Name: Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties met behulp van spinning disk confocale microscopie. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van receptorinternalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Christine Holt en Bill Harris voor hun hulp bij confocale microscopie. We bedanken Darren Gilmour voor de fluorescerende timer backbone constructs en Anna Huttenlocher voor de Tol2-Lyz backbone vector. We bedanken Steve Renshaw voor de Tg(mpx:GFP)i114 lijn. Dit werk werd ondersteund door de MRC (MR/L019523/1), de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] en een Isaac Newton Trust grant 19.23(n). C.C. werd ondersteund door een MRC DTP-studentschap en gedeeltelijk door de Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie. H.W. werd ondersteund door een MRC DTP Studentship. H.P. werd ondersteund door een Wellcome Trust PhD beurs (105391/Z/14/Z) en deels door een Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subsidie en de MRC (MR/L019523/1).

<ol><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li>
<li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).</li>
<li>Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnon%2C+TI+%22Science%22">Science</a>. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li>
<li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387(2015).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Donà, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li>
<li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+dynamics+of+an+endogenous%2C+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li>
<li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+receptor+internalization%2C+signaling+level%2C+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).</li>
<li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , Elsevier. Burlington. (2004).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li>
<li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Textural+features+for+image+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+infection%3A+From+pathogenesis+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).</li>
<li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li>
<li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Zebrafish+and+CRISPR%2FCas9%3A+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling

De beschreven methode maakt live beeldvorming mogelijk van receptordynamiek in reactie op endogene liganden in situ tijdens een ontstekingsreactie op weefselschade. Het gebruik van Cxcr1/Cxcr2 neutrofielenreporters kan worden uitgebreid naar andere fysiologische instellingen, zoals infectie, tumormodellen of andere soorten weefselschade 14,25,26,27. Bovendien kunnen transgene reddingslijnen, waarbij de endogene receptor wordt onderdrukt en gered door een exogene mutante receptor, nuttige hulpmiddelen bieden om het belang van specifieke neutrofiele migratiepatronen in immuunresponsen te ontleden. Cxcr1-receptormutanten die de desensibilisatie hebben aangetast, veroorzaken bijvoorbeeld meer prominente neutrofielenclustering op ontstekingsplaatsen14. Deze toename van functiefenotype kan worden gebruikt om de rol van neutrofiele congregatie in verschillende fysiologische processen te begrijpen, bijvoorbeeld wondherstel, infectieziekte of tumorevolutie, en receptor knockdown / knock-out experimenten aan te vullen. De methodologie biedt ook een basis om het bereik van beschikbare verslaggevers uit te breiden. De keuze van de fluorescerende verslaggever is belangrijk om te overwegen en hangt af van de biologische vraag. We vonden dat de constitutieve omzet van deze chemokinereceptoren in neutrofielen hoog was, in vergelijking met epitheelcellen, en dat verslaggevers met snelle rijping (bijv. sfGFP) membraanniveaus bij steady state moesten rapporteren en verschillen moesten oplossen bij neutrofiele stimulatie 8,14. Membraanverhoudingen van sfGFP / tagRFP zijn dus niet van toepassing voor het meten van ligand-geïnduceerde internalisatie in dit celtype, maar het patroon van tagRFP maakt het mogelijk om de intracellulaire lotgevallen van de receptor te volgen, wat nuttig zou kunnen zijn in sommige studies. We ontdekten ook dat het meer geconcentreerde intracellulaire signaal van tagRFP nuttig is voor het screenen van individuele larven. Een alternatieve benadering voor het meten van receptorniveaus bij het plasmamembraan zou zijn om een fluorescerende membraanmarker in neutrofielen co-express te brengen in hetzelfde transgen9 of in een onafhankelijk transgen14. In het eerste scenario zou het transgen een extra middel bieden voor het screenen van de vissen en zouden de expressieniveaus vergelijkbaar zijn tussen de marker en de receptor. De laatste aanpak zou meer modulair zijn, in die zin dat een zebravislijn met een receptorverslaggever kan worden gecombineerd met verschillende reporterlijnen. In beide gevallen is het vermeldenswaard dat membraankwantificering van de receptorniveaus een uitdaging is bij geclusterde neutrofielen (zie hieronder). Ten slotte merken we op dat een mogelijke uitbreiding van dit protocol zou zijn om de live beeldvorming door immunohistochemie op te volgen voor meer gedetailleerde lokalisatieanalyses.
Het Tol2-transgenesesysteem is goed ingeburgerd7 en de lysozym C-promotor is uitgebreid gebruikt voor neutrofiele expressie11,15. De transgenesebenadering is daarom relatief eenvoudig en het expressieniveau dat met deze promotor wordt bereikt, is hoog genoeg om voldoende contrast te bieden voor analyse van receptordynamiek. Een mogelijke beperking is dat het expressieniveau de endogene receptorexpressieniveaus niet samenvat. Nieuwe CRISPR-technologieën kunnen worden ingezet om knock-in-lijnen vast te stellen voor receptoren van bijzonder belang28. Deze technologieën zijn nog steeds omslachtig en garanderen mogelijk niet de vereiste expressieniveaus voor subcellulaire beeldvorming, maar hun succesvolle ontwikkeling zou een belangrijke doorbraak zijn voor het begrijpen van endogene signaleringsdynamiek. Functionele validaties zijn belangrijk voor het interpreteren van gegevens met transgene receptorconstructen. Ligandherkenningstests kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vast te stellen dat het fluorescerende fusie-eiwit functioneel is en redding van knock-outfenotypen kan worden gebruikt om vast te stellen dat de transgene neutrofiele expressieniveaus compatibel zijn met functionaliteit14. Ten slotte zou een meer directe manier om de receptorfusie te valideren zijn om een in vitro functionele test te gebruiken met gelabelde receptor naast niet-gelabelde versies14.
De kwantificeringsbenadering richt zich op specifieke problemen bij nauwkeurige membraansegmentatie bij neutrofielen in vivo. In cellen van epitheliale aard kan kwantificering van receptorniveaus automatisch worden uitgevoerd door membraanreceptorniveaus te normaliseren tot een controlemarker, die in tandem of afzonderlijk kan worden uitgedrukt9. Inderdaad, we hebben een dergelijke benadering toegepast bij het gebruik van de ligand-herkenningstest in gastrulatende embryo's14. Neutrofielen ondergaan echter complexe, snelle veranderingen in celvorm in vivo, waardoor de membraansegmentatie zowel in 2D als 3D14 moeilijk wordt. Dit is nog uitdagender wanneer neutrofielen clusteren, wat in veel fysiologische omgevingen voorkomt29. De contrastmetriek overwint deze beperking omdat het geen membraansegmentatie vereist, maar in plaats daarvan de algehele toestand van receptorverdeling in de cel weerspiegelt (vliezig / glad versus vesiculair / dotty). Het is belangrijk op te merken dat de contrastmetriek kan worden beïnvloed door het algehele contrast van het beeld, dus normalisatie van individuele celwaarden naar een interne referentie is vereist om rekening te houden met de variabiliteit van het signaal in verschillende embryo's / monsters. We gebruikten bijvoorbeeld de gemiddelde celcontrastwaarde van niet-responsieve neutrofielen in de CHT (d.w.z. neutrofielen die stationair blijven en niet migreren naar de ventrale vin)14. Een extra mogelijkheid zou zijn om te normaliseren met contrastwaarden van een controlemarker in dezelfde cel. Dit zou een oplossing bieden wanneer een interne referentie van niet-reagerende cellen niet beschikbaar is en kan waarschijnlijk fijnere kwantitatieve verschillen in receptordynamiek tussen verschillende omstandigheden oplossen.
De locatie van beeldvorming is een andere variabele om te overwegen. De reden om hier de ventrale vinwond te kiezen, in tegenstelling tot het meer algemeen gebruikte staartvin wondmodel16,30, is omdat de plaats van verwonding in de buurt ligt van de plaats van neutrofiele woonplaats / migratie-oorsprong. Dit versnelt de tijdlijn van de test, omdat het relatief weinig tijd kost voordat neutrofielen arriveren. Bovendien biedt het de mogelijkheid om celgedrag vast te leggen, zowel bij de migratieoorsprong (CHT) als bij de doellocatie van belang (wond). Dit is hier relevant, omdat de ruimtelijke en temporele resolutie die nodig is voor subcellulaire beeldvorming moeilijk te combineren is met een groot gezichtsveld of multi-positie scannen. De ventrale vin wondtest maakt het dus mogelijk om de evolutie van de migratierespons van de migratieoorsprong te volgen en gelijktijdige vangst van niet-specifieke receptorfluctuaties in cellen die niet reageren. Zoals hierboven vermeld, is dit laatste nuttig voor kwantificeringsdoeleinden omdat het een interne referentie biedt voor niet-specifieke dynamiek. In andere systemen is het mogelijk dat een dergelijke interne referentie niet mogelijk is, in welk geval de contrastwaarden van een co-uitgedrukte membraanmarker een alternatieve regeling zouden bieden.
Samenvattend verwachten we dat de methodologie toepasbaar is op andere systemen en voor verschillende doeleinden kan worden ingezet. Dezelfde verslaggevers kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in andere inflammatoire omgevingen, zoals infectie-instellingen of andere ziektemodellen. Het repertoire van zebravisreceptor reporterlijnen kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren, om signaleringsmechanismen te begrijpen of liganddynamica in vivo te rapporteren. De aanpak kan worden gecombineerd met knockdown/knockout technieken om de mechanistische basis van de waargenomen dynamiek te ondervragen. Verstoring van ligandexpressie kan bijvoorbeeld wijzen op de ligandafhankelijkheid voor waargenomen receptordynamiek. In de toekomst voorzien we dat het systeem verder verfijnd kan worden om knock-in insertie van verslaggevers op te nemen. Uiteindelijk zouden bevindingen met behulp van deze methodologie nieuwe inzichten opleveren die waardevol zijn buiten de zebravisgemeenschap, gezien het behoud van deze signaalreceptoren bij zoogdieren en de relatieve uitdaging om deze studies in grotere organismen uit te voeren.

Leukocytenmigratie is van het grootste belang voor immuunresponsen. Immuuncellen zijn prototypische migrerende cellen, die opmerkelijk goed in staat zijn om weefsels en bloedvaten te doorkruisen en een reeks chemische geleidingssignalen te detecteren om richtingsgewijs naar microben of andere gastheercellen van belang te migreren. Correcte begeleiding is afhankelijk van de herkenning van chemoattractanten, waaronder chemokines de meest prominente categorie1 vertegenwoordigen. Chemokines worden herkend door zeer specifieke zeven-transmembraan G-eiwit gekoppelde receptoren. Na chemokinebinding veranderen chemokinereceptoren de conformatie, wat leidt tot de activering van geassocieerde trimerische G-eiwitten en hun dissociatie in functionele signaalsubeenheden die cytoskeletale veranderingen en gerichte migratie bevorderen1. Ten tweede worden chemokinereceptoren gefosforyleerd en deze modificatie leidt tot desensibilisatie voor lokstof, die kan worden gevolgd door snelle hersensibilisatie / recycling of intracellulaire afbraak en downregulatie van het celoppervlak2. Deze receptordynamiek beïnvloedt de duur en dosis signalering die door de cellen wordt ontvangen, maar hoe ze het migratiegedrag van leukocyten beïnvloeden, is in vivo moeilijk op te helderen.
Het volgen van receptordynamiek in levende leukocyten in traditionele zoogdiersystemen staat voor verschillende uitdagingen. Voor levend onderzoek moeten receptorfusies met fluorescerende eiwitten in de cellen tot expressie worden gebracht. Dit is een uitdaging in primaire leukocyten, met name bij neutrofielen, en studies tot nu toe hebben surrogaat neutrofiele cellijnen gebruikt om chemokinereceptoren tot expressie te brengen 3,4. Het genereren van transgene muismodellen, waarbij leukocyten een fluorescerende receptor of mutante receptoren tot expressie brengen met informatieve smokkeldefecten 5,6, brengt een aanzienlijke investering van tijd en middelen met zich mee. Zelfs in deze gevallen kunnen de beeldvormingsresolutie en het contrast voor beeldvormingsreceptordynamiek in het levende dier beperkt zijn en studies hebben immunohistochemie gebruikt op secties5 van vast weefsel. Gezien deze technische uitdagingen is ons begrip van hoe de dynamiek van chemoattractante receptoren het celgedrag in een levende weefselomgeving beïnvloedt momenteel beperkt.
Hier bieden we een methodologie om receptorhandel in zebravis neutrofielen te monitoren. Zebravissen zijn genetisch handelbaar, net als muizen, maar transgenese is relatief eenvoudiger door het gebruik van efficiënte transposonsystemen en directe zygote-manipulatie7. De transparante larve is idealiter vatbaar voor beeldvorming. De chemokinereceptordynamiek is gevisualiseerd in primordiale geslachtscellen en het laterale lijn primordium door expressie van overeenkomstige fusies met fluorescerende reporters 8,9,10. Zebravislarven zijn uitgerust met volwassen neutrofielen die sterk geconserveerde genetische en cellulaire eigenschappen hebben ten opzichte van neutrofielen van zoogdieren. Subcellulaire signaaldynamica zoals cytoskeletale dynamica en polariteitsregulatoren zijn in deze cellen gevisualiseerd door het genereren van overeenkomstige transgene lijnen 11,12,13. Onlangs hebben we de chemokinereceptordynamiek bij neutrofielen gevisualiseerd en functioneel geanalyseerd in de loop van ontstekingsreacties op weefselschade14. Hier beschrijven we het genereren van transgene reporterlijnen voor chemokine-signalering bij neutrofielen, voorbereiding van embryo's voor live beeldvorming, een wondtest voor het bestuderen van neutrofielensignalering en het protocol voor het verkrijgen en analyseren van beelden. We bieden ook een zijprotocol om chemokinereceptorresponsen op kandidaat-liganden te testen, wat nuttig is bij het vaststellen van ligandherkenningspatronen in niet-gekarakteriseerde receptoren. Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met verdere genetische manipulaties, zoals remming van endogene chemokine-expressie of generatie van mutante receptoren met veranderde ligand-geïnduceerde handel, om te onderzoeken hoe specifieke signaaldynamiek het gedrag van leukocyten in vivo beïnvloedt. De transgene lijnen die fluorescerend gelabelde chemokinereceptoren tot expressie brengen, kunnen ook worden gebruikt als verslaggevers voor endogene chemokinegradiënten, die anders moeilijk te detecteren zijn door directe antilichaamkleuring. De beschreven methodologie biedt ruimte om het genereren van reporters uit te breiden naar andere immunosignalerende receptoren.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Leukocytengeleiding door chemische gradiënten is essentieel voor immuunresponsen. Neutrofielen zijn de eerste cellen die worden gerekruteerd op plaatsen van weefselbeschadiging waar ze cruciale antimicrobiële functies uitvoeren. Hun handel naar deze loci wordt georkestreerd door verschillende inflammatoire chemoattractanten, waaronder chemokines. Op moleculair niveau wordt chemoattractant signalering gereguleerd door de intracellulaire handel van de overeenkomstige receptoren. Het blijft echter onduidelijk hoe subcellulaire veranderingen in chemokinereceptoren de migratiedynamiek van leukocyten op cel- en weefselniveau beïnvloeden. Hier beschrijven we een methodologie voor live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemokinereceptordynamica bij neutrofielen tijdens ontstekingsreacties op weefselschade. Deze hulpmiddelen hebben aangetoond dat differentiële chemokinereceptorhandel in zebravisneutrofielen neutrofielenclustering en verspreiding op plaatsen van weefselbeschadiging coördineert. Dit heeft implicaties voor ons begrip van hoe ontstekingsreacties zichzelf oplossen. De beschreven hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om neutrofiele migratiepatronen in verschillende fysiologische en pathologische omgevingen te begrijpen en de methodologie kan worden uitgebreid naar andere signaalreceptoren.

Ventrale vinwonden worden gevolgd door snelle neutrofielenmobilisatie van de CHT in de ventrale vin en clustering aan de wondrand, binnen 30-60 minuten (figuur 1). We visualiseerden de verdeling van twee chemokinereceptoren, Cxcr1 en Cxcr2, die worden uitgedrukt door zebravisneutrofielen24 en Cxcl8a en Cxcl8b14 herkennen, met behulp van confocale microscopie van draaiende schijven. We genereerden twee overeenkomstige transgene lijnen, Tg(lyz:Cxcr1-FT) en Tg(lyz:Cxcr2-FT), waarin neutrofielen een fluorescerende timer (FT) constructie van de receptor tot expressie brengen, d.w.z. een fusie met een tandem van sfGFP en tagRFP (figuur 2 en referentie14). Het gebruik van de twee fluoroforen was bedoeld om monitoring van een breed scala aan receptoren mogelijk te maken en schattingen te geven van de eiwitomzettijd bij het plasmamembraan, omdat nieuw gesynthetiseerde receptoren in groen fluoresceren en geleidelijk rood worden naarmate zeouder worden,14. Deze receptoren bleken echter een snelle constitutieve omzet te hebben bij het neutrofiele plasmamembraan en dat de verblijftijd korter was dan de rijpingstijd van tagRFP, waarbij sfGFP membraanlokalisatie toonde en tagRFP vesiculaire lokalisatie bij steady state (aanvullende video 1 en ref14). Daarom hebben we ons gericht op de distributie van sfGFP om ligand-geïnduceerde internalisatie op plaatsen van weefselschade te controleren. Het patroon van receptorverdeling werd gekwantificeerd met behulp van de contrastmetriek, die verschillen in intensiteit tussen naburige pixels rapporteert. De redenering is dat wanneer de receptorverdeling vliezig en glad is, de contrastwaarde laag is. Wanneer de receptorverdeling vesiculair en punctaat is, is de contrastwaarde hoog (figuur 3).
Een alternatieve methode is het kwantificeren van de verhouding van receptorniveaus (sfGFP-intensiteit) over de niveaus van een controlemembraanmarker, bijvoorbeeld membraan CFP (mCFP) (figuur 3). Beide methoden kunnen receptorinternalisatie detecteren, zoals aangegeven door een meer vesiculaire receptorverdelingspatroon wereldwijd in de cel (hogere contrastwaarde) of lagere receptorniveaus op het membraan (lagere sfGFP / mCFP-verhouding). De contrastmetriek kon echter ook receptorinternalisatie detecteren in neutrofielenclusters aan de wond, waarbij membraansegmentatie minder nauwkeurig en niet toepasbaar was (figuur 3). Met behulp van deze statistiek konden we zichtbare verschillen kwantificeren tussen Cxcr1 en Cxcr2-handel in neutrofielen bij wonden (figuur 4 en aanvullende video 2). Cxcr1-FT geïnternaliseerd in cellen in de wond, terwijl Cxcr2-FT vliezig bleef bij neutrofielen in de wond (figuur 4A-C, aanvullende video 2 en aanvullende video 3). Onderdrukking van Cxcl8a en Cxcl8b, door morfolinobehandeling, beïnvloedde differentieel Cxcr1-FT internalisatie bij wonden (figuur 4C,D). Om verder te valideren dat Cxcr1-FT reageert op Cxcl8a, voerden we chemokineresponstests uit in vroege embryo's. We vonden dat Cxcr1-FT duidelijk geïnternaliseerd was in embryo's waarin Cxcl8a mede tot expressie kwam (figuur 5). Al met al geven deze resultaten aan dat de beschreven methoden kunnen worden ingezet om chemokine-geïnduceerde receptorinternalisatie bij neutrofielen te meten en de identiteit vast te stellen van het ligand dat deze effecten bemiddelt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figuur 1: Neutrofiele migratie naar ventrale vinwonden. (A) (Links) Cartoon van 3 dpf larve toont de locatie van het caudale hematopoietische weefsel (CHT), de venuscirculatie (VC, blauw), de ventrale vin (VF) en de wondplaats. (Rechts) Cartoon met het gebied van de wond (W) met neutrofielen die worden gemobiliseerd uit de CHT en clustering bij de wond. De caudale ader plexus (CVP) van het CHT-weefsel is blauw getekend. (B) Helder veldbeeld (links) en confocale projectie (rechts) met de ventrale vinwond en de verdeling van neutrofielen in Tg(mpx:GFP)-larven 2 uur na de verwonding. Stippellijnen tonen VF- en CHT-contouren. Schaalbalk = 25 μm. Cartoon en fluorescerend beeld gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figuur 2: Live beeldvorming van de handel in chemokinereceptoren bij neutrofielen. (A) Constructen gebruikt voor neutrofiel-specifieke transgene expressie van Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) en Cxcr2-FT. Confocale projecties van neutrofielen in het hoofd van een 3 dpf transgene larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), boven; Tg(lyz:Cxcr2-FT), onder) met tRFP (magenta) en sfGFP (groen) kanalen. Schaalbalk = 20 μm. (B) Anatomisch schema van 3 dpf larve zoals in figuur 1A. Onder de larve zijn schema's die het gebied van de wond (W) weergeven met neutrofielen die worden gemobiliseerd van de CHT (boven) of die chemotaxis uitvoeren bij het binnengaan van de ventrale vin (onder). Onderbroken vierkant geeft het gebied aan dat is afgebeeld in snapshots aan de rechterkant. (C) Neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) larven (sfGFP wordt getoond) bij mobilisatie van de CHT (bovenste panelen) of chemotaxis naar de wond (onderste panelen). Pijlen tonen dezelfde cellen in de loop van de tijd. Tijdpunten op de rechterafbeelding zijn minuten verstreken na afbeelding aan de linkerkant. Schaalbalk = 10 μm. (D) Schematische weergave van experimentele benadering voor live beeldvorming van chemokinereceptorhandel. Panelen A-C gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figuur 3: Kwantificeringsvoorbeelden van receptordynamica. Enkele (blauwe) of geclusterde neutrofielen (groen) bij wonden of niet-gemobiliseerde neutrofielen in de CHT (rood, oranje) werden gesegmenteerd en geanalyseerd met verschillende methoden om de resultaten te vergelijken. Dezelfde getoonde voorbeeldcellen werden geanalyseerd met twee methoden om wat er in de afbeelding te zien is te relateren aan het bereik van de geëxtraheerde waarden. (A) Het oppervlak van de geselecteerde voorbeeldcellen is gesegmenteerd op basis van de contourdefinitie in het sfGFP-kanaal. (B) Contrast werd berekend op basis van de voorbeeldcellen in A. (C) Het membraan van de geselecteerde, voorbeeldcellen werd gesegmenteerd op basis van contourdefinitie in het CFP-kanaal. Ratiometrische analyse van sfGFP/CFP volgde. (D) De verhouding sfGFP/CFP werd berekend op de voorbeeldcellen in C. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. van individuele cellen, in gevallen van n>1 werden de waarden hier niet gebruikt voor statistische analyse, maar slechts om metingen te illustreren die met de verschillende kwantificeringsmethoden zijn verkregen. Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figuur 4: Differentiële dynamica van Cxcr1 en Cxcr2 als reactie op verwonding. (A) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) of Tg(lyz:Cxcr2-FT) larven bij de wond 80 min na de verwonding (sfGFP-kanaal getoond). Schaalbalk = 10 μm.  (B) Vergrote Cxcr1-FT neutrofiel (links) en Cxcr2-FT (rechts) bij de wond. Groene receptor wordt weergegeven in grijs. Schaalbalk = 5 μm. (C) Genormaliseerd contrast (contrast per individuele neutrofiel genormaliseerd tot het gemiddelde contrast van niet-gemobiliseerde cellen in de CHT). cxcl8a verwijst naar injectie van een splice-blocking samen met een translatie-blokkerende morpholino voor cxcl8a. cxcl8b verwijst naar injectie met een splice-blocking morpholino voor cxcl8b. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellen (CHT), n=47 cellen (wond) van 8 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr1-FT) met morfolines: n=28 cellen (Cxcl8a-MO) van 5 larven, n=16 cellen (Cxcl8b-MO) van 5 larven. Voor Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellen (CHT) en n=20 cellen (wond) van 3 larven. Gegevens werden samengevoegd van onafhankelijke larven verkregen in 1-5 beeldvormingssessies. Kruskal-Wallis test met Dunn's meerdere vergelijkingstest voor Tg (lyz: Cxcr1-FT), tweezijdige ongepaarde Mann-Whitney-test voor Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Confocale projectie van neutrofielen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgene larven behandeld met cxcl8a morpholino (MO) (links) en cxcl8b MO (rechts) die reageren op vinwonden (sfGFP-kanaal weergegeven in groen). Snapshot genomen op tijdstippen van equivalente neutrofielenaccumulatie (85 min na verwonding in linkerbeeld en 45 min na verwonding in rechterbeeld). Schaalbalk = 10 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figuur 5: Chemokine respons assay in vroege embryo's. Laserscanning van confocale plakjes gastruleren embryo's die expressie en distributie van Cxcr1-FT vertonen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA werd geïnjecteerd in eieren in één celstadium met of zonder 150 pg Cxcl8a mRNA. Groene en rode receptoren worden in afzonderlijke kanalen weergegeven. Controlemembraan CFP marker (mCFP) wordt weergegeven in het cyaan kanaal. Schaalbalk = 20 μm. Figuur gewijzigd van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende film 1: Transgene neutrofielen in het hoofd van een Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) larve bij 3 dpf. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 5 fps. Schaalbalk = 20 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende film 2: Neutrofielen bij Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) en Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgene larven die reageren op vinwonden. De film begint binnen 10 minuten na het verwonden en duurt 60 min. sfGFP (groen), tagRFP (magenta). Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 10 fps. CHT = caudaal hematopoietisch weefsel. VF = ventrale vin. Schaalbalk = 25 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende film 3. Aanvullende voorbeelden van neutrofielen van een gewonde Tg(lyz:Cxcr1- FT) transgene larve (andere larve dan die getoond in Video 2), verkregen met een hogere resolutie, met receptorinternalisatie (sfGFP-kanaal weergegeven in groen) bij mobilisatie in de CHT of bij binnenkomst en chemotaxis in de ventrale vin. Frame-interval is 30 sec en framesnelheid is 2 fps. Schaalbalk = 10 μm. Video is afkomstig van ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier beschrijven we protocollen voor het uitvoeren van live beeldvorming en kwantitatieve analyse van chemoattractante receptordynamiek bij zebravisneufielen

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

Neutrofielen zijn belangrijke inflammatoire cellen die wonden infiltreren als reactie op lokaal geproduceerde chemische liganden. Dit protocol maakt visualisatie van receptordynamiek mogelijk in reactie op dergelijke liganden in vivo. Het gebruik van chemokine-receptorreporters zou kunnen worden uitgebreid naar andere fysiologische situaties, zoals infectie- en tumormodellen en naar andere immuuncellen.De methode maakt het mogelijk om te volgen wanneer en waar in het weefsel leukocyten chemische aantrekkingsmoleculen detecteren. Dit kan een beter begrip mogelijk maken van hoe immuunresponsen zich ontvouwen en oplossen. Het uitvoeren van een wond in de ventrale vin bij zebravislarven vereist fijne manipulatie van de larven, dus enige oefening is vereist op larven die niet voor experimentele doeleinden zijn bedoeld.Op dag 2,5 tot 3,5 na de bevruchting, plaats de verdoofde zebravislarven onder een fluorescerend dissectiemicroscoop en selecteer larven met transgene receptorexpressie. Breng de geselecteerde larven over naar een 120 millimeter Petri-schaal met E3-medium aangevuld met Tricaine en gebruik een steriele scalpel om de ventrale vin van elke larve diep genoeg te snijden om substantiële neutrofielenrekrutering te veroorzaken zonder de caudale hematopoietische weefselselven te snijden. Voeg 500 microliter 2X Tricaine toe aan een glazen bodemschaal, voeg vervolgens 500 microliter agarose-oplossing toe en meng door voorzichtig te roeren met de pipettip.Gebruik een pipet om de gewonde verdoofde zebravislarven over te brengen naar de schaal en oriënteer de embryo lateraal terwijl je voorzichtig naar beneden drukt zodat het caudale deel van de vis zo dicht mogelijk bij de glazen bodem komt. Wanneer het embryo in positie is, laat de agarose afkoelen. Na vijf tot 10 minuten, raak het gel voorzichtig aan met een kleine penseel om de stollingsbevestiging te controleren en voeg twee milliliter E3-medium toe dat is aangevuld met 0,2 milligram per milliliter Tricaine aan de plaat.Beeld de wondplaats af met behulp van een spinning disk confocale microscoop. Zo snel mogelijk, nadat de agarose is uitgehard, breng de embryo over naar het spinning disk platform voor confocale beeldvorming en gebruik de stagestuurknuppel en microscoopobjectief om de vis te lokaliseren. Gebruik het 30 tot 40X objectief, focus op het wondgebied en selecteer het veld om het beeld rond de wond te maken.Selecteer de laser en pas de belichtingstijd aan, stel vervolgens een timelapse in van elke 30 seconden voor de gewenste duur en verkrijg een Brightfield-beeld om het gezichtsveld te documenteren. Om neutrofielenreceptorinternalisatie op de wondplaats te kwantificeren, open de beeldgegevenssets in Fiji en gebruik de tijdschuifregelaar om een representatieve tijdsperiode van belang te selecteren voor elke dataset. In MATLAB, maak een nieuw script en voeg functies toe voor beeldlezen, openen en handmatige selectie van de interessepunten.Voer het script uit om het frame van belang te openen en klik op de neutrofielen voor analyse. Neem een schatting van hun centroiden op, zowel in de ventrale vinwond als in het caudale hematopoietische weefsel. Segmenteer de neutrofielen in elk frame met behulp van de actieve contourentechniek en maak het script om de berekening van de grijstintenco-occurentiematrix voor elke neutrofiel toe te voegen, inclusief de berekening van het contrast van de neutrofielen op basis van de grijstintenco-occurentiematrix.Voeg opdrachten toe om de waarden afzonderlijk op te slaan voor individuele neutrofielen in de ventrale vin, inclusief de berekening van de gemiddelde neutrofielencontrastwaarde van alle caudale hematopoietische weefselneutrofielen. Voeg de normalisatie van de contrastwaarde van individuele neutrofielen op de wondplaats toe aan de berekende gemiddelde contrast van de caudale hematopoietische weefselneutrofielen om een genormaliseerd contrast te verkrijgen dat weerspiegelt hoe stipjesachtig het uiterlijk van een receptor is binnen individuele reagerende cellen in vergelijking met de controle niet-reagerende cellen. Klik vervolgens op uitvoeren om het script uit te voeren.Wonding van de ventrale vin gaat gepaard met snelle neutrofielenmobilisatie uit het caudale hematopoietische weefsel naar de ventrale vin en clustering aan de wondmarge binnen 30 tot 60 minuten na wondinductie. In deze analyse werden de chemokine-receptoren CXCR1 en CXCR2, die worden geëxpresseerd door zebravisneutrofielen, afgebeeld met behulp van spinning disk confocale microscopie. Het patroon van receptordistributie werd gekwantificeerd met behulp van de contrastmetriek, die verschillen in intensiteit tussen buurpixels rapporteert.Een alternatieve methode is om de verhouding van receptorniveaus ten opzichte van de niveaus van een gecontroleerde membraanmarker te kwantificeren. Door de contrastmetriek te gebruiken om receptorinternalisatie in neutrofielenclusters bij de wond te detecteren, kunnen zichtbare verschillen tussen CXCR1- en CXCR2-verkeer in neutrofielen bij de wondplaats worden gekwantificeerd. In deze analyse bijvoorbeeld, nam fluorescent gelabelde CXCR1-internalisatie in cellen op de wondplaats toe in de loop van de tijd, terwijl fluorescent gelabelde CXCR2 op de membranen van neutrofielen bij de wond bleef.Remming van CXCR1- en CXCR2-liganden door middel van morpholino-behandeling resulteert in differentiële fluorescent gelabelde CXCR1-internalisatie op de wondplaats. Bovendien is fluorescent gelabelde CXCR1 in vroege embryo's duidelijk geïnternaliseerd in embryo's waarin de receptorliganden co-geëxpresseerd worden. Houd bij het uitvoeren van dit protocol in gedachten dat de beeldvorming zo snel mogelijk na wonding dient te worden uitgevoerd om receptordynamiek tijdens neutrofielenrekrutering naar wonden vast te leggen.Na de beeldvorming van chemokine-receptoren in normale larven, kunnen onderzoekers vergelijkende beeldvorming uitvoeren bij mutante larven met gedereguleerde ontsteking.

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Hier beschrijven we een nieuwe, hoge-inhoud chemisch geinduceerde ontsteking test met het oog op de identificatie van immuun-modulerende bioactieve. We hebben met succes gecombineerd geautomatiseerde microscopie met op maat ontwikkelde software scripts voor directe kwantificering van de ontstekingsreactie en verdere verwerking van gegevens, analyse, mijnbouw, en opslag.

Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis

This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes' migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

The video demonstrates a zebrafish wounding and entrapment device technique for observing fluorescently labeled fungal pathogen infection in zebrafish larvae. Initial infection attracts macrophages, and as infection persists, neutrophil recruitment progresses at the injection site.

A zWEDGI Technique to Visualize Fungal Pathogen-Infected Zebrafish Larvae

Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Hier presenteren we een protocol voor de generatie en beeldvorming van een gelokaliseerde bacteriële infectie in het oticum van de zebravis.

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Leer live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties met behulp van spinning disk confocale microscopie. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van receptorinternalisatie mogelijk.

Live imaging van chemokinereceptoren bij zebravisneutrofielen tijdens wondreacties

Meer video's verkennen