Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9
10 september 2020
CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.
Dit protocol is belangrijk omdat het gedetailleerde instructies biedt over het voorbereiden en injecteren van muggenembryo's voor CRISPR-Cas9 genoombewerking. De belangrijkste voordelen van deze micro-injectietechniek zijn dat het een hoge overlevingskans van muggen heeft, en het onderzoekers in staat stelt de functie van een gen te bepalen. Dit protocol is specifiek aangepast voor het injecteren van muggen die behoren tot het geslacht van Culex.
Deze muggen verspreiden verschillende ziekteverwekkers, waaronder de virussen die West-Nijl-koorts en St. Louis-encefalitis veroorzaken, evenals filariasis-nematoden, die hondenhartworm en olifantiasis veroorzaken. Daarom zullen tools zoals CRISPR-Cas9 genoombewerking ons in staat stellen om deze belangrijke ziektefactoren beter te begrijpen en te beheersen. Het injecteren van vers gelegde insectenembryo's en het behalen van een hogere overlevingskans kost veel tijd, oefening en geduld.
Daarom raden we aan om verschillende embryo's te injecteren met een gekleurde zoutoplossing voordat dure materialen worden geïnjecteerd om een mutatie te genereren. Begin met het terugvullen van de injectienaalden met de injectiemix. Kies een naaldvuller of gel-laadtip die gemakkelijk in het achtereinde van de geselecteerde injectienaald past.
Zorg ervoor dat er een beetje ruimte is tussen het uiteinde van de naaldvuller en de injectienaald. Aspirant nauwkeurig een kleine druppel van de injectiemix in de injectienaald in de buurt van de plek waar deze begint te taps toelopen. Bevestig vervolgens de injectienaald aan de micro-injector.
Plaats de dia met de embryo's op de tafel van de microscoop. Gebruik een startinjectiedruk van ongeveer 30 Psi om de naald te openen en pas deze zo nodig aan om een passend volume injectiemix te leveren. Positioneer de naald onder een dissectiemicroscoop boven het muggenembryo en gebruik de micromanipulator voorzichtig om de naald op het embryo te laten zakken.
Zodra de naald het embryo amper raakt, beweeg het embryo snel loodrecht op de lange as van de naald. Om te bepalen of de naald succesvol is geopend, druk op de injectieknop en kijk of er bubbels of injectiemix uit de naald ontsnapt. Als dat niet het geval is, herhaal het verplaatsen van het muggenembryo tegen de naald tot het open is en de injectiemix ontsnapt wanneer de trekker wordt ingedrukt.
Plaats het eerste muggenembryo in het middelpunt van het gezichtsveld, zorg ervoor dat het scherp staat en plaats de naald boven het eerste ei. Vergroot geleidelijk de vergroting van de microscoop, waarbij de naald voorzichtig wordt verlaagd om deze net boven het eerste embryo te houden. Ga door totdat de microscoop zijn hoogste vergroting heeft bereikt en zowel het embryo als de naald scherp staan.
Beweeg het embryo iets naar links en laat de naald zakken zodat deze zich in hetzelfde gezichtsvlak als het embryo bevindt. Gebruik het microscoopplatform om het embryo voorzichtig aan het uiteinde van de naald te laten raken. Het smalle achterste uiteinde van het muggenembryo zou iets moeten buigen.
Gebruik het microscoopplatform om het achterste uiteinde van het embryo op de naald te verplaatsen en observeer de naald die het chorion van het muggenei penetreert. De naald moet net de membraan doorboren en de geschatte locatie van de poolcellen binnen het embryo. Het plaatsen van de injectiemix in dit gebied verhoogt de kans dat mutaties zullen optreden en worden geërfd in de geslachtslijn.
Trek één tot drie keer aan de injectieknop om injectiemix in het embryo te schieten. Lever een kleine hoeveelheid injectiemix, net genoeg zodat een kleine opklaring in het embryoplasma kan worden waargenomen. Gebruik het platform om het embryo naar rechts te verplaatsen, weg van het uiteinde van de naald.
Als de injectie goed is verlopen, mag er weinig tot geen vloeistof uit het embryo lekken. Verplaats het platform zodat het volgende embryo voor de naald staat. En herhaal de injectie.
Als de injectiemix er niet uit lijkt te komen, of als er een grote hoeveelheid vloeistof uit het embryo ontsnapt nadat de naald is verwijderd, vervang de injectienaald en begin opnieuw. Vernietig alle ongeïnjecteerde of beschadigde eieren. Nadat alle embryo's op de dia zijn geïnjecteerd, was de Halocarbon-olie weg door omgekeerde osmosewater met een spuitfles aan te brengen.
Richt de stroom water op de bovenkant van de glazen deksel boven de geïnjecteerde embryo's en laat het water over het deksel stromen, zorg ervoor dat de stroom niet op de embryo's wordt gericht. Bedek de dia met 150 microliter water en plaats deze op nat filterpapier in een vierkante petrischaal. Incubeer de petrischaal in een omgevingskamer, ingesteld op 25 tot 27 graden Celsius en 70 tot 80% relatieve vochtigheid met een lange daglichtduur.
Dit protocol werd met succes gebruikt om embryo's van de Noordelijke huismug, Culex pipiens te injecteren, waardoor de voorste punt van het muggenembryo zich uitstrekt tot voorbij de strook medische dressing, waardoor de overleving van larven aanzienlijk toeneemt en resulteert in hoogwaardige nakomelingen die zich kunnen ontwikkelen tot volwassenen en zich kunnen voortplanten. Sequencing onthulde dat ongeveer 10%van de geteste muggen een kleine invoeging of verwijdering vertoonde nabij de Cas9-snijplaats van de eerste gids-RNA, wat suggereert dat de poolcellen met succes zijn aangewezen tijdens micro-injecties. De F1-individuen zijn succesvol gepaard en hebben levensvatbare nakomelingen voortgebracht, waarvan sommige ook de mutatie bevatten.
Wanneer insectenembryo's micro-geïnjecteerd worden, worstelen de meeste mensen met het aanvankelijk openen van de naald en het verplaatsen van het embryo op de naald. Onthoud dat het ontwikkelen van deze vaardigheden tijd en oefening kost. Dit protocol kan worden aangepast of aangepast om de embryo's van andere muggen of zelfs andere insectensoorten te injecteren.
Behalve het gebruik van dit protocol om genen uit te schakelen met gerichte CRISPR-Cas9 genoombewerking, kunnen dezelfde technie
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het gebruik van CRISPR/Cas9-genoomredigering om knock-outlijnen te creëren van Culex pipiens, een muggensoort die verschillende pathogenen overdraagt. Het beschrijft in detail de preparatie en injectie van muggenembryo's, waarbij hoge overlevingspercentages worden gewaarborgd en de analyse van genfuncties wordt gefaciliteerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- CRISPR/Cas9 genoomredigering
- Vectorbestrijding en ziektepreventie
- Insectenembryologie
Achtergrond
- Culex pipiens is een belangrijke vector voor verschillende ziekten.
- De identificatie van genfuncties is cruciaal voor het begrijpen van de transmissie van pathogenen.
- Micro-injectietechnieken verhogen de efficiëntie van genetische modificaties.
Gebruikte methoden
- Micro-injectie van muggenembryo's
- Culex pipiens als biologisch model
- CRISPR/Cas9-systeem voor gerichte genoommodificatie
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle injectie resulteerde in ongeveer 10% van de gescreende muggen die de beoogde mutaties vertoonden.
- Er werden hoge overlevingspercentages van de larven behaald, wat leidde tot levensvatbare nakomelingen.
- Mutaties werden via de kiembaan overgeërfd in F1-individuen.
Conclusies
- Deze studie demonstreert de haalbaarheid van het gebruik van CRISPR/Cas9 voor genfunctiestudies in Culex pipiens.
- Het protocol heeft aanzienlijke implicaties voor vectorbestrijdingsstrategieën bij ziektebeheer.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
CRISPR/Cas9-gemedieerde genbewerking in ziektevectormuggen maakt targetvalidatie en functionele genomica mogelijk voor studies naar pathogeenoverdracht. Dit protocol ondersteunt mechanistische risicoreductie door kiembaantransmissie van mutaties vast te stellen in Culex pipiens, een belangrijke vector voor het West-Nijlvirus en filariale nematoden. De aanpak biedt een schaalbaar platform voor fenotypische screening en leadidentificatie in onderzoek naar vectorbestrijding.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfuncties in muggenvectoren mogelijk om targets die betrokken zijn bij pathogeenoverdracht te valideren.
- Operationele waarde: Behaalt een mutatiegraad van ongeveer 10% in gescreende embryo's, wat efficiënte workflows voor targetvalidatie ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Kiembaantransmissie van mutaties in F1-nakomelingen bevestigt on-target activiteit en erfelijkheid voor fenotypische beoordeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Micro-injectie van Cas9/gRNA-complexen in embryo's genereert site-directed mutaties voor functionele screening.
- Operationele waarde: Hoge overlevingspercentages van embryo's na injectie maken schaalbare screening van geïnjecteerde cohorten mogelijk.
- Klaarheid voor analyse: Het protocol omvat naaldpreparatie, uitlijning van embryo's en injectieparameters om reproduceerbaarheid tussen runs te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: De gegenereerde mutantlijnen maken het mogelijk om de rol van genen in de vectorcompetentie voor pathogenen zoals het West-Nijlvirus en filariële nematoden te bestuderen.
- Mechanistische risicoreductie: In de kiembaan overgeërfde mutaties ondersteunen longitudinale fenotypische analyse over meerdere generaties.
- Ziekte-relevant systeem: Het Culex pipiens-model maakt evaluatie mogelijk van genetische targets die relevant zijn voor vectorbestrijdingsstrategieën.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door targetvalidatie, fenotypische screening en mechanistische follow-up mogelijk te maken in insectenvectoren van ziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing via gene knockout om rollen in transmissiepaden van pathogenen te verduidelijken.
- Screening: Genereert kwantitatieve mutatie-readouts (bijv. indel-frequentie) om de gRNA-effectiviteit en editing-efficiëntie te vergelijken.
- Analytics: Sequencing van F0- en F1-individuen levert meetbare outputs voor het beoordelen van de editing-precisie en kiemlijntransmissie.
- Translational Research: Mutante lijnen faciliteren de preklinische evaluatie van genfuncties bij vectorcompetentie en interactie met pathogenen.
- Enterprise Reuse: De gestandaardiseerde micro-injectieworkflow kan worden aangepast voor verschillende muggensoorten en insectmodellen voor hergebruik van het platform.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij doelwitvalidatie via kiemlijn-overdraagbare mutaties en fenotypische screening.
- Operationele waarde: Hoge overlevingspercentages en reproduceerbare injectieparameters verhogen de doorvoer en verminderen verspilling van middelen.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk over de prioritering van doelwitten door genfunctie te koppelen aan vectorcompetentie.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten voor vectorbestrijding op basis van gevalideerde mechanistische inzichten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muggenembryologie, micro-injectietechnieken en de bereiding van CRISPR/Cas9-reagentia.
- Afhankelijk van het micro-injectieapparaat, de microscopie-opstelling en omgevingscontroles voor de incubatie van embryo's.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor de hantering van embryo's, de injectiedruk en de naaldvoorbereiding om consistentie te waarborgen.
- Aanpassing aan andere muggensoorten kan optimalisatie van het tijdstip van embryo-collectie en de injectieparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van technische vaardigheden voor het openen van de naald en de uitlijning van het embryo, wat van invloed is op de succespercentages van de injectie.
