Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8⁺ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

CD8+T-cellen dragen verschillende kenmerken in verschillende weefsels, als een kritisch voorbeeld van niet-mucosale en niet-lymfeweefsel. Het is essentieel om nier-ingezeten cellen direct te karakteriseren om T-celbiologie volledig te begrijpen. Hier zullen we onze handige methode demonstreren om nier-resident CD8 + T cellen te isoleren die de volgende stromingscytometrieanalyse opvangen.

Deze methode kan inzicht geven in de studies van effector en geheugen CD8 + T cellen gegenereerd na infecties en auto-immuunreacties. De procedure zal worden uitgevoerd door Dr.Chaoyu Ma, een onderzoeker voor mijn laboratorium. Begin met het verdunnen van biotine anti CD8 alfa-antilichaam tot 15 microgram per milliliter in PBS, ervoor te zorgen dat er genoeg is om 200 microliters toe te dienen aan elke muis.

Verwarm vóór de injectie de staartader van de muis gedurende vijf tot tien minuten met een bovenleidingslamp om deze te verwijden. Teken 200 microliters van het voorverdunde antilichaam mix in een 28-gauge insulinespuit en verwijder eventuele luchtbellen door het bewegen van de zuiger op en neer. Buig de naald om een hoek van 150 graden te creëren tussen de naald en de spuit, schuine kant omhoog, zodat de naald parallel loopt aan de staartader.

Beperk de muis met een knaagdier restrainer en spray de staart met 70% ethanol om de ader duidelijk zichtbaar te maken. Houd de staart aan het distale uiteinde met de duim en middelvingers van de niet-dominante hand en plaats vervolgens de wijsvinger onder de injectieplaats. Steek met de dominante hand de naald parallel in de ader naar de richting van het hart en injecteer langzaam 200 microliter van het antilichaam.

Verwijder de naald en comprimeer de injectieplaats zachtjes tot het bloeden stopt. Na het euthanaseren van de muis ontleed je de nier met een schaar en breng je deze over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Laat de monsters op ijs tot verdere verwerking.

Bereid zes-put platen met drie milliliter van de spijsvertering oplossing in elke put, met behulp van een put per muis, en bewaar ze op ijs. Voeg 300 microliters van de spijsvertering oplossing in elk monster buis en gehakt van de nier monsters met een rechte veer schaar. Breng de gehakte niermonsters met de spijsverteringsoplossing over op de zes-goed platen.

Incubeer de monsters op 37 graden Celsius met zachte schommelen gedurende 45 minuten, dan homogeniseren het weefsel met de zuiger flens van een drie-milliliter spuit en breng het naar 15-milliliter conische buizen. Draai de monsters vijf minuten naar beneden op 500 g en vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in drie milliliter RPMI met 10% FCS.

Draai het monster vijf minuten lang naar beneden bij 500 g en vier graden Celsius en verwijder vervolgens de supernatant en zet de celpellet opnieuw op met vijf milliliter van 44% dichtheidsgradiënt medium en RPMI-mix. Zet de punt van een drie-milliliter pipet met drie milliliter van 67%dichtheidgradiënt medium en PBS direct aan de onderkant van elke buis en laat de oplossing langzaam los, zodat de zware oplossing een aparte laag aan de onderkant vormt. Draai de monsters 20 minuten lang op 900 g met minder gas- en reminstellingen en verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge zonder de lagen te storen.

Verwijder de toplaag met een transferpipet zonder de lymfocytenlaag aan te raken en breng de lymfocytenlaag over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Vul de buis met PBS en 5% FCS, meng door de buis vier tot zes keer langzaam om te keren. Na het centrifugeren van de monsters op 500 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet met 500 microliters van volledige RPMI medium.

De cellen zijn nu klaar voor flow cytometrie vlekken. Zelfs na dichtheid centrifugatie-gemedieerde lymfocyten verrijking, was het heel gebruikelijk om een groot deel van de niet-lymfocyten in het eindproduct te zien. Echter, na het verkrijgen van levende lymfocyten, CD8 + T lymfocyten waren gemakkelijk te identificeren.

Zoals verwacht, alleen extra-vasculaire CD8 + T cellen efficiënt verworven weefsel ingezeten geheugen T-cel fenotypes, zoals upregulatie van CD69 en downregulatie van Ly6C. In tegenstelling tot de geïnfecteerde muizen, de overgrote meerderheid van cd8 + T cellen geïsoleerd van jonge naïeve muizen gehuisvest in de SPF faciliteit werden gelabeld met CD8 alpha antilichaam en dus behoorde tot de intravasculaire compartiment. Deze techniek heeft het onderzoek naar weefsel-ingezeten immuuncellen in dicht gevasculariseerde organen sterk versneld.