Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. Een van de belangrijkste voordelen van deze microchips is de keuze van fabricagematerialen, waardoor de chips compatibel zijn voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ bij kamertemperatuur. De on-chip kristallisatie-experimenten vereisen kleine volumes van het eiwitmonster, waardoor de totale kosten van het werken met deze hoogwaardige macromoleculen worden verminderd.

On-chip kristallisatie elimineert ook het handmatig oogsten van de fragiele eiwitkristallen, vaak toegepast in combinatie met cryokoeling tijdens conventionele kristallografie-experimenten. Bovendien gebruiken onze microchips microdialyse voor eiwitkristallisatie, een op diffusie gebaseerde methode die gericht is op het equilibreren van de precipitantconcentratie via een semi-permeabel membraan, om de cromulente concentratie voor eiwitkristallisatie te benaderen en nauwkeurige en omkeerbare controle over de kristallisatieomstandigheden mogelijk te maken. Microdialyse in combinatie met temperatuurregeling kan worden gebruikt om nucleatie van kristalgroei los te koppelen voor het onderzoeken van fasediagrammen, door de precipitantconcentratie te veranderen terwijl hetzelfde eiwitmonster wordt gebruikt.

Bereid eerst 50 gram PDMS siliconenbasis en het is uithardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 massa. Meng de twee ingrediënten in een bekerglas met een spatel. Plaats het mengsel na het mengen in een vacuümkamer om alle luchtbellen te verwijderen.

Doe 25 gram van het voorgemengde PDMS in de eerste SU8 om de patronen van het microfluïdische kanaal en de pilaren onder de knie te krijgen, tot een hoogte van ongeveer vijf millimeter. Giet vervolgens de resterende 25 gram van het PDMS in de tweede SU8-master, die alleen de patronen van de pilaren bevat. Hard de twee PDMS-lagen een uur uit in een oven van 338 kelvin.

Snijd de uitgeharde PDMS-lagen rond de patronen van de SU8-meesters met een scalpel en pel de PDMS-mallen voorzichtig af van de siliconenmasters. Plaats de PDMS-mal, met zowel de kanalen als de pilaren, op een stijve microscoopglasschuif met de patronen naar boven gericht. Snijd een klein stukje geregenereerd cellulosedialysemembraan om de centrale pijler van de PDMS-mal te bedekken, die is ontworpen om de eiwitkamer te zijn.

De moleculaire gewichtsafsnijding van het dialysemembraan wordt dienovereenkomstig gekozen op het molecuulgewicht van het eiwitmonster en de precipitanten van de kristallisatieoplossing. Scheid vervolgens voorzichtig het droge stuk van het geregenereerde cellulosedialysemembraan. Snijd een klein stukje van het gescheiden dialysemembraan.

De grootte van dit stuk membraan hangt af van het ontwerp van de chip. En in het bijzonder hangt het af van de afmetingen van de centrale pijler. Deponeer het stuk van het dialysemembraan op de centrale pijler van de PDMS-mal, die wordt ondersteund op de glazen glijbaan, met zijn pilaar en kanalen naar boven gericht.

Plaats vervolgens de tweede PDMS-mal met alleen de pilaren naar beneden gericht, bovenop de PDMS-mal die al op de glazen schuif wordt ondersteund. Lijn alle pilaren van de twee PDMS-mallen uit. Het stuk van het geregenereerde cellulosedialysemembraan is ingeklemd tussen de twee centrale pijlers van de PDMS-mallen.

Deze stap van de fabricageprocedure kan worden uitgevoerd onder een optische microscoop of gewoon door de uitlijning van alle pilaren visueel zorgvuldig te inspecteren. Plaats de montage in een vacuümkamer en droog gedurende 30 minuten om de gevangen luchtbellen in de PDMS-mallen te verwijderen en om het inbrengen van de fotocurable NOA-hars te verbeteren, die in de volgende stap van dit protocol zal worden beschreven. Verwijder de montage uit de vacuümkamer en vul de lege ruimte tussen de twee PDMS-mallen met de fotocurable hars op basis van thiolin, NOA 81, door capillaire imbibition.

Breng de hars aan op drie van de vier zijden van de montage. Plaats de montage in een kruis-linker en hard de NOA-hars uit door acht seconden bloot te stellen aan UV-licht, met behulp van een gebotste UV-lamp van 35 milliwatt per vierkante centimeter. Snijd een 175 micrometer dik PMMA-stuk in de standaardafmetingen van een microscoopglasschuif en verwijder de plastic bescherming van elke kant van het PMMA-stuk.

Zodra de eerste UV-belichting is voltooid, verwijdert u de bovenste PDMS-mal met een gedeeltelijk gekruiste NOA-hars erop geplakt uit de onderste PDMS-mal en de glazen glijbaan. Druk zachtjes op de montage van de bovenste PDMS-mal en de gedeeltelijk uitgeharde NOA-hars op het PMMA-stuk. Plaats de nieuwe montage in de cross-linker en hard de NOA-hars opnieuw uit door 60 seconden aan UV-licht te worden blootgesteld.

Verwijder voorzichtig de bovenste PDMS-mal. De dialysechip gemaakt van de volledig cross-link NOA-hars die een geregenereerd cellulosedialysemembraan insluit en wordt ondersteund op een PMMA-stuk is klaar. Verlijm in de handel verkrijgde connectoren op de inlaat- en uitlaatpunten van het microfluïdische kanaal met snelle epoxylijm.

Kies voor de vloeistofbehandeling de diameter van de PTFE-buizen op basis van de grootte van de connectoren. De buizen worden gebruikt voor de introductie van de kristallisatieoplossing in het vloeistofkanaal van de dialysechip. Pipetteer handmatig een druppel van het eiwitmonster in het eiwitreservoir direct op het dialysemembraan.

Het volume van de eiwitdruppel hangt af van het ontwerp van de microchip die wordt gebruikt. En specifiek hangt het af van het volume van de centrale pilaar en het kan 0,1 of 0,3 microliter zijn. Breng voorzichtig een dun laagje hoogvacuüm siliconenvet aan rondom het eiwitreservoir.

Snijd een klein stukje PMMA en plaats het voorzichtig boven de dunne laag van het siliconenvet. Snijd een stuk Kapton-tape, groot genoeg om het PMMA-stuk boven het eiwitreservoir te bedekken en om aan alle randen op de NOA-chip te plakken. Het eiwitmonster wordt ingekapseld in het reservoir en de chip kan worden gebruikt voor kristallisatie-experimenten.

Bereid eerst ongeveer 500 microliter van de kristallisatieoplossing door de juiste volumes van de buffer en de precipitante oplossingen te mengen. Injecteer de kristallisatieoplossing in het punt van de dialysechip door de vloeistofconnectoren, handmatig met de spuit of met een geautomatiseerd drukaangedreven systeem. Zodra het vloeistofkanaal is gevuld met de kristallisatieoplossing en er geen lucht in is opgesloten, sluit u de inlaat- en uitlaatpoorten van de chip af met Parafilm-tape.

Pipetteer het juiste volume van de eiwitoplossing in het eiwitreservoir en inkapsuleer het eiwitmonster zoals reeds beschreven. De eiwitkristalgroei kan worden gevisualiseerd en opgenomen met een digitale camera. Voor de fabricage van de dialysemicrochips hebben we gekozen voor optisch transparante en biologisch inerte materialen, wat een hoge compatibiliteit aantoont voor in situ röntgendiffractie-experimenten.

Het achtergrondgeluid dat wordt gegenereerd door de materialen waaruit het eiwitcompartiment van de chip bestaat, dat zich in het directe pad van de röntgenstraal bevindt, is geëvalueerd. Het eiwitcompartiment bestaat uit het geregenereerde cellulosedialysemembraan, de Kapton-tape en twee PMMA-lagen, één gebruikt als substraat van de microchips en één gebruikt voor de inkapseling van het eiwitmonster. In deze afbeelding wordt het achtergrondgeluid geïllustreerd dat wordt gegenereerd door de Kapton-tape, het geregenereerde cellulosedialysemembraan, de PMMA-laag en hun assemblage.

Hoewel de fotocurable hars NOA het hoofdlichaam van de microchips omvat, is niet opgenomen in deze metingen omdat het geen deel uitmaakt van de eiwitkamer. Diffuse ringen toegeschreven aan de interacties van röntgenstralen met de materialen zijn te zien voor de Kapton-tape bij de resolutie lager dan vier angstroms, de PMMA tussen vier en acht angstroms en het dialysemembraan tussen vier en vijf angstroms. Het totale achtergrondgeluid dat door de chip wordt gegenereerd, wordt voornamelijk waargenomen bij de resolutie lager dan zes angstrom, wat aangeeft dat de behandeling van diffractiegegevens met hoge resolutie van lysozyme niet wordt beïnvloed.

De microchips werden voor de röntgenstraal gemonteerd met een 3D-geprinte ondersteuning die we hebben ontworpen voor in situ röntgendiffractie-experimenten en het kan tot drie chips tegelijkertijd bevatten. Experimenten werden uitgevoerd om de efficiëntie van de microchips voor on-chip kristallisatie van modeloplosbare eiwitten met de microdialysemethode te evalueren. lysozymkristallen werden gekweekt met 293 kelvin in twee verschillende omstandigheden.

De eerste kristallisatieconditie bevatte 1,5 molair natriumchloride en 0,1 molair natriumacetaat. De tweede kristallisatievoorwaarde bevatte één molair natriumchloride, 0,1 molair natriumacetaat en 30% polyethyleenglycol 400, en werd gekozen om de compatibiliteit van de microchips en de microdialysemethode aan te tonen, met precipitanten met een hoog moleculair gewicht en viskeuze oplossingen. De kristallisatie-experimenten werden uitgevoerd onder statische omstandigheden.

Zodra lysozymkristallen op de microchip werden gekweekt, werden ze gebruikt voor in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. De microchips werden met behulp van de 3D-geprinte ondersteuning aan de balklijn gemonteerd en complete röntgendiffractiegegevenssets werden verzameld uit twee lysozymkristallen. Na behandeling van de röntgendiffractiegegevens werd de elektronendichtheidskaart van een enkel lysozymekristal verkregen bij een resolutie van 1,95 angstrom, zoals weergegeven in figuur A.Figuur B toont de elektronendichtheidskaart verkregen bij een resolutie van 1,85 angstroms.

Na het samenvoegen van twee datasets verkregen uit twee verschillende lysozymkristallen, tonen beide elektrodichtheidskaarten gedetailleerde structurele informatie die kan worden verkregen door in situ röntgendiffractie-experimenten die rechtstreeks op de dialysemicrochips bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, van enkele of meerdere eiwitkristallen. We demonstreerden de fabricageprocedure voor microfluïdische apparaten die zijn ontworpen voor on-chip eiwitkristallisatie met de microdialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. We gebruikten fabricagematerialen met een hoge röntgentransparantie, compatibel voor in situ eiwitkristallografie.

De diffractiegegevensverzameling wordt geautomatiseerd met behulp van een 3D-geprinte ondersteuning voor de chips, die direct in macromoleculaire kristallografiestraallijnen kan worden gemonteerd. De veelzijdigheid van deze microchip komt voort uit het gebruik van microdialyse om kristallisatieomstandigheden omkeerbaar te regelen en fasediagrammen in kaart te brengen met behulp van een klein eiwitvolume. De prototyping van het apparaat is eenvoudig, waardoor de fabricage van maximaal 30 microchips op één dag in een schone kamer mogelijk is, met relatief goedkope materialen.

We verwachten dat deze kenmerken van de chips kunnen worden gebruikt voor seriële röntgenkristallografiestudies van meer uitdagende eiwitdoelen.