Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq
28 mei 2021
Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.
Dit protocol schetst bio-informatische stappen voor het onderzoeken van de moleculaire evolutie en expressie van kandidaatgenen. Hier geven we grondige instructies zodat iedereen met minimale bio-informatische ervaring dit protocol kan doorlopen. Deze pijpleiding kan worden toegepast op elk organisme en elke genfamilie.
Een veelvoorkomend probleem bij het uitvoeren van bioinformatica is dat shellscripts mislukken. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat u de meest recente software hebt, lees de foutbestanden en controleer de handleiding zorgvuldig. Meld u om te beginnen aan bij het computerclusteraccount op een terminal of PuTTY-toepassingsvenster.
Download op de terminal SRA Toolkit versie 2.8.1 met Wget en voltooi vervolgens de installatie van het programma. Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de gewenste monsters en verkrijg vervolgens de RNA-sequentiegegevens in het terminalvenster. Verkrijg twee FASTQ-bestanden voor het type gekoppelde bestanden.
Zoek het referentiegenoom online als er een bestaat. Als u een referentieassemblage wilt verkrijgen, typt u wget in het terminalvenster en plakt u het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.
Indexeer het genoom, breng vervolgens de lees- en berekeningsexpressie voor elk monster in kaart. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend en genereer een matrix van alle tellingen. Open een internetbrowservenster en ga naar NCBI GenBank.
Typ in de zoekbalk de naam van het interessegen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced. Selecteer eiwit aan de linkerkant van de zoekbalk en klik vervolgens op Zoeken. Pak de reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer Vervolgens Bestand.
Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken. Verplaats FASTA-bestand met homologen naar het computercluster met behulp van een lokaal terminalvenster of FileZilla. Zoek vervolgens naar kandidaatgenen met BLAST+Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoomge translateeerde eiwit FASTA.
BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soort van belang, bekijk vervolgens het uitvoerbestand met behulp van de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand. Extraheer de sequenties van kandidaatgenen.
Als u genannotatie wilt bevestigen met Behulp van Reciprocal BLAST, gaat u naar het BLAST Local Alignment Search Tool, selecteert u BLASTP, plakt u de kandidaatsequenties, selecteert u de niet-redundante eiwitsequentiedatabase en klikt u op BLAST. Open MEGA, klik op Uitlijnen, bewerk vervolgens Build Alignment, selecteer Een nieuwe uitlijning maken en klik op OK. Selecteer Eiwit. Wanneer het venster Uitlijning wordt geopend, klikt u op Bewerken.
Klik op Sequenties invoegen uit bestand en selecteer de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen. Selecteer Alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen.
Het zou moeten zeggen uitlijnen sequenties met behulp van spieralgoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen Parameters bewerken of klik op OK om standaardparameters te gebruiken. Dit protocol werd toegepast op weefsels van Hydra vulgaris, een zoetwater ongewerveld die behoort tot de fylum Cnidaria.
Opsin genen werden onderzocht om inzicht te krijgen in de evolutie van ogen en lichtdetectie bij dieren. Sequenties voor opsin-gerelateerde genen van H.vulgaris en andere soorten werden geëxtraheerd in een FASTA-bestand van de NCBI GenBank. De opsinegenen werden uitgelijnd in MEGA, waardoor het mogelijk was om Hydra-opsines te identificeren die een geconserveerd lysine-aminozuur misten dat nodig was om een lichtgevoelig molecuul te binden.
Een boom met maximale waarschijnlijkheid werd gegenereerd met behulp van opsin-sequenties van Hydra vulgaris en andere soorten. De fylogenie suggereert dat opsinegenen evolueren door afstammingsspecifieke duplicaties bij cnidarianen, en mogelijk door tandemduplicatie in H.vulgaris. Vervolgens werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd in edgeR om de absolute expressie van opsinegenen te onderzoeken.
Om te bepalen of een of meer opsinen up-gereguleerd zijn in het hypostoom, of hoofd, werden paarsgewijs vergelijkingen van hypostoom versus de lichaamskolom, ontluikende zone, voet en tentakels uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat 1.774 transcripties verschillend werden uitgedrukt tussen het hypostoom en de lichaamskolom. De genen die in meerdere vergelijkingen up-gereguleerd waren, werden bepaald en er werd een functionele verrijking in Blast2GO uitgevoerd.
Ten slotte werd de absolute expressie van opsingenen onderzocht in verschillende weefsels tijdens verschillende stadia van ontluiken en tijdens verschillende tijdspunten van regeneratie. Visuele inspectie van de uitlijning en boom zal bevestigen of kandidaatgenen tot de familie van belang behoren. Genen die te verschillend zijn in volgorde of een groep buiten al het andere, maken waarschijnlijk deel uit van een andere genenfamilie.
Resultaten van dit protocol kunnen worden beschouwd als hypothesegenererend. Deze pijplijn kan kandidaatgenen markeren om functioneel te bestuderen in toekomstige studies. Na het verkennen van Hydra opsin expressie, gebruiken we nu vergelijkbare technieken om gerelateerde genen tussen soorten te onderzoeken om overeenkomsten en verschillen in functie te identificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de moleculaire evolutie en expressie van kandidaatgenen door gebruik te maken van RNA-sequencingdata, met een specifieke focus op opsinegenen in Hydra vulgaris. De studie presenteert een bio-informatica-pipeline die kan worden toegepast op diverse organismen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Genexpressieanalyse
- Moleculaire evolutie
- Bio-informatica
Achtergrond
- Onderzoekt kandidaatgenen die relevant zijn voor lichtdetectie en de evolutie van het oog
- Maakt gebruik van de zoetwaterongewervelde Hydra vulgaris
- Maakt gebruik van NCBI-bronnen voor het ophalen van sequentiegegevens
Gebruikte methoden
- Bio-informatica pijplijn voor RNA-sequencing
- Hydra vulgaris als biologisch systeem
- Tools zoals BLAST, MEGA en edgeR voor analyse
Belangrijkste resultaten
- Geïdentificeerde opsine-genen die evolueerden via lineage-specifieke duplicaties bij Cnidaria
- Vond differentiële expressie van 1.774 transcripten in verschillende lichaamsdelen
- Genereerde een maximum-likelihood fylogenetische boom van opsine-sequenties
Conclusies
- Het protocol benadrukt het potentieel van kandidaatgenen voor toekomstige functionele studies
- Verbreedt ons begrip van genevolutie en expressie in relatie tot de sensorische biologie
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze bio-informatica-pipeline maakt systematisch onderzoek naar de evolutie en expressie van genfamilies mogelijk, wat targetvalidatie ondersteunt door middel van mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Door fylogenetische analyse te integreren met RNA-seq-kwantificatie, biedt het voorspellende betrouwbaarheid bij het prioriteren van kandidaatgenen met geconserveerde of divergente functies over verschillende soorten heen. De aanpak helpt bij de triage van de portfolio door mechanistisch onderbouwde hypothesen te identificeren voordat er middelen worden toegewezen aan functionele studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door gen-orthologie en evolutionaire relaties binnen doelwitfamilies te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van doelwitten mogelijk via vergelijkende expressieprofilering over diverse weefsels en ontwikkelingsstadia.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen door genen met lineage-specifieke expansies en weefselverrijkte expressiepatronen te highlighten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde genensets voor op downstream screening door familieleden te bevestigen via sequentie-uitlijning en boomtopologie.
- Operationele waarde: Genereert gestandaardiseerde telmatrices uit RNA-seq-gegevens, wat reproduceerbare kwantitatieve resultaten mogelijk maakt voor de gereedheid van de assay.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende organismen door consistente BLAST-, uitlijnings- en fylogenetische workflows toe te passen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt expressiegegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen door geconserveerde expressiepatronen in relevante weefsels te identificeren.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers via differentiële expressieanalyse tussen verschillende condities, zoals het hypostome deel tegenover de lichaamskolom in Hydra.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door expressiedynamiek tijdens regeneratie- en knopvormingsstadia te onthullen, wat duidt op functionele relevantie.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitidentificatie tot lead-optimalisatie, waardoor een hypothesegedreven voortgang van sequentieanalyse naar functionele prioritering mogelijk wordt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door fylogenieën te genereren die duplicatiegebeurtenissen en selectiedrukken op genfamilies van belang onthullen.
- Screening: Levert assay-klare biologische systemen via genormaliseerde expressiematrices die een vergelijking van genactiviteit tussen verschillende monsters mogelijk maken.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen via edgeR-gebaseerde differentiële expressie, waardoor statistische vergelijking van condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door genen te identificeren met geconserveerde rollen in sensorische systemen over metazoën heen.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare bioinformatische capaciteit voor het onderzoeken van elke genfamilie, waardoor redundante ontwikkeling van pipelines over projecten heen wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door mechanistische ambiguïteit te verminderen via evolutionaire en expressiecontext.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedocumenteerde, stapsgewijze bio-informatische procedures die toepasbaar zijn voor verschillende teams.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken voordat er wordt geïnvesteerd in wet-lab-validatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door genen met een sterke evolutionaire conservering en weefselspecifieke inductie te accentueren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in bio-informatica, inclusief command-line tools, sequentiedatabases en fylogenetische software.
- Is afhankelijk van toegang tot computationele infrastructuur voor het verwerken van grote RNA-seq datasets en het uitvoeren van BLAST-, MEGA- en edgeR-analyses.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams met betrekking tot bestandsnaamgeving, versies van referentiegenomen en parameterinstellingen voor alignment en het bouwen van bomen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van de pipeline op niet-modelorganismen met onvolledige genomen of annotaties.
- Wordt beperkt door de kwaliteit en volledigheid van de inputgegevens, waaronder de RNA-seq diepte en de nauwkeurigheid van de annotatie van het referentiegenoom.
