Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Biologische weefsels groeien in driedimensionale zachte omgevingen waardoor cellen worden blootgesteld aan verschillende mechanische signalen. Onze methode maakt het mogelijk om hydrogels driedimensionaal te strekken voor het onderzoeken van biomechanische reacties. Deze techniek maakt het mogelijk om hydrogels uniform te strekken langs hun dikte terwijl live beeldvorming wordt uitgevoerd.

Bovendien kan de geometrie van het hydrogel naar elke grootte of vorm worden gemanipuleerd. Kennis over hoe cellen en extracellulaire matrix reageren op krachten is belangrijk om te onthullen hoe weefsels zich ontwikkelen en hoe ziekten zich ontwikkelen. Dit kan leiden tot de potentiële ontwikkeling van kankertherapieën en weefsel engineering modellen.

Begin door een laser of een handmatige snijder te gebruiken om een rubberen strip met een gat in het midden te maken. Snijd een rechthoek van hydrofobe film zodat deze breder is dan de siliconen strips en spoel een plastic schaal met 70% ethanol. Na het drogen met pluisvrije doekjes, plaats de afdichtingsfilm in de schaal en plaats één siliconen strip met de plastic folie van één kant verwijderd in het midden van elk stuk afdichtingsfolie.

Voor fibrine gel vorming, breng uniform 2,5 microliters koud gelabeld fibrinogeen aan in de siliconen uitsnede van elke strip zodat de volledige omtrek van elke uitsnede in contact komt met fibrinogeen, zorg ervoor dat er geen luchtzakken of bubbels ontstaan in de oplossingen. Voeg onmiddellijk 2,5 microliters gekoelde trombine toe aan elke fibrinogeen oplossing en meng de oplossingen snel met voorzichtig pipetteren, beweeg de punt rond de hele mix om een zo homogeen mogelijke oplossing te creëren. Na het mengen, plaats de beklede schaal in de incubator gedurende 30 minuten voor gelpolymerisatie.

Aan het einde van de incubatie, voeg voldoende PBS toe aan de schaal om de gel-silicone constructen onder te dompelen en til elk monster voorzichtig uit de schaal, zorg ervoor dat de afdichtingsfilmlaag aan de strip blijft hechten. Trek langzaam vanaf het ene uiteinde van de siliconen naar het andere, los voorzichtig de afdichtingsfolie van elk stuk siliconen, plaats de strip terug in de schaal en plaats de schaal op de tafel van een lichtmicroscoop om de toestand van het monster te beoordelen. Om het monster op het rekapparaat te laden, vul de badkuip met PBS en plaats de siliconen strip met het monstergel over de bovenkant van het bad zodat de uiteinden van de strip aan elke kant van het bad zitten.

Plaats de klemmen en stoffen strips en draai ze vast zodat alle stukken verbonden zijn om een rechte strip te vormen met de uitsparing in het midden. Plaats het materiaal op de put en bevestig een dekglas op de bodem van de put, plaats vervolgens een aluminium vloeibare put in het rekapparaat. Vul de put met een tot twee milliliter PBS celmedium en plaats de constructie van het stoffen fabricagegel in het apparaat.

Klem de stoffen strip in de beugel zodat de uitsparing van het gel in het midden zit voordat u voorzichtig de pin down-inzet in het apparaat plaatst en vastzet. Plaats en vergrendel andere stoffen zijde in de spindel en plaats het rekapparaat en het bevestigde monster op de tafel van een confocale microscoop. Gebruik een USB-kabel om de microcontroller met de computer te verbinden en sluit de servomotor aan op de microcontroller.

Open vervolgens het besturingsmodule van het rekapparaat op de computer om het monster te beeldvormen. Om te bepalen of het monster voldoende is voor een experiment, gebruik live beeldvorming met lage resolutie om het hele gel te scannen en bepaal de laagste Z-positie waarop volledige hechting aan de binnenwanden van de uitsparing duidelijk is zonder scheuren of bubbels. Na het noteren van de Z-locatie van de microscoop, scan de interface van de fluorescente label van het gel en de siliconen strip om de volledige hechting van het gel aan het siliconen over de hele omtrek te bepalen.

Na het scannen, verplaats de tafel in de Z-richting totdat er geen continuïteit meer is in het gel en noteer de bovengrens van de Z-positie. Trek vervolgens de bovengrens van de Z-richting af van de ondergrens om de monsterdikte te berekenen. Om de voorrekpositie van het monster te bepalen, klik op Ga naar Zero Servo POS in de modulesoftware om ervoor te zorgen dat de servomotor op zijn nulpositie staat en bevestig de servomotor aan het rekapparaat, zorg ervoor dat er geen spanning op het monster wordt uitgeoefend.

Tijdens het beeldvormen, klik op de plus één knop om de motor één graad per keer in de wijzerzin te bewegen. Wanneer de rechterkant van de uitsparing beweegt, klik op de min één knop om het monster terug te draaien naar de voorlaatste positie om het monster onder minimale spanning te houden. Klik op Set Min Servo Position om de referentiepositie in te stellen en vang een 40-voudige vergroting, hoge resolutie, enkele Z-slice tegelafbeelding van het hele gelgebied als een baseline referentie voor de post-processing analyse.

Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, laat de servomotor één graad per seconde doorlopen totdat de gewenste rekmaat is bereikt. Voor elke rekmaat waarvoor een analyse gewenst is, controleer of het gel op geen enkel punt rond de omtrek van de siliconen is losgelaten door de interface tussen het gel en de siliconen te scannen, vang vervolgens een hoge resolutie tegel Z-stack afbeeldingsset van het hele gelgebied voor post-processing analyse. Door in te zoomen en handmatig kralenaggregaten te volgen tijdens gelrek, kunt u de lokale gelspanningen in de axiale en loodrechte richting berekenen.

Typisch propageren de axiale strengen relatief lineair vanaf de siliconen uitsparingrand tot het midden van het gel en zijn groter dan de compressieve loodrechte spanningen. Hier worden hoge vergroting afbeeldingen van een typische ongerekt en relatief isotroop hydrogel, en een waterstof onder hoge 80% uitsparing spanning die sterk uitgelijnde vezels in de rekkrichting tonen, getoond. Analyse van de vezelheroriëntatie onthulde een ongeveer lineaire afhankelijkheid tussen de vezelausslinning en de externe spanning op de uitsparing tot spanningen van 40% met matige verzadiging bij spanningen boven 40% Zoals geïllustreerd in deze vezelausslinningsanalyse, neemt de vezelausslinning toe naarmate de externe spanning op de uitsparing