Manipulatie van enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes met behulp van roboticamicroïsjectie

Deze techniek maakt het mogelijk om een kijkje te geven aan enkele cellen in levend weefsel. Door het bijhouden en manipuleren van enkele cellen, kunnen we de weefselvorming tijdens de ontwikkeling beter begrijpen. Visuele demonstratie van deze methode stelt potentiële gebruikers in staat om te beslissen of deze techniek nuttig kan zijn voor hun werk.

Bovendien, het maakt het mogelijk voor gebruikers om te zien hoe de toepassing wordt uitgevoerd, die moeilijk zou zijn om te begrijpen van de tekst alleen. Dit protocol kan worden toegepast op elk weefsel met een beoordelingsoppervlak. We hebben ons gericht op verschillende cellen in dezelfde weefsels, verschillende weefsels bij dezelfde soort, en ook verschillende soorten.

Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om gefocust te blijven en snel te werken. Alle apparatuur moet worden voorbereid voordat u met de dissectie begint. Begin met het installeren van de auto-injector software en het trekken van de microinjectie pipetten uit borosilicaat glazen haarvaten met de micropipette trekker.

Bewaar de pipetten tot drie dagen beschermd tegen stof. Smelt 3% breed bereik agarose met behulp van een magnetron. Laat de agarose niet stollen door het in een waterbad op 37 graden Celsius te houden.

Ontdooi een aliquot een SCM en warme 10 tot 12 milliliter SIM en 20 milliliter van Tyrode's oplossing tot 37 graden Celsius met behulp van een waterbad. Meng de fluorescerende tracer met de andere chemicaliën die moeten worden geïnjecteerd en verstek vervolgens de micro-injectieoplossing op 16.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng het in een nieuwe buis.

Houd de microinjectieoplossing op ijs tot gebruik. Gebruik de koppen van E13.5 tot E16.5 muisembryo's om organotypische weefselplakken van de telencephalon voor te bereiden. Verwijder de huid en open de schedel met tangen bewegen langs de middellijn.

Ontleden de embryonale hersenen uit de open schedel en verwijder de hersenvliezen die het hersenweefsel vanaf de ventrale kant van de hersenen. Laat het ontleede hele brein in Tyrode's oplossing op het 37 graden Celsius verwarmingsblok. Giet het brede scala gesmolten agarose in een wegwerp inbedding schimmel.

Wanneer het afkoelt tot 38 tot 39 graden Celsius, voorzichtig overdracht tot vier hersenen in de agarose met behulp van een Pasteur pipet. Roer de agarose rond het weefsel met een spatel of een paar Dumont nummer een tang zonder het weefsel aan te raken. Laat de agarose stollen bij kamertemperatuur.

Zodra de agarose is gestold, trim de overtollige rond het weefsel. Vul de bufferlade met PBS. Oriënteer de hersenen met de rostral caudal as van het weefsel loodrecht op de lade en snijd 250 micrometer plakjes met behulp van een vibratome.

Vul een petrischaaltje van 3,5 centimeter met twee milliliter voorverwarmde media en gebruik vervolgens een plastic Pasteur pipet om 10 tot 15 plakjes over te brengen op dit gerecht. Breng de petrischaal met de plakjes in de plakjes cultuurbroeder. Houd de plakjes op 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer.

Zet de computer, microscoop, microscoop camera, manipulators, druk tuig, en druksensor. Laad de toepassing door op het bestand te klikken, app te starten.py in de hoofdmap die is gedownload van GitHub en geef de apparaatinstellingen op in het pop-upscherm.

Om ongewenste verstopping te voorkomen, maakt u een uiterlijke druk voordat u de pipet in de oplossing onderdompelt. Schuif de compensatiedrukbalk naar 24 tot 45% en klik op setwaarden. Stem vervolgens de druk af door de mechanische drukklepknop op één tot twee PSI te draaien, zoals aangegeven door de druksensor.

Breng de plakjes naar het midden van een petrischaaltje van 3,5 centimeter met twee milliliter voorverwarmde SIM en plaats de petrischaal op het microinjectiestadium dat is voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Laad de microinjectiepipet met 1,4 tot 1,6 microliter microinjectieoplossing met behulp van een lange tip plastic pipet en steek de micro-injectie pipet in de pipethouder. Met behulp van de laagste vergroting op de microscoop, breng het segment in focus en begeleiden de micropipet naar dit gezichtsveld, zodat het is gericht op hetzelfde vlak als de slice doel.

Schakel de uitgang van de microscoop naar de camera om de FOV en de toepassing te zien. Klik op de vergrotingsknop linksboven in de interface om apparaatkalibratie te starten. Wanneer een venster vraagt om de vergroting te selecteren, selecteert u de 10X en drukt u op OK. De software gaat ervan uit dat de interne objectieve lens 10X is.

Richt de pipetpunt opnieuw met behulp van het micrometrische wiel van de microscoop en klik met de cursor op de pipetpunt. Druk vervolgens op de knop stap 1.1 en druk op OK in het pop-upvenster. De pipet beweegt in de y-richting.

Klik op de punt van de pipet en druk op de stap 1.2 knop. Tot slot, voer 45 in de pipet hoek doos en druk op de ingestelde hoek. Voer de gewenste parameters in het deelvenster automatische microinjectiebesturingselementen in en stel de snelheid in op 100%Wanneer u klaar bent, klikt u op setwaarden.

Klik op de tekenrandknop en sleep de cursor langs de gewenste baan in het pop-upvenster om de baan van de injectie te definiëren. Voor microinjecterende neuronen, richten op de basale kant van de telencephalon. Breng de pipet aan het begin van de lijn en klik op de tip, klik dan op run traject om te beginnen met microinjecteren.

Herhaal deze stap voor elk vliegtuig van injectie gericht. Dompel de plakjes in het collageenmengsel en breng de plakjes samen met 200 tot 300 microliter van het collageen over in een 14 millimeter put van een glazen bodemschotel van 35 millimeter. Zorg ervoor dat de plakjes zijn bedekt met de minste hoeveelheid collageen mogelijk, dat is de optimale conditie voor voedingsstoffen en zuurstofopname.

Oriënteer de plakjes met behulp van twee paar tangen en inculbaat van de petrischaal gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius op een verwarmingsblok om het collageen te stollen. Verplaats de petrischaal terug naar de slice cultuur incubator voor een extra 40 minuten, voeg dan twee milliliter voorverwarmde SCM. Aan het einde van de cultuur, neem de plakjes uit de slice cultuur incubator en aspirate de SCM.

Was de collageen-ingebedde plakjes met PBS, voeg vervolgens 4% paraformaldehyde toe en laat het weefsel 30 minuten op kamertemperatuur. Verplaats het naar vier graden Celsius voor 's nachts fixatie. De volgende dag u de paraformaldehydeoplossing aanzuigen en de plakjes wassen met PBS.

Verwijder de plakjes uit het collageen met behulp van twee paar tangen onder een stereomicroscoop. Gebruik een magnetron om de 3% lage smeltpunt agarose smelten, giet het dan in een wegwerp inbedding schimmel en laat het afkoelen tot ongeveer 38 of 39 graden Celsius. Breng het weefsel plakjes in deze mal ervoor te zorgen dat de schil kant van de plak naar boven gericht is, dan laat de agarose afkoelen tot kamertemperatuur en stollen.

Trim de extra agarose rond de plakjes. Oriënteer het agaroseblok om ervoor te zorgen dat het snijoppervlak parallel loopt met het snijblad van de vibratome en snijd 50 micrometer dikke secties. Vul een 24-well schotel met PBS en breng de secties in dit gerecht met behulp van een fine-tip penseel, voer dan immunofluorescentie volgens de standaard protocollen.

Representatieve beelden van met succes geïnjecteerde voorlopercellen en pasgeboren neuronen worden hier getoond. Wanneer geïnjecteerd met Dextran Alexa 488, cellen verschijnen volledig gevuld met de kleurstof. Geautomatiseerde microinjectie kan een aanzienlijk hogere doorvoer opleveren in vergelijking met handmatige microinjectie.

Bovendien bevestigt EDU-etikettering dat de levensvatbaarheid van cellen niet wordt aangetast door automatisering. Het houden van de organotypic slice in de cultuur maakt het mogelijk om afstamming progressie van de micro-geïnjecteerde cellen te volgen. Microinjectie in enkele neurale stamcellen biedt een uitstekende eencellige resolutie.

Daarom is het gebruikt om de celbiologie van neurale stamcelprogressie en de overgang van het lot te ontleden. Dit protocol werd gebruikt om junctional koppeling in pasgeboren neuronen te bestuderen door Lucifer geel te injecteren samen met Dextran A555. Een deel van de pasgeboren piramidale neuronen werden gekoppeld via gap junctions naar naburige neuronen, wat in overeenstemming is met het idee dat onrijpe neuronen communiceren via gap junction.

We hebben deze techniek gebruikt om de celbiologie van hersenontwikkeling en hersenevolutie te onderzoeken. We bestudeerden verschillende kandidaat-genen die het neurale stamcelgedrag beïnvloedden en we waren in staat om te ontdekken en te begrijpen hoe ze werken, hoe ze de neurale stamcellijn progressie beïnvloeden, en de neuronproductie tijdens de ontwikkeling van de hersenen.