Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq
May 28th, 2021
Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.
Dit protocol schetst bio-informatische stappen voor het onderzoeken van de moleculaire evolutie en expressie van kandidaatgenen. Hier geven we grondige instructies zodat iedereen met minimale bio-informatische ervaring dit protocol kan doorlopen. Deze pijpleiding kan worden toegepast op elk organisme en elke genfamilie.
Een veelvoorkomend probleem bij het uitvoeren van bioinformatica is dat shellscripts mislukken. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat u de meest recente software hebt, lees de foutbestanden en controleer de handleiding zorgvuldig. Meld u om te beginnen aan bij het computerclusteraccount op een terminal of PuTTY-toepassingsvenster.
Download op de terminal SRA Toolkit versie 2.8.1 met Wget en voltooi vervolgens de installatie van het programma. Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de gewenste monsters en verkrijg vervolgens de RNA-sequentiegegevens in het terminalvenster. Verkrijg twee FASTQ-bestanden voor het type gekoppelde bestanden.
Zoek het referentiegenoom online als er een bestaat. Als u een referentieassemblage wilt verkrijgen, typt u wget in het terminalvenster en plakt u het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.
Indexeer het genoom, breng vervolgens de lees- en berekeningsexpressie voor elk monster in kaart. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend en genereer een matrix van alle tellingen. Open een internetbrowservenster en ga naar NCBI GenBank.
Typ in de zoekbalk de naam van het interessegen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced. Selecteer eiwit aan de linkerkant van de zoekbalk en klik vervolgens op Zoeken. Pak de reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer Vervolgens Bestand.
Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken. Verplaats FASTA-bestand met homologen naar het computercluster met behulp van een lokaal terminalvenster of FileZilla. Zoek vervolgens naar kandidaatgenen met BLAST+Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoomge translateeerde eiwit FASTA.
BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soort van belang, bekijk vervolgens het uitvoerbestand met behulp van de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand. Extraheer de sequenties van kandidaatgenen.
Als u genannotatie wilt bevestigen met Behulp van Reciprocal BLAST, gaat u naar het BLAST Local Alignment Search Tool, selecteert u BLASTP, plakt u de kandidaatsequenties, selecteert u de niet-redundante eiwitsequentiedatabase en klikt u op BLAST. Open MEGA, klik op Uitlijnen, bewerk vervolgens Build Alignment, selecteer Een nieuwe uitlijning maken en klik op OK. Selecteer Eiwit. Wanneer het venster Uitlijning wordt geopend, klikt u op Bewerken.
Klik op Sequenties invoegen uit bestand en selecteer de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen. Selecteer Alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen.
Het zou moeten zeggen uitlijnen sequenties met behulp van spieralgoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen Parameters bewerken of klik op OK om standaardparameters te gebruiken. Dit protocol werd toegepast op weefsels van Hydra vulgaris, een zoetwater ongewerveld die behoort tot de fylum Cnidaria.
Opsin genen werden onderzocht om inzicht te krijgen in de evolutie van ogen en lichtdetectie bij dieren. Sequenties voor opsin-gerelateerde genen van H.vulgaris en andere soorten werden geëxtraheerd in een FASTA-bestand van de NCBI GenBank. De opsinegenen werden uitgelijnd in MEGA, waardoor het mogelijk was om Hydra-opsines te identificeren die een geconserveerd lysine-aminozuur misten dat nodig was om een lichtgevoelig molecuul te binden.
Een boom met maximale waarschijnlijkheid werd gegenereerd met behulp van opsin-sequenties van Hydra vulgaris en andere soorten. De fylogenie suggereert dat opsinegenen evolueren door afstammingsspecifieke duplicaties bij cnidarianen, en mogelijk door tandemduplicatie in H.vulgaris. Vervolgens werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd in edgeR om de absolute expressie van opsinegenen te onderzoeken.
Om te bepalen of een of meer opsinen up-gereguleerd zijn in het hypostoom, of hoofd, werden paarsgewijs vergelijkingen van hypostoom versus de lichaamskolom, ontluikende zone, voet en tentakels uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat 1.774 transcripties verschillend werden uitgedrukt tussen het hypostoom en de lichaamskolom. De genen die in meerdere vergelijkingen up-gereguleerd waren, werden bepaald en er werd een functionele verrijking in Blast2GO uitgevoerd.
Ten slotte werd de absolute expressie van opsingenen onderzocht in verschillende weefsels tijdens verschillende stadia van ontluiken en tijdens verschillende tijdspunten van regeneratie. Visuele inspectie van de uitlijning en boom zal bevestigen of kandidaatgenen tot de familie van belang behoren. Genen die te verschillend zijn in volgorde of een groep buiten al het andere, maken waarschijnlijk deel uit van een andere genenfamilie.
Resultaten van dit protocol kunnen worden beschouwd als hypothesegenererend. Deze pijplijn kan kandidaatgenen markeren om functioneel te bestuderen in toekomstige studies. Na het verkennen van Hydra opsin expressie, gebruiken we nu vergelijkbare technieken om gerelateerde genen tussen soorten te onderzoeken om overeenkomsten en verschillen in functie te identificeren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de moleculaire evolutie en expressie van kandidaat-genen door gebruik te maken van RNA-sequencing data, specifiek gericht op opsine-genen in Hydra vulgaris. De studie toont een bioinformatica-pijplijn die op verschillende organismen kan worden toegepast.
Belangrijke studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Genexpressieanalyse
- Moleculaire evolutie
- Bioinformatica
Achtergrond
- Onderzoekt kandidaat-genen die relevant zijn voor lichtdetectie en oogevolutie
- Gebruikt de zoetwaterinvertebreed Hydra vulgaris
- Maakt gebruik van NCBI-bronnen voor het ophalen van sequentiegegevens
Gebruikte methoden
- Bioinformatica-pijplijn voor RNA-sequencing
- Hydra vulgaris als het biologische systeem
- Gereedschappen zoals BLAST, MEGA en edgeR voor analyse
Belangrijkste resultaten
- Identificeerde opsine-genen die evolueren door middel van lijnspecifieke duplicaties in Cnidarians
- Vond differentiële expressie van 1.774 transcripten in verschillende lichaamsdelen
- Gemaakt een maximum-likelihood fylogenetische boom van opsine-sequenties
Conclusies
- Het protocol benadrukt het potentieel van kandidaat-genen voor toekomstige functionele studies
- Verbetert ons begrip van gen-evolutie en expressie in relatie tot sensorische biologie
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This bioinformatics pipeline enables systematic investigation of gene family evolution and expression, supporting target validation through mechanistic de-risking in early discovery. By integrating phylogenetic analysis with RNA-seq quantification, it provides predictive confidence for prioritizing candidate genes with conserved or divergent functions across species. The approach aids portfolio triage by identifying mechanistically informed hypotheses before committing resources to functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying gene orthology and evolutionary relationships within target families.
- Operational Value: Enables functional target validation through comparative expression profiling across tissues and developmental stages.
- Predictive Value: Supports lead identification by highlighting genes with lineage-specific expansions and tissue-enriched expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated gene sets for downstream screening by confirming family membership through sequence alignment and tree topology.
- Operational Value: Generates standardized count matrices from RNA-seq data, enabling reproducible quantitative outputs for assay readiness.
- Scalability: Facilitates platform reuse across organisms by applying consistent BLAST, alignment, and phylogenetic workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase expression data to preclinical models by identifying conserved expression patterns in relevant tissues.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker discovery through differential expression analysis across conditions, such as hypostome versus body column in Hydra.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing expression dynamics during regeneration and budding stages, indicating functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling hypothesis-driven progression from sequence analysis to functional prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by generating phylogenies that reveal duplication events and selection pressures on gene families of interest.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems through normalized expression matrices that allow cross-sample comparison of gene activity.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via edgeR-based differential expression, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying genes with conserved roles in sensory systems across metazoans.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable bioinformatic capability for interrogating any gene family, reducing redundant pipeline development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through evolutionary and expression context.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via documented, stepwise bioinformatic procedures applicable across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets before investment in wet-lab validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting genes with strong evolutionary conservation and tissue-specific induction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, including command-line tools, sequence databases, and phylogenetic software.
- Depends on access to computational infrastructure for handling large RNA-seq datasets and running BLAST, MEGA, and edgeR analyses.
- Necessitates cross-team standardization on file naming, reference genome versions, and parameter settings for alignment and tree building.
- Involves adaptation considerations when applying the pipeline to non-model organisms with incomplete genomes or annotations.
- Limited by the quality and completeness of input data, including RNA-seq depth and reference genome annotation accuracy.
