Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

Neutrofielen zijn belangrijke inflammatoire cellen die wonden infiltreren als reactie op lokaal geproduceerde chemische liganden. Dit protocol maakt visualisatie van receptordynamiek mogelijk in reactie op dergelijke liganden in vivo. Het gebruik van chemokine-receptorreporters zou kunnen worden uitgebreid naar andere fysiologische situaties, zoals infectie- en tumormodellen en naar andere immuuncellen.

De methode maakt het mogelijk om te volgen wanneer en waar in het weefsel leukocyten chemische aantrekkingsmoleculen detecteren. Dit kan een beter begrip mogelijk maken van hoe immuunresponsen zich ontvouwen en oplossen. Het uitvoeren van een wond in de ventrale vin bij zebravislarven vereist fijne manipulatie van de larven, dus enige oefening is vereist op larven die niet voor experimentele doeleinden zijn bedoeld.

Op dag 2,5 tot 3,5 na de bevruchting, plaats de verdoofde zebravislarven onder een fluorescerend dissectiemicroscoop en selecteer larven met transgene receptorexpressie. Breng de geselecteerde larven over naar een 120 millimeter Petri-schaal met E3-medium aangevuld met Tricaine en gebruik een steriele scalpel om de ventrale vin van elke larve diep genoeg te snijden om substantiële neutrofielenrekrutering te veroorzaken zonder de caudale hematopoietische weefselselven te snijden. Voeg 500 microliter 2X Tricaine toe aan een glazen bodemschaal, voeg vervolgens 500 microliter agarose-oplossing toe en meng door voorzichtig te roeren met de pipettip.

Gebruik een pipet om de gewonde verdoofde zebravislarven over te brengen naar de schaal en oriënteer de embryo lateraal terwijl je voorzichtig naar beneden drukt zodat het caudale deel van de vis zo dicht mogelijk bij de glazen bodem komt. Wanneer het embryo in positie is, laat de agarose afkoelen. Na vijf tot 10 minuten, raak het gel voorzichtig aan met een kleine penseel om de stollingsbevestiging te controleren en voeg twee milliliter E3-medium toe dat is aangevuld met 0,2 milligram per milliliter Tricaine aan de plaat.

Beeld de wondplaats af met behulp van een spinning disk confocale microscoop. Zo snel mogelijk, nadat de agarose is uitgehard, breng de embryo over naar het spinning disk platform voor confocale beeldvorming en gebruik de stagestuurknuppel en microscoopobjectief om de vis te lokaliseren. Gebruik het 30 tot 40X objectief, focus op het wondgebied en selecteer het veld om het beeld rond de wond te maken.

Selecteer de laser en pas de belichtingstijd aan, stel vervolgens een timelapse in van elke 30 seconden voor de gewenste duur en verkrijg een Brightfield-beeld om het gezichtsveld te documenteren. Om neutrofielenreceptorinternalisatie op de wondplaats te kwantificeren, open de beeldgegevenssets in Fiji en gebruik de tijdschuifregelaar om een representatieve tijdsperiode van belang te selecteren voor elke dataset. In MATLAB, maak een nieuw script en voeg functies toe voor beeldlezen, openen en handmatige selectie van de interessepunten.

Voer het script uit om het frame van belang te openen en klik op de neutrofielen voor analyse. Neem een schatting van hun centroiden op, zowel in de ventrale vinwond als in het caudale hematopoietische weefsel. Segmenteer de neutrofielen in elk frame met behulp van de actieve contourentechniek en maak het script om de berekening van de grijstintenco-occurentiematrix voor elke neutrofiel toe te voegen, inclusief de berekening van het contrast van de neutrofielen op basis van de grijstintenco-occurentiematrix.

Voeg opdrachten toe om de waarden afzonderlijk op te slaan voor individuele neutrofielen in de ventrale vin, inclusief de berekening van de gemiddelde neutrofielencontrastwaarde van alle caudale hematopoietische weefselneutrofielen. Voeg de normalisatie van de contrastwaarde van individuele neutrofielen op de wondplaats toe aan de berekende gemiddelde contrast van de caudale hematopoietische weefselneutrofielen om een genormaliseerd contrast te verkrijgen dat weerspiegelt hoe stipjesachtig het uiterlijk van een receptor is binnen individuele reagerende cellen in vergelijking met de controle niet-reagerende cellen. Klik vervolgens op uitvoeren om het script uit te voeren.

Wonding van de ventrale vin gaat gepaard met snelle neutrofielenmobilisatie uit het caudale hematopoietische weefsel naar de ventrale vin en clustering aan de wondmarge binnen 30 tot 60 minuten na wondinductie. In deze analyse werden de chemokine-receptoren CXCR1 en CXCR2, die worden geëxpresseerd door zebravisneutrofielen, afgebeeld met behulp van spinning disk confocale microscopie. Het patroon van receptordistributie werd gekwantificeerd met behulp van de contrastmetriek, die verschillen in intensiteit tussen buurpixels rapporteert.

Een alternatieve methode is om de verhouding van receptorniveaus ten opzichte van de niveaus van een gecontroleerde membraanmarker te kwantificeren. Door de contrastmetriek te gebruiken om receptorinternalisatie in neutrofielenclusters bij de wond te detecteren, kunnen zichtbare verschillen tussen CXCR1- en CXCR2-verkeer in neutrofielen bij de wondplaats worden gekwantificeerd. In deze analyse bijvoorbeeld, nam fluorescent gelabelde CXCR1-internalisatie in cellen op de wondplaats toe in de loop van de tijd, terwijl fluorescent gelabelde CXCR2 op de membranen van neutrofielen bij de wond bleef.

Remming van CXCR1- en CXCR2-liganden door middel van morpholino-behandeling resulteert in differentiële fluorescent gelabelde CXCR1-internalisatie op de wondplaats. Bovendien is fluorescent gelabelde CXCR1 in vroege embryo's duidelijk geïnternaliseerd in embryo's waarin de receptorliganden co-geëxpresseerd worden. Houd bij het uitvoeren van dit protocol in gedachten dat de beeldvorming zo snel mogelijk na wonding dient te worden uitgevoerd om receptordynamiek tijdens neutrofielenrekrutering naar wonden vast te leggen.

Na de beeldvorming van chemokine-receptoren in normale larven, kunnen onderzoekers vergelijkende beeldvorming uitvoeren bij mutante larven met gedereguleerde ontsteking.