Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

Dit hemodynamische lusmodel stelt onderzoekers in staat om de in-vitro hemo compatibiliteit van vasculaire apparaten zoals perfusiebuizen of stents te testen. onder gestandaardiseerde omstandigheden. Deze techniek oefent dus geen invloed uit op het bloed door mechanische kracht en vermijdt zo de misleidende resultaten door intrinsieke activering van de bloedbestanddelen.

Alvorens een experiment te proberen, moet de juiste mechanische scheiding van het deel, de perfecte constructie van het lussluitingssysteem en het langzame bloed laden in de lussen worden uitgeoefend. Om de lusassemblage voor te bereiden, gebruikt u een buissnijder om 250 centimeter lang, vijf millimeter binnendiameter stukken buizen op een vlakke ondergrond te snijden. En sluit de open eindes van de buizen in een kort stukje Silicon buis montage van de buitenste diameter van de onderzoeksbuis om een lus vorm te genereren.

Draai de vergrendelingsschroef van de spanbandconnector voorzichtig aan en pas de sluitkracht zo aan dat er geen gat blijft tussen de twee bochten. Als de vergrendelingsschroef volledig is aangedraaid en de spanning van de polycarbonaatband te laag lijkt om de kloof tussen de twee bochten te dichten, opent u het vergrendelingssysteem en snijdt u een paar millimeter van de spanningsband. Om een stentlusassemblage voor te bereiden, opent u twee van de lussen en haalt u de buis uit het spanbandsysteem.

Steek vervolgens de stent in het midden van de buis, zoals geïnstrueerd door de fabrikant. Wanneer het juiste aantal lussen voor het experiment zijn gegenereerd, beveilig je de lussen in de luswieg van de rotatie-eenheid, buiten een 37 graden waterbad en bevestig je de luswieg aan de rotatie-eenheid in het waterbad. Vul vervolgens een spuit van 10 milliliter voor elke twee lussen bloed die moeten worden verzameld met 150 microliters of vers bereide heparinevoorraadoplossing en gebruik een vlinder van 21 meter om zachtjes bloed in de spuiten te verzamelen, waarbij wordt gezorgd voor homolyse of celactivering als gevolg van overmatig vacuüm.

Wanneer al het bloed is verzameld breng het bloed naar een glazen beker en gebruik een vijf milliliter serologische pipet, om voorzichtig mengen het bloed en heparine. Wanneer een homogene oplossing is verkregen met de pipettepunt die niet volledig in de buis is ingebracht, vul dan voorzichtig elke lus met vijf milliliter bloed. Sluit elke lus nadat deze is gevuld en bevestig dat de lus, spanningsband en rek goed zijn vastgezet.

Draai vervolgens de lussen drie uur lang om 30 omwentelingen per minuut. Laat de lussen aan het einde van de rotatie twee minuten in het rek staan om het bloed te laten ophopen aan de lusbodems voordat u de connectoren zorgvuldig opent en het bloed uit duplicaten in afzonderlijke 10 milliliter glazen bekers trekt. Wanneer al het bloed is verzameld spoel elke buis met 10 milliliter PBS en gebruik een scalpel om zorgvuldig snijden een monster van een centimeter van het einde van elke buis.

Incubeer de monsters 's nachts in 2%glutaraldehyde bij vier graden Celsius, gevolgd door een 15 minuten incubatie en 1% osmiumtetroxide bij kamertemperatuur. Aan het einde van de osmiumteroxide incubatie, dehydrateren van de monsters in een opgaande ethanol serie gedurende 20 minuten per concentratie, gevolgd door een 30 minuten uitdroging in 100%ethanol. Laat de monsters aan het einde van de 100% ethanol incubatie 's nachts drogen bij kamertemperatuur voordat de monsters worden gescand door elektronenmicroscopie te scannen bij een versnellingsspanning van vijf kilovolt, met behulp van een x-ray micro CT-scanner.

Voor flow cytometrische analyse van de bloedmonsters. Breng 100 microliter bloed van elk monster over in elk van de negen facs-buizen van vijf milliliter en bevestig de monsters met de toevoeging van 100 microliters van 4%power formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Na het wassen, opnieuw opschorten elke pellet in een milliliter van rode bloedcel lyse buffer per buis, voor een vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters door centrifugatie in een milliliter PBS per buis en plaats de monsters zonder hun supernatants op ijs. Voor het voorbereiden van enkele vlek compensatie kralen voeg vier druppels positieve en vier druppels negatieve kralen aan individuele een milliliter volumes van FACS buffer, en vortex de oplossingen voor het verkrijgen van homogene kraal suspensaties. Voeg 100 microliter van elke oplossing toe aan elk van de vier of vijf milliliter FACS-buizen die zijn gelabeld zoals aangegeven en was de kralen met één milliliter FACS-buffer per buis.

Voeg vervolgens 100 microliters van de juiste vortex antilichaam cocktail toe aan elke experimentele en fluorescentie minus een buis met zachte menging. Voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met een milliliter verse FACS buffer per monster en resuspend pellets in 250 microliters van FACS buffer per buis.

Voor het analyseren van de kralen op celmonsters door stroom cytometrie, volgens de standaard protocollen. Bloedcelverdelingen kunnen worden gevisualiseerd over het gehele oppervlak van twee bloops door micro CT en scanning elektronenmicroscoop beeldvorming, terwijl er geen stolsels worden waargenomen in gesloten lussen zonder hiaten. Analyse van het totale aantal bloedcellen, toont geen significante verschillen in erythrocyte nummers tussen een van de geteste voorwaarden, bloedplaatjes en leukocyten nummers echter drastisch worden verminderd in de latex loop groep en gratis hemoglobine nummers zijn dramatisch verhoogd, wat wijst op een zeer slechte biocompatibiliteit van latex.

Terwijl alle geteste vasculaire apparaten leiden tot een verhoogde activering van het stollingssysteem en complimentcomponent. De met heparine gecoate PVC-lussen vertonen een trend voor verminderde niveaus van beide soorten activeringen in vergelijking met polymeergecoate PVC-lussen. Latex lussen vertonen de hoogste niveaus van TNF IL-6 en PMN elastase, met de nadruk op de krachtige activering van leukocyten door latex.

CD41 positieve bloedplaatjes hersteld van latex buizen, vertonen een buitengewoon hoge mediane fluorescentie intensiteit voor CD62P, terwijl de geïntegreerde expressie is drastisch verminderd op granulocyten en lymfocyten. Van belang, integraal niveaus zijn hoger in monocyten van latex buizen, wat suggereert monocyte geactiveerde bloedplaatjes interacties. Inderdaad vlekken voor monocyte bloedplaatjes aggregaten blijkt een verhoogde neiging tot aggregatie in latex en stent lussen.

Ondanks de verminderde frequentie van monocyten binnen latex lussen. Om intrinsieke activering van de bloedcomponent te voorkomen is het belangrijk om een goede lussluiting te garanderen en het bloed met zorg te behandelen. Dus na deze procedure is het mogelijk om de interactie tussen allogene eiwitten of TRUCKs en bloedbestanddelen die worden gebruikt in ontsteking of farmaceutisch onderzoek te analyseren.