oververhitting van de dieren te voorkomen. Verlaag het vuur of verwijder de warmtelamp als de muizen stopten om te bewegen.</li>
	<li>Teken 200 μL voorverdund anti-CD8α antilichaam mix in een 100 U insulinespuit (28G) en verwijder eventuele luchtbellen door het bewegen van de zuiger op en neer. Buig de naald om een hoek van 150° tussen de naald en de spuit te creëren, schuine kant op, zodat de naald parallel aan de ader zal zijn.</li>
	<li>Beperk de muis met een knaagdier restrainer van de juiste grootte en spray de staart met 70% ethanol om de ader duidelijk zichtbaar te maken. LET OP: De duur van de terughoudendheid moet tot een minimum worden beperkt.</li>
	<li>Houd de staart aan het distale uiteinde met duim en middelvingers van de niet-dominante hand. Plaats de wijsvinger onder de plaats waar de naald zal worden ingevoegd.</li>
	<li>Houd de spuit met de dominante hand vast en steek de naald parallel in de ader naar de richting van het hart. LET OP: Bij het correct plaatsen moet de naald soepel in de ader bewegen.</li>
	<li>Injecteer langzaam 200 μL anti-CD8α antilichaam via de staartader. OPMERKING: Als er een weerstand is of een wit gebied boven de naald op de staart wordt gezien, zit de naald niet in de ader. Start de eerste injectie dicht bij het puntje van de staart. Ga indien nodig naar de onderkant van de staart voor volgende injecties.</li>
	<li>Verwijder de naald en breng compressie voorzichtig aan tot het bloeden stopt.</li>
	<li>Breng de muis terug naar de kooi en euthanaseer de muis na 3-5 min. OPMERKING: De muizen moeten worden geëuthanaseerd via isoflurane kamer gevolgd door cervicale dislocatie. Andere methoden, zoals CO 2-inademing, duren maximaal 5 minuten en kunnen onnodige variatie van intraveneuze antilichaametiketteringstijd introduceren.</li>
	<li>Ontleden de nier met een schaar, breng de hele nier over naar 1,5 mL microcentrifugebuizen en laat de monsters op ijs tot verdere verwerking. OPMERKING: Intacte hele nier kan veilig worden opgeslagen op ijs voor een paar uur voor de daaropvolgende verwerking en spijsvertering.</li>
</ol>3. Enzymatische vertering van de nier
<ol><li>Bereid 6 putplaten met 3mL van de spijsverteringsoplossing (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) voor elke muis, op te slaan op ijs. LET OP: Stock collagenase B-oplossing bij hogere concentratie (bijvoorbeeld 20x) kan worden bereid en opgeslagen bij of onder -20°C. De werkoplossing moet vers worden bereid. Zie tabel 1 voor de recepten voor alle oplossing/buffer die in het huidige protocol wordt gebruikt.</li>
	<li>Voeg 300 μL vergistingsoplossing toe aan de 1,5 mL microcentrifugemonsterbuizen en maak de niermonsters gehakt met een rechte veerschaar. OPMERKING: Het nierweefsel moet worden gehakt in zelfs stukken met een grootte van niet groter dan 1,5 mm in diameters. Er is geen decapsulatiestap vereist.</li>
	<li>Breng de gehakte niermonsters over op 6 putplaten met de spijsverteringsoplossing LET OP: 6 goed platen worden gebruikt voor het gemak alleen wanneer er meerdere monsters worden verwerkt.</li>
	<li>Broed de monsters op 37 °C met zacht schommelen (ongeveer 60 rpm) gedurende 45 min.</li>
	<li>Pureer na de spijsvertering het weefsel met de zuigerflens van een spuit van 3 mL direct in de schotel en breng het over in 15 mL conische buizen. OPMERKING: Meestal is filtratie door een celzeef niet nodig bij deze stap, omdat dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt uitgevoerd naast het zuiveren van levende lymfocyten.</li>
	<li>Draai de monsters 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 3 mL rpmi/10% FCS.</li>
</ol>4. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om lymfocyten te verrijken van de verteerde nier
<ol><li>Draai het monster 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en resuspend de celpellet met 5 mL van 44% Percoll/RPMI mix (44% Percoll + 56% RPMI zonder FBS).</li>
	<li>Plaats de punt van een 3 mL pipet met 3 mL van 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) direct aan de onderkant van elke buis, en laat de oplossing langzaam los, zodat de zware oplossing (67% Percoll/PBS) een aparte laag aan de onderkant vormt en de lichtoplossing (44% Percoll/RPMI) wordt verhoogd. Samen zullen cocktaillagen vormen. OPMERKING: Voor nieuw aangekomen dichtheidsgradiënt medium van de leverancier, voeg 1/10 volume steriele 10x PBS toe aan de fles, meng goed en overweeg het PBS-gebalanceerde dichtheidsgradiëntmedium als 100% oplossing.</li>
	<li>Draai de monsters 20 minuten op kamertemperatuur met minder gas en remstand op 900 x g. LET OP: Voor centrifuges met gas- en reminstellingen (op een schaal van 1-9 (1 betekent minimum en 9 betekent maximaal)), gebruik 6 voor gaspedaal en 4 voor rem.</li>
	<li>Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge zonder de lagen te storen; OPMERKING: Een duidelijke lymfocytenlaag wordt geïdentificeerd tussen de RPMI-laag met roze kleur en de kleurloze PBS-laag.</li>
	<li>Verwijder de bovenste laag met een transferpipet zonder de lymfocytenlaag aan te raken.</li>
	<li>Breng de lymfocytenlaag over op een nieuwe 15 mL buis, vul de buis met PBS/5% FCS en meng door de buis 4-6x langzaam om te keren om voldoende te mengen. LET OP: Deze stap is belangrijk om eventuele resten percoll uit te wassen.</li>
	<li>Draai de monsters 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en schort de celpellet opnieuw op met 500 μL volledig RPMI-medium. De cellen zijn klaar voor flow cytometrie vlekken.</li>
</ol>5. Flow cytometrie kleuring en analyse
LET OP: Volg het standaard cytometrie-kleuringsprotocol voor T-lymfocyten.
<ol><li>Neem ongeveer 1 x 106 cellen voor elke FACS kleuring. LET OP: Gebruik een U-bottom 96 putplaat voor FACS-vlekken. Als het echter slechts om een beperkt aantal monsters gaat, kunnen er ook 5 mL FACS-buizen worden gebruikt.</li>
	<li>Draai de cellen 500 x g 5 min naar beneden bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend elk monster in 50 μL FACS buffer met 10 μg/mL van 2.4G2 FcR blocker (een anti-CD16/32 monoklonale antilichaam om de interactie tussen toegevoegde FACS-antilichamen met FcR te blokkeren). Incubeer op ijs gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg zonder verdere centrifugatie voor elk monster 50 μL oppervlaktevlekkende antilichaammengsels toe, zodat het uiteindelijke kleurvolume 100 μL/elk monster bedraagt. Incubeer op ijs voor 30 minuten in het donker. OPMERKING: Neem fluorescerend gelabelde streptavidin (2 μg/mL of volg de aanbeveling van de fabrikant) op in het antilichaammengsel om CD8α+ intravasculaire CD8+ T-cellen te etiketteren en gebruik fluorescerende anti-CD8β-antilichaam om alle CD8 T-cellen te labelen. Antilichaam mengsel wordt gemaakt door het toevoegen van de gewenste hoeveelheden van geïnteresseerde antilichamen in de FACS buffer.</li>
	<li>Was de monsters twee keer met PBS. Vul voor elke wasbeurt de putten van 96 putplaat met koude PBS, draai 5 min g op 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 100 μL/well van verdunde levende/doodsverf. Incubeer op ijs voor 30 minuten in het donker. OPMERKING: Zelfs met dichtheid gradiënt medium spin, enzymatische spijsvertering stap induceert vaak aanzienlijke celdood in weefsel-ingezeten T-cellen als gevolg van ARTC2.2/P2RX7 signalering15. Live / dood kleurstof vlekken wordt sterk aanbevolen voor fixatie. Anti-ARTC2 nanobody kan worden beheerd in de muizen voor euthanasie om celisolatie-geïnduceerde cel dood te voorkomen.</li>
	<li>Was de monsters twee keer met FACS buffer. Vul voor elke wasbeurt de putten van de 96-putplaat met koude FACS-buffer, draai 5 minuten op 500 x g bij 4 °C en gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 100 μL/well fixing buffer. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten. OPMERKING: De bevestigingsbuffer wordt vers gemaakt door formaldehyde met PBS te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 2% formaldehyde.</li>
	<li>Was de monsters twee keer met FACS buffer. Vul voor elke wasbeurt de putten van 96 putplaat met koude FACS-buffer, draai 5 min g op 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 250 μL/well FACS buffer. Verzegel de plaat, bewaar op 4 °C en bescherm tegen licht tot facs-analyse. OPMERKING: Voordat FACS-analyse wordt geanalyseerd, filtert u de monsters door een nylon gaas van 70 μM om mogelijke celclusters te verwijderen die de FACS-machine kunnen verstoppen.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cell+subsets%2C+migration+patterns%2C+and+tissue+residence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence.</a> Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).</li>
<li>Mueller, S. N., Mackay, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%3A+local+specialists+in+immune+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence.</a> Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).</li>
<li>Park, C. O., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+resident+memory+T+cells+in+protective+immunity+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease.</a> Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).</li>
<li>Schenkel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+memory.+Resident+memory+CD8+T+cells+trigger+protective+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses.</a> Science. 346, 98-101 (2014).</li>
<li>Thome, J. J., Farber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+tissue-resident+T+cells%3A+lessons+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans.</a> Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hobit+and+Blimp1+instruct+a+universal+transcriptional+program+of+tissue+residency+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes.</a> Science. 352, 459-463 (2016).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+Transcription+Factors+Combine+with+the+Cytokines+TGF-beta+and+IL-15+to+Control+Tissue-Resident+Memory+T+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate.</a> Immunity. 43, 1101-1111 (2015).</li>
<li>Milner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx3+programs+CD8%28%2B%29+T+cell+residency+in+non-lymphoid+tissues+and+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours.</a> Nature. 552, 253-257 (2017).</li>
<li>Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Control+of+Tissue-Resident+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells.</a> Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Memory+CD8+T+Cells+Reveals+Regionalization+of+Immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance.</a> Cell. 161, 737-749 (2015).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
<li>Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+Controls+the+Formation+of+Kidney-Resident+T+Cells+via+Promoting+Effector+T+Cell+Extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation.</a> Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+peripheral+migration+by+memory+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells.</a> Nature. 477, 216-219 (2011).</li>
<li>Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARTC2.2%2FP2RX7+Signaling+during+Cell+Isolation+Distorts+Function+and+Quantification+of+Tissue-Resident+CD8%28%2B%29+T+Cell+and+Invariant+NKT+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets.</a> Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).</li>
<li>Fernandez-Ruiz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-Resident+Memory+CD8%28%2B%29+T+Cells+Form+a+Front-Line+Defense+against+Malaria+Liver-Stage+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection.</a> Immunity. 45, 889-902 (2016).</li>
<li>Beura, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+the+environment+recapitulates+adult+human+immune+traits+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice.</a> Nature. 532, 512-516 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen relevante financiële informatie.

Als weefsel specifieke immuniteit is een snelle groeiende gebied van onderzoek, accumuleren bewijs suggereren dat immuuncellen, vooral lymfocyten populatie kan worden geïdentificeerd in bijna alle organen in volwassen menselijke of geïnfecteerde of geïmmuniseerde muizen. LCMV muis infectie model is een gevestigde model om antigeen-specifieke T-cel respons, effector en geheugen T cel differentiatie met inbegrip van TRM biologie over meerdere weefsels te bestuderen. Hier beschreven we een protocol om CD8+</...

Weefsel-resident geheugen (TRM)T-cellen vertegenwoordigen een van de meest voorkomende T-cel populaties in volwassen menselijke en geïnfecteerde muizen. TRM cellen bieden de eerste lijn van immuunafweer en zijn kritisch betrokken bij verschillende fysiologische en pathologische processen1,2,3,4,5. Vergeleken met circulerende T-cellen, TRM cellen dragen verschillende oppervlakte markers met unieke transcriptie programma's6,7,8. Het uitbreiden van onze kennis van TRM biologie is de sleutel tot het begrijpen van T-celreacties die essentieel is voor de toekomstige ontwikkeling van T-celgebaseerde vaccins en immunotherapieën.
Naast de algemeen gedeelde moleculaire markers van TRMs in alle niet-lymfeweefsels, accumuleren bewijs suggereren dat weefsel-specifieke kenmerken zijn een centrale component van TRM biologie9. Nier herbergt veel immuuncellen, waaronder TRM cellen na infectie en biedt een geweldige kans om TRM celbiologie te bestuderen in een niet-mucosale weefsel. Acute LCMV (lymfatische choriomeningitis virus) infectie via intraperitoneale route is een gevestigde systemische infectie model om antigeen-specifieke T-cel reacties bij muizen te bestuderen. De infectie wordt meestal opgelost in 7-10 dagen in wilde type muizen en laat een groot aantal LCMV-specifieke geheugen T cellen in een verscheidenheid van weefsels, waaronder de nier10. P14 TCR (T cel receptor) transgene muizen dragen CD8+ T cellen herkennen een van de immuun-dominante epitopen van LCMV gepresenteerd door MHC-I (klasse I grote histocompatibiliteit complex) molecuul H2-Db in C57BL/6 muizen. Het combineren van congenisch gemarkeerde P14 T-cel adoptieve overdracht en LCMV-infectie bij muizen, CD8+ effector en geheugen T-cellen worden bijgehouden, inclusief TRM-differentiatie en homeostase.
In sommige barrièreweefsels, zoals darm intraepitheliale lymfocyten (IEL) compartiment en speekselklieren, gevestigde lymfocyte isolatie procedure levert een hoog percentage van TRM cellen met minimale door bloed overgedragen T-cel besmetting in de muis LCMV model11. Echter, in niet-barrièreweefsels, zoals de nier, dicht vasculaire netwerk bevat een groot aantal circulerende CD8+ T cellen. Het is goed gedocumenteerd dat zelfs succesvolle perfusie niet efficiënt alle circulerende CD8+ T cellen kan verwijderen. Om deze technische hindernis te overwinnen, intravasculaire antilichaam kleuring is vastgesteld als een van de meest gebruikte technieken in TRM labs12. Kortom, 3-5 minuten voor euthanasie wordt 3 μg/muis anti-CD8 antilichaam (label CD8+ T cellen) intraveneus geleverd. Intacte bloedvatwand voorkomt snelle verspreiding van het antilichaam binnen deze korte periode (d.w.z. 3-5 minuten) en alleen intravasculaire cellen worden gelabeld. Volgens het standaard protocol voor lymfocytenisolatie kunnen intravasculaire versus extravasculaire cellen gemakkelijk te onderscheiden worden met behulp van stroomcytometrie.
Hier zullen we een standaardprotocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-laboratoria om intravasculaire etikettering, lymfocytenisolatie en stroomcytometrieanalyse van nier-CD8+ T-cellen uit te voeren met behulp van een C57BL/6-muis die 30 dagen voor13cd45.1+ P14 T-cellen en LCMV-infectie heeft ontvangen. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om zowel effector als geheugen T-cellen in de nier te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-130</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tubes</td><td>Corning</td><td>431470</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>37C incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>Collegenase B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS 5692</td><td></td></tr><tr><td>Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480043</td><td></td></tr><tr><td>overhead heat lamp</td><td>Amazon</td><td>B00333PZZZG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Solid Brass Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SAI-MBR</td><td></td></tr><tr><td>Swing Bucket Centrifuge with refrigerator</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture 6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van mouse kidney-resident cd8+ t cellen voor flow cytometry analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM)is een snel groeiend gebied van immunologie onderzoek. Het isoleren van T-cellen uit verschillende niet-lymfeweefsels is een van de belangrijkste stappen om TRMs te onderzoeken. Er zijn lichte variaties in lymfocyten isolatie protocollen voor verschillende organen. Nier is een essentieel niet-lymfoïde orgaan met tal van immuuncelinfiltratie vooral na blootstelling aan ziekteverwekkers of auto-immuunactivatie. In de afgelopen jaren zijn meerdere laboratoria, waaronder onze eigen, begonnen met het karakteriseren van nierbewoner CD8+ T-cellen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen in zowel muis als mens. Door de overvloed aan T-lymfocyten, nier vertegenwoordigt een aantrekkelijk model orgaan om TRMs studie in niet-mucosale of niet-barrièreweefsels. Hier zullen we een protocol beschrijven dat vaak wordt gebruikt in TRM-gerichtelaboratoria om CD8+ T-cellen te isoleren van muizennieren na systemische virale infectie. Kortom, met behulp van een acuut lymfatisch choriomeningitisvirus (LCMV) infectiemodel in C57BL/6 muizen, tonen we intravasculaire CD8+ T-cellabeling, enzymatische spijsvertering en dichtheidgradiëntcentrifugatie aan om lymfocyten te isoleren en te verrijken van muizennieren om monsters klaar te maken voor de daaropvolgende stromingscytometry-analyse.

Het hier beschreven protocol wordt samengevat in een stroomdiagram(figuur 1A). Op dag 30 na LCMV infectie, voerden we intravasculaire etikettering van CD8+ T cellen. 5 minuten later werden beide nieren van het dier ontleed, gehakt en onderworpen aan collagenase spijsvertering. Lymfocyten werden verder gezuiverd uit de verteerde monsters via Percoll centrifugatie en geanalyseerd door stroomcytometrie. Zoals blijkt uit figuur 1B, zelfs na dichtheid cent...

Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

CD8+T-cellen dragen verschillende kenmerken in verschillende weefsels, als een kritisch voorbeeld van niet-mucosale en niet-lymfeweefsel. Het is essentieel om nier-ingezeten cellen direct te karakteriseren om T-celbiologie volledig te begrijpen. Hier zullen we onze handige methode demonstreren om nier-resident CD8 + T cellen te isoleren die de volgende stromingscytometrieanalyse opvangen.Deze methode kan inzicht geven in de studies van effector en geheugen CD8 + T cellen gegenereerd na infecties en auto-immuunreacties. De procedure zal worden uitgevoerd door Dr.Chaoyu Ma, een onderzoeker voor mijn laboratorium. Begin met het verdunnen van biotine anti CD8 alfa-antilichaam tot 15 microgram per milliliter in PBS, ervoor te zorgen dat er genoeg is om 200 microliters toe te dienen aan elke muis.Verwarm vóór de injectie de staartader van de muis gedurende vijf tot tien minuten met een bovenleidingslamp om deze te verwijden. Teken 200 microliters van het voorverdunde antilichaam mix in een 28-gauge insulinespuit en verwijder eventuele luchtbellen door het bewegen van de zuiger op en neer. Buig de naald om een hoek van 150 graden te creëren tussen de naald en de spuit, schuine kant omhoog, zodat de naald parallel loopt aan de staartader.Beperk de muis met een knaagdier restrainer en spray de staart met 70% ethanol om de ader duidelijk zichtbaar te maken. Houd de staart aan het distale uiteinde met de duim en middelvingers van de niet-dominante hand en plaats vervolgens de wijsvinger onder de injectieplaats. Steek met de dominante hand de naald parallel in de ader naar de richting van het hart en injecteer langzaam 200 microliter van het antilichaam.Verwijder de naald en comprimeer de injectieplaats zachtjes tot het bloeden stopt. Na het euthanaseren van de muis ontleed je de nier met een schaar en breng je deze over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Laat de monsters op ijs tot verdere verwerking.Bereid zes-put platen met drie milliliter van de spijsvertering oplossing in elke put, met behulp van een put per muis, en bewaar ze op ijs. Voeg 300 microliters van de spijsvertering oplossing in elk monster buis en gehakt van de nier monsters met een rechte veer schaar. Breng de gehakte niermonsters met de spijsverteringsoplossing over op de zes-goed platen.Incubeer de monsters op 37 graden Celsius met zachte schommelen gedurende 45 minuten, dan homogeniseren het weefsel met de zuiger flens van een drie-milliliter spuit en breng het naar 15-milliliter conische buizen. Draai de monsters vijf minuten naar beneden op 500 g en vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in drie milliliter RPMI met 10% FCS.Draai het monster vijf minuten lang naar beneden bij 500 g en vier graden Celsius en verwijder vervolgens de supernatant en zet de celpellet opnieuw op met vijf milliliter van 44% dichtheidsgradiënt medium en RPMI-mix. Zet de punt van een drie-milliliter pipet met drie milliliter van 67%dichtheidgradiënt medium en PBS direct aan de onderkant van elke buis en laat de oplossing langzaam los, zodat de zware oplossing een aparte laag aan de onderkant vormt. Draai de monsters 20 minuten lang op 900 g met minder gas- en reminstellingen en verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge zonder de lagen te storen.Verwijder de toplaag met een transferpipet zonder de lymfocytenlaag aan te raken en breng de lymfocytenlaag over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Vul de buis met PBS en 5% FCS, meng door de buis vier tot zes keer langzaam om te keren. Na het centrifugeren van de monsters op 500 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet met 500 microliters van volledige RPMI medium.De cellen zijn nu klaar voor flow cytometrie vlekken. Zelfs na dichtheid centrifugatie-gemedieerde lymfocyten verrijking, was het heel gebruikelijk om een groot deel van de niet-lymfocyten in het eindproduct te zien. Echter, na het verkrijgen van levende lymfocyten, CD8 + T lymfocyten waren gemakkelijk te identificeren.Zoals verwacht, alleen extra-vasculaire CD8 + T cellen efficiënt verworven weefsel ingezeten geheugen T-cel fenotypes, zoals upregulatie van CD69 en downregulatie van Ly6C. In tegenstelling tot de geïnfecteerde muizen, de overgrote meerderheid van cd8 + T cellen geïsoleerd van jonge naïeve muizen gehuisvest in de SPF faciliteit werden gelabeld met CD8 alpha antilichaam en dus behoorde tot de intravasculaire compartiment. Deze techniek heeft het onderzoek naar weefsel-ingezeten immuuncellen in dicht gevasculariseerde organen sterk versneld.

isolation-mouse-kidney-resident-cd8-t-cells-for-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

DNabT cellen zijn zeldzaam onder perifere T-cellen; maar ze zijn er in overvloed in bepaalde niet-lymfoïde weefsels. Moeilijkheid van het isoleren van DN T-cellen van niet-lymfeweefsel belemmert hun functionele analyse Ondanks toenemende erkend pathofysiologische betekenis. We beschrijven een nieuw protocol voor isolatie van hooggezuiverde DN T-cellen van muizen nier.

Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier

Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.

Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Hierin presenteren wij een protocol om te bereiden enkele cellen uit lymfkliertest thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt aan verdere studie deze cellen met behulp van stroom cytometry. Bovendien, werd dit protocol gebruikt voor het bepalen van de deelverzamelingen van regulatoire T-cellen met behulp van stroom cytometry.

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Leer een betrouwbare methode om nier-residente CD8+ T-cellen te isoleren voor flowcytometrie-analyse. Deze techniek versnelt onderzoek naar effector- en geheugen-T-celreacties na infecties en auto-immuunresponsen.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8⁺ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Meer video's verkennen