Name: Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Ontdek een bioinformatica-pijplijn voor moleculaire evolutie en genexpressie-analyse met RNA-seq. Deze methode identificeert kandidaatgenen in Hydra vulgaris voor toekomstig functioneel onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad en Aline G. Rangel voor advies en begeleiding bij het opnemen van enkele van deze stappen in onze workflow. We zijn ook Katherine Williams, Elisabeth Rebboah en Natasha Picciani dankbaar voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship aan A.M.M.

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van UC Irvine.
1. RNA-seq bibliotheekvoorbereiding
<ol><li>Isoleer RNA op de volgende manieren.<ol>
<li>Verzamel monsters. Als RNA op een later tijdstip moet worden geëxtraheerd, moet het monster in de flits worden gevriesdroogd of in RNA-opslagoplossing worden gebracht15 (Tabel met materialen).</li>
		<li>Euthanaseer en ontleed het organisme om weefsels van belang te scheiden.</li>
		<li>Extraheer totaal RNA met behulp van een extractiekit en zuiver het RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit (Tabel van materialen) OPMERKING: Er zijn protocollen en kits die beter kunnen werken voor verschillende soorten en weefseltypen16,17. We hebben RNA geëxtraheerd uit verschillende lichaamsweefsels van een vlinder18 en een gelatineachtige Hydra19 (zie discussie).</li>
		<li>Meet de concentratie en kwaliteit van het RNA van elk monster (Tabel van materialen). Gebruik samples met RNA-integriteitsnummers (RIN) hoger dan 8, idealiter dichter bij 920 om cDNA-bibliotheken te bouwen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construeren cDNA-bibliotheek en -volgorde als volgt.<ol>
<li>Bouw cDNA-bibliotheken volgens de handleiding voor bibliotheekvoorbereiding (zie discussie).</li>
		<li>Bepaal de cDNA-concentratie en -kwaliteit (Tabel van materialen).</li>
		<li>Multiplex de bibliotheken en volg ze.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Toegang tot een computercluster
OPMERKING: RNA-seq-analyse vereist manipulatie van grote bestanden en kan het beste worden uitgevoerd op een computercluster (Tabel met materialen).
<ol><li>Meld u aan bij het computerclusteraccount met behulp van de opdracht ssh username@clusterlocation op een terminal (Mac) of PuTTY (Windows) toepassingsvenster.</li>
</ol>3. Verkrijg RNA-seq leest
<ol><li>RNA-seq-leespunten verkrijgen van de sequencingfaciliteit of, voor gegevens die in een publicatie zijn gegenereerd, uit de gegevensopslagplaats waar deze is gedeponeerd (3.2 of 3.3).</li>
	<li>Ga als volgt te werk om gegevens te downloaden uit opslagplaatsen zoals ArrayExpress:<ol>
<li>Doorzoek de site met behulp van het toetredingsnummer.</li>
		<li>Zoek de koppeling om de gegevens te downloaden en klik met de linkermuisknop en selecteer Koppeling kopiëren.</li>
		<li>Typ in het terminalvenster de koppeling wget en selecteer Plakken om de gegevens naar de map te kopiëren voor analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Volg deze alternatieve stappen om NCBI Short Read Archive (SRA)-gegevens te downloaden:<ol>
<li>Download op de terminal SRA Toolkit v. 2.8.1 met wget. OPMERKING: Voor het downloaden en installeren van programma's naar het computercluster is mogelijk roottoegang vereist, neem contact op met de beheerder van het computercluster als de installatie mislukt.</li>
		<li>Voltooi de installatie van het programma door tar -xvf $TARGZFILE tetypen.</li>
		<li>Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de monsters die u wilt downloaden, het moet de indeling SRRXXXXXX hebben.</li>
		<li>Verkrijg de RNA-seq-gegevens door [sratoolkitlocatie]/bin/prefetch SRRXXXXXX in het terminalvenster te typen.</li>
		<li>Voor paired-end bestanden type [sratoolkit locatie]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX om twee fastq bestanden te krijgen (SRRXXXXXX_1.FASTQ en SRRXXXXXX_2.FASTQ). OPMERKING: Gebruik voor een Trinity de novo-assemblage de opdracht [sratoolkit-locatie]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Trimadapters en leesbare leesten van lage kwaliteit (optioneel)
<ol><li>Installeer of laad Trimmomatic21 v. 0.35 op het computercluster.</li>
	<li>Typ in de map waar de RNA-seq-gegevensbestanden zich bevinden een opdracht met de locatie van het trimmomatische jar-bestand, de INVOER FASTQ-bestanden, uitvoer FASTQ-bestanden en optionele parameters zoals leeslengte en kwaliteit. OPMERKING: De opdracht varieert door de onbewerkte en gewenste kwaliteit en lengte van de leess. Voor Illumina 43 bp leest met Nextera primers, gebruikten we: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEIDEN:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.
</li>
</ol>5. Vraag referentieassemblage aan
<ol><li>Zoek in Google, EnsemblGenomes en NCBI Genomes en Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) naar een referentiegenoom of geassembleerd transcriptoom voor de soort van belang (Figuur 1). OPMERKING: Als een referentiegenoom of transcriptoom niet beschikbaar of van lage kwaliteit is, gaat u verder met STAP 6 om een de novo assemblage te genereren.</li>
	<li>Als er een referentiegenoom of geassembleerd transcriptoom bestaat, downloadt u het als een fasta-bestand naar waar de analyse zal worden uitgevoerd volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Zoek de link om het genoom te downloaden, klik met de linkermuisknop en kopieer de koppeling.</li>
		<li>Typ in het terminalvenster wget en plak het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Genereer een de novo montage (alternatief voor stap 5)
<ol><li>Combineer de RNA-seq READ1 en READ2 fastq bestanden voor alle samples door cat *READ1 te typen. FASTQ > $all_READ1. FASTQ en kat *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ op het terminalvenster.</li>
	<li>Installeer of laad Trinity22 v.2.8.5 op het computercluster.</li>
	<li>Genereren en assembleren door op de terminal te typen: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --rechts $all_READ2. FASTQ.
</li>
</ol>7. Kaart leest naar het genoom (7.1) of de novo transcriptoom (7.2)
<ol><li>Kaart leest naar het referentiegenoom met BEHULP VAN STAR23 v. 2.6.0c en RSEM24 v. 1.3.0.<ol>
<li>Installeer of laad STAR v. 2.6.0c. en RSEM v. 1.3.0 aan het computercluster.</li>
		<li>Indexeer het genoom door rsem-prepare-reference --gtf $GENOME te typen. GTF --ster -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
</li>
		<li>Kaart leest en berekent expressie voor elk monster door rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1 te typen. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.
</li>
		<li>Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend met behulp van mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Genereer een matrix van alle tellingen door rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUTte typen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng RNA-seq in kaart met de Trinity de novo assemblage met RSEM en bowtie.<ol>
<li>Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 en RSEM v. 1.3.0 installeren of laden.</li>
		<li>Kaart leest en berekent expressie voor elk voorbeeld door [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY te typen. FASTA --seqType fq --links $READ 1. FASTQ --rechts $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method strik --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
</li>
		<li>Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend met behulp van mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Genereer een matrix van alle tellingen door [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genen/isovormen].resultaten
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Identificeer genen van belang
OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met nucleotide- of eiwit FASTA-bestanden, maar werken het beste en zijn eenvoudiger met eiwitsequenties. BLAST-zoekopdrachten met behulp van eiwitten naar eiwitten geven eerder resultaten bij het zoeken tussen verschillende soorten.
<ol><li>Gebruik voor een referentiegenoom het eiwit FASTA-bestand uit STAP 5.2.2 of zie Aanvullende materialen om een aangepaste genfunctie GTF te genereren.</li>
	<li>Voor een de novo transcriptoom, genereer een eiwit FASTA met behulp van TransDecoder.<ol>
<li>Installeer of laad TransDecoder v. 5.5.0 op de computercluser.</li>
		<li>Zoek het langste open leesframe en voorspelde peptidesequentie door [Transdecoder-locatie]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY te typen. FASTA.
</li>
	</ol></li>
	<li>Zoek in NCBI Genbank naar homologen bij nauw verwante soorten.<ol>
<li>Open een internetbrowservenster en ga naar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.</li>
		<li>Typ op de zoekbalk de naam van het betrokken gen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced of geslacht of fylum. Selecteer aan de linkerkant van de zoekbalk eiwit en klik vervolgens op zoeken.</li>
		<li>Pak reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer vervolgens Bestand. Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken.
</li>
		<li>Verplaats FASTA-bestand met homologs naar het computercluster door scp$$FASTA username@clusterlocation:/$DIR in een lokaal terminalvenster te typen of FileZilla te gebruiken om bestanden van en naar computer en cluster over te zetten.</li>
	</ol></li>
	<li>Zoek naar kandidaatgenen met BLAST+26.<ol>
<li>Installeer of laad BLAST+ v. 2.8.1 op het computercluster.</li>
		<li>Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoom vertaalde eiwit FASTA door [BLAST+ locatie]/makeblastdb -in $PEP te typen. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
</li>
		<li>BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soorten van belang door [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUTte typen .</li>
		<li>Bekijk het uitvoerbestand met de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand.</li>
		<li>Extraheer de sequenties van kandidaatgenen door perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP te typen. FASTA > $OUTPUT.
</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestig genannotatie met behulp van wederkerige BLAST.<ol>
<li>Ga in de internetbrowser naar https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
		<li>Selecteer tblastn, plak vervolgens de kandidaatsequenties, selecteer de database niet-redundante eiwitsequentie en klik op BLAST.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificeer extra genen door alle genen in het genoom of transcriptoom te annoteren met genontologie (GO) termen (zie discussie).<ol>
<li>Breng het eiwit FASTA over naar de lokale computer.</li>
		<li>Download en installeer Blast2GO27,28,29 v. 5.2 op de lokale computer.</li>
		<li>Open Blast2GO, klik op Bestand, ga naar Laden, ga naar Laad reeksen, klik op Fasta-bestand laden (fasta). Selecteer het FASTA-bestand en klik op Laden.</li>
		<li>Klik op Blast, kies NCBI Blasten klik op Volgende. Bewerk parameters of klik op Volgende, bewerk parameters en klik op Uitvoeren om de meest vergelijkbare genbeschrijving te vinden.</li>
		<li>Klik op toewijzing en klik vervolgens op Uitvoeren om genontologie-annotaties te zoeken naar vergelijkbare eiwitten.</li>
		<li>Klik vervolgens op interpro, selecteer EMBL-EBI InterProen klik op Volgende. Bewerk parameters of klik op Volgendeen klik op Uitvoeren om te zoeken naar handtekeningen van bekende genfamilies en domeinen.</li>
		<li>Exporteer de aantekeningen door op Bestandte klikken , selecteer Exporteren, klik op Tabel exporteren. Klik op Bladeren, geef het bestand een naam, klik op Opslaan, klik op Exporteren.</li>
		<li>Zoek in de annotatietabel naar go-termen om aanvullende kandidaatgenen te identificeren. De sequenties uit het FASTA-bestand extraheren (STAP 8.4.5)</li>
	</ol></li>
</ol>9. Fylogenetische bomen
<ol><li>Download en installeer MEGA30 v. 7.0.26 op uw lokale computer.</li>
	<li>Open MEGA, klik op Uitlijnen, klik op Uitlijning bewerken/bouwen, selecteer Een nieuwe uitlijning maken klik op OK, selecteer Eiwit.</li>
	<li>Wanneer het uitlijningsvenster wordt geopend, klikt u op Bewerken, klikt u op Reeksen invoegen uit bestand en selecteert u de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen.</li>
	<li>Selecteer alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen. Er zou moeten staan Uitlijnen sequenties met behulp van MUSCLE31 algoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen. Bewerk parameters of klik op OK om uit te lijnen met standaardparameters.</li>
	<li>Inspecteer visueel en breng handmatige wijzigingen aan en sla het uitlijningsvenster op en sluit het.</li>
	<li>Klik in het hoofdvenster van MEGA op Modellen, klik op Beste DNA/Eiwitmodellen (ML)zoeken, selecteer het uitlijningsbestand en selecteer overeenkomstige parameters zoals: Analyse: Modelselectie (ML), Te gebruiken boom: Automatisch (buur-verbindende boom), Statistische methode: Maximale waarschijnlijkheid, Substitutietype: Aminozuur, Gap/ontbrekende gegevensbehandeling: Gebruik alle sites, Branch site filter: Geen.
</li>
	<li>Zodra het beste model voor de gegevens is bepaald, gaat u naar het hoofdvenster MEGA. Klik op Phylogeny en klik op Contruct/Test Maximum Probability Tree en selecteer indien nodig de uitlijning. Selecteer de juiste parameters voor de boom: Statistische methode: Maximale waarschijnlijkheid, Test van Phylogeny: Bootstrap-methode met 100 replica's, substitutietype: aminozuur, model: LG met Freqs. (+F), tarieven tussen sites: gamma distributed (G) met 5 discrete gammacategorieën, gap/missing data treatment: gebruik alle sites, ML heuristische methode: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).
</li>
</ol>10. Visualiseer genexpressie met TPM
<ol><li>Voor Trinity gaat u op het computercluster naar de map waar abundance_estimates_to_matrix.pl is uitgevoerd en moet een van de uitvoer matrix zijn. TPM.not_cross_norm. Breng dit bestand over naar uw lokale computer. OPMERKING: Zie Aanvullende materialen voor kruismonsternormalisatie.</li>
	<li>Volg voor TPMs uit een genoomanalyse de onderstaande stappen.<ol>
<li>Ga op het computercluster naar de RSEM-installatielocatie. Kopieer rsem-generate-data-matrix door scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix tetypen. Gebruik nano om het nieuwe bestand te bewerken en "mijn $offsite = 4" te wijzigen van 4 naar 5 voor TPM, het zou nu "mijn $offsite = 5" moeten lezen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ga naar de map waar de RSEM-uitvoerbestanden .genes.results zich bevinden en gebruik nu rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT om een TPM-matrix te genereren. Resultaten overbrengen naar een lokale computer.</li>
	<li>Visualiseer de resultaten in ggplot2.<ol>
<li>Download R v. 4.0.0 en RStudio v. 1.2.1335 naar een lokale computer.</li>
		<li>Open RStudio aan de rechterkant van het scherm ga naar het tabblad Pakketten en klik op Installeren. Typ ggplot2 en klik op installeren.</li>
		<li>In het R-scriptvenster gelezen in de TPM-tabel door gegevens te typen<-read.table("$tpm.txt",header = T)
</li>
		<li>Voor staafgrafieken vergelijkbaar met figuur 4 typt iets vergelijkbaars met: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity") vul<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6") p<-p+scale_fill_manual(waarden=invullen) p + thema(axis.text.x = element_text(hoek = 90))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het doel van dit protocol is om een overzicht te geven van de stappen voor het karakteriseren van een genfamilie met behulp van RNA-seq-gegevens. Het is bewezen dat deze methoden werken voor verschillende soorten en datasets4,34,35. De hier opgerichte pijplijn is vereenvoudigd en moet gemakkelijk genoeg zijn om te worden gevolgd door een beginner in bioinformatica. Het belang van het protocol is dat het alle stappen en noodzakel...

Vooruitgang in sequencingtechnologieën heeft de sequencing van genomen en transcriptomen van niet-modelorganismen vergemakkelijkt. Naast de toegenomen haalbaarheid van het sequentiëren van DNA en RNA van veel organismen, is een overvloed aan gegevens openbaar beschikbaar om genen van belang te bestuderen. Het doel van dit protocol is om bio-informatische stappen te bieden om de moleculaire evolutie en expressie van genen te onderzoeken die een belangrijke rol kunnen spelen in het organisme van belang.
Het onderzoeken van de evolutie van een gen of genenfamilie kan inzicht geven in de evolutie van biologische systemen. Leden van een genfamilie worden meestal bepaald door het identificeren van geconserveerde motieven of homologe gensequenties. Genfamilie-evolutie werd eerder onderzocht met behulp van genomen van verre verwante modelorganismen1. Een beperking van deze benadering is dat het niet duidelijk is hoe deze genfamilies evolueren in nauw verwante soorten en de rol van verschillende selectieve omgevingsdruk. In dit protocol nemen we een zoektocht op naar homologen bij nauw verwante soorten. Door een fylogenie op fylumniveau te genereren, kunnen we trends in de evolutie van genfamilies opmerken, zoals die van geconserveerde genen of afstammingsspecifieke duplicaties. Op dit niveau kunnen we ook onderzoeken of genen orthesen of paralogen zijn. Hoewel veel homologen waarschijnlijk op dezelfde manier met elkaar functioneren, is dat niet noodzakelijk het geval2. Het opnemen van fylogenetische bomen in deze studies is belangrijk om op te lossen of deze homologe genen orthesen zijn of niet. Bij eukaryoten behouden veel ortheologen vergelijkbare functies in de cel, zoals blijkt uit het vermogen van zoogdiereiwitten om de functie van gistortheologen te herstellen3. Er zijn echter gevallen waarin een niet-orthologisch gen een gekarakteriseerde functie vervult4.
Fylogenetische bomen beginnen relaties tussen genen en soorten af te bakenen, maar de functie kan niet alleen worden toegewezen op basis van genetische relaties. Genexpressiestudies in combinatie met functionele annotaties en verrijkingsanalyse bieden een sterke ondersteuning voor de genfunctie. Gevallen waarin genexpressie kan worden gekwantificeerd en vergeleken tussen individuen of weefseltypen kunnen meer vertellen over de potentiële functie. Het volgende protocol volgt methoden die worden gebruikt bij het onderzoeken van opsinegenen in Hydra vulgaris7, maar ze kunnen worden toegepast op elke soort en elke genfamilie. De resultaten van dergelijke studies vormen een basis voor verder onderzoek naar genfunctie en gennetwerken in niet-modelorganismen. Het onderzoek naar de fylogenie van opsines, eiwitten die de fototransductiecascade initiëren, geeft bijvoorbeeld context aan de evolutie van ogen en lichtdetectie8,9,10,11. In dit geval kunnen niet-modelorganismen, met name basale diersoorten zoals cnidarianen of ctenoforen, de instandhouding of veranderingen in de fototransductiecascade en het gezichtsvermogen over de clades12,13,14verduidelijken . Evenzo zal het bepalen van de fylogenie, expressie en netwerken van andere genfamilies ons informeren over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan aanpassingen.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer-DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>Bioanalyzer-RNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Op computercluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr><tr><td>Blast2GO (op uw pc)</td><td></td><td></td><td>Op lokale computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr><tr><td>Computing cluster (ten zeerste aanbevolen)</td><td></td><td></td><td>OPMERKING: Analyses van genomische gegevens worden het best uitgevoerd op een high-performance computing cluster omdat de bestanden erg groot zijn.</td></tr><tr><td>Cufflinks v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td><td></td><td></td><td>In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>MEGA7 (op uw pc)</td><td></td><td></td><td>Op lokale computer https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>Op lokale computer https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>Op computercluster</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>Computersoftware https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>Op lokale computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>Computersoftware</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr><tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>Op computercluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>Op computercluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Downloads en installatie op de computercluster vereisen mogelijk root-toegang. Neem contact op met uw netwerkbeheerder.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van rna-seq

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Het distilleren en rapporteren van grote datasets, zoals hele genoom- of transcriptoomgegevens, is vaak een ontmoedigende taak. Een manier om resultaten op te splitsen is door je te concentreren op een of meer genfamilies die belangrijk zijn voor het organisme en de studie. In dit protocol schetsen we bioinformatische stappen om een fylogenie te genereren en de expressie van interessegenen te kwantificeren. Fylogenetische bomen kunnen inzicht geven in hoe genen zich ontwikkelen binnen en tussen soorten en orthologie onthullen. Deze resultaten kunnen worden verbeterd met behulp van RNA-seq-gegevens om de expressie van deze genen in verschillende individuen of weefsels te vergelijken. Studies van moleculaire evolutie en expressie kunnen modi van evolutie en behoud van genfunctie tussen soorten onthullen. De karakterisering van een genfamilie kan dienen als springplank voor toekomstige studies en kan een belangrijke genfamilie benadrukken in een nieuw genoom of transcriptoompapier.

De bovenstaande methoden zijn samengevat in figuur 1 en werden toegepast op een dataset van Hydra vulgaris weefsels. H. vulgaris is een zoetwater ongewervelde die behoort tot de phylum Cnidaria die ook koralen, kwallen en zee-anemonen omvat. H. vulgaris kunnen zich aseksueel voortplanten door te ontluiken en ze kunnen hun hoofd en voet regenereren wanneer ze worden doorsneden. In deze studie wilden we de evolutie en expressie van opsinegenen in Hydra</...

Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.

Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Dit protocol schetst bio-informatische stappen voor het onderzoeken van de moleculaire evolutie en expressie van kandidaatgenen. Hier geven we grondige instructies zodat iedereen met minimale bio-informatische ervaring dit protocol kan doorlopen. Deze pijpleiding kan worden toegepast op elk organisme en elke genfamilie.Een veelvoorkomend probleem bij het uitvoeren van bioinformatica is dat shellscripts mislukken. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat u de meest recente software hebt, lees de foutbestanden en controleer de handleiding zorgvuldig. Meld u om te beginnen aan bij het computerclusteraccount op een terminal of PuTTY-toepassingsvenster.Download op de terminal SRA Toolkit versie 2.8.1 met Wget en voltooi vervolgens de installatie van het programma. Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de gewenste monsters en verkrijg vervolgens de RNA-sequentiegegevens in het terminalvenster. Verkrijg twee FASTQ-bestanden voor het type gekoppelde bestanden.Zoek het referentiegenoom online als er een bestaat. Als u een referentieassemblage wilt verkrijgen, typt u wget in het terminalvenster en plakt u het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.Indexeer het genoom, breng vervolgens de lees- en berekeningsexpressie voor elk monster in kaart. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend en genereer een matrix van alle tellingen. Open een internetbrowservenster en ga naar NCBI GenBank.Typ in de zoekbalk de naam van het interessegen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced. Selecteer eiwit aan de linkerkant van de zoekbalk en klik vervolgens op Zoeken. Pak de reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer Vervolgens Bestand.Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken. Verplaats FASTA-bestand met homologen naar het computercluster met behulp van een lokaal terminalvenster of FileZilla. Zoek vervolgens naar kandidaatgenen met BLAST+Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoomge translateeerde eiwit FASTA.BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soort van belang, bekijk vervolgens het uitvoerbestand met behulp van de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand. Extraheer de sequenties van kandidaatgenen.Als u genannotatie wilt bevestigen met Behulp van Reciprocal BLAST, gaat u naar het BLAST Local Alignment Search Tool, selecteert u BLASTP, plakt u de kandidaatsequenties, selecteert u de niet-redundante eiwitsequentiedatabase en klikt u op BLAST. Open MEGA, klik op Uitlijnen, bewerk vervolgens Build Alignment, selecteer Een nieuwe uitlijning maken en klik op OK. Selecteer Eiwit. Wanneer het venster Uitlijning wordt geopend, klikt u op Bewerken.Klik op Sequenties invoegen uit bestand en selecteer de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen. Selecteer Alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen.Het zou moeten zeggen uitlijnen sequenties met behulp van spieralgoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen Parameters bewerken of klik op OK om standaardparameters te gebruiken. Dit protocol werd toegepast op weefsels van Hydra vulgaris, een zoetwater ongewerveld die behoort tot de fylum Cnidaria.Opsin genen werden onderzocht om inzicht te krijgen in de evolutie van ogen en lichtdetectie bij dieren. Sequenties voor opsin-gerelateerde genen van H.vulgaris en andere soorten werden geëxtraheerd in een FASTA-bestand van de NCBI GenBank. De opsinegenen werden uitgelijnd in MEGA, waardoor het mogelijk was om Hydra-opsines te identificeren die een geconserveerd lysine-aminozuur misten dat nodig was om een lichtgevoelig molecuul te binden.Een boom met maximale waarschijnlijkheid werd gegenereerd met behulp van opsin-sequenties van Hydra vulgaris en andere soorten. De fylogenie suggereert dat opsinegenen evolueren door afstammingsspecifieke duplicaties bij cnidarianen, en mogelijk door tandemduplicatie in H.vulgaris. Vervolgens werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd in edgeR om de absolute expressie van opsinegenen te onderzoeken.Om te bepalen of een of meer opsinen up-gereguleerd zijn in het hypostoom, of hoofd, werden paarsgewijs vergelijkingen van hypostoom versus de lichaamskolom, ontluikende zone, voet en tentakels uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat 1.774 transcripties verschillend werden uitgedrukt tussen het hypostoom en de lichaamskolom. De genen die in meerdere vergelijkingen up-gereguleerd waren, werden bepaald en er werd een functionele verrijking in Blast2GO uitgevoerd.Ten slotte werd de absolute expressie van opsingenen onderzocht in verschillende weefsels tijdens verschillende stadia van ontluiken en tijdens verschillende tijdspunten van regeneratie. Visuele inspectie van de uitlijning en boom zal bevestigen of kandidaatgenen tot de familie van belang behoren. Genen die te verschillend zijn in volgorde of een groep buiten al het andere, maken waarschijnlijk deel uit van een andere genenfamilie.Resultaten van dit protocol kunnen worden beschouwd als hypothesegenererend. Deze pijplijn kan kandidaatgenen markeren om functioneel te bestuderen in toekomstige studies. Na het verkennen van Hydra opsin expressie, gebruiken we nu vergelijkbare technieken om gerelateerde genen tussen soorten te onderzoeken om overeenkomsten en verschillen in functie te identificeren.

a-bioinformatics-pipeline-for-investigating-molecular-evolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Hier presenteren we een Bioinformatic aanpak en analyses om lijn-1 expressie te identificeren op de Locus specifieke niveau.

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Deze methode beschrijft de stappen om de kwaliteit en kwantiteit van sequentiegegevens te verbeteren die kunnen worden verkregen uit formeel vaste paraffine-embedded (FFPE) RNA-monsters. We beschrijven de methodologie om de kwaliteit van FFPE-RNA-monsters nauwkeuriger te beoordelen, sequencingbibliotheken voor te bereiden en de gegevens van FFPE-RNA-monsters te analyseren.

Optimalisatie voor sequencing en analyse van gedegradeerde FFPE-RNA Samples

Een gedetailleerd protocol van differentiële expressie analysemethoden voor RNA-sequencing werd verstrekt: limma, EdgeR, DESeq2.

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen. Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zal dienen als instrument van de moleculaire chirurgie en...

Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Een demonstratie van de isolatie van neonatale muis ruggenmerg voor elektrofysiologische studies.

Spinal Cord Elektrofysiologie

Ontdek een bioinformatica-pijplijn voor moleculaire evolutie en genexpressie-analyse met RNA-seq. Deze methode identificeert kandidaatgenen in Hydra vulgaris voor toekomstig functioneel onderzoek.

Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq

Meer video's verkennen