Metabolische profilering om bactericide of bacteriostatische effecten van nieuwe natuurlijke producten te bepalen met behulp van isothermale microcalorimetrie

Inzicht in de werkingswijze van nieuwe antibacteriële verbindingen is een belangrijke maar moeilijke taak. Deze methode biedt inzicht in dergelijke mechanismen en is eenvoudig te implementeren. Deze techniek maakt een real-time observatie van antibacteriële effecten op een niet-invasieve manier mogelijk verdere monsteranalyse.

Hoewel oefenen met microbiologische technieken een voorwaarde is, is het experiment eenvoudig uit te voeren. Het nemen van de tijd met data-analyse is erg belangrijk bij het uitvoeren van microcalorimetrie voor de eerste keer. Begin met het gebruik van een spectrofotometer op een golflengte van 600 nanometer om de optische dichtheid van de nachtelijke cultuur te meten.

Verdun de cultuur tot een 5 keer 10 tot de 5e kolonie vormen eenheden per milliliter van verse MHB medium concentratie en voeg 150 microliter cellen aan elke 1,5 milliliter buis van antibioticum bij de concentratie van belang. Meng vervolgens de verbinding met de cellen door vortexing. Om de wisselplaten voor te bereiden, voeg 120 microliters van elke bacterie antibioticum mengsel in individuele plastic inserts in de juiste putten van een 48-well plaat en gebruik pincet om alle titanium flacons plaats in de houders.

Breng de inzetstukken voorzichtig over in de titanium flacons in de houderplaat en plaats losjes titanium deksels op alle flesjes. Wanneer alle wisselplaten zijn overgedragen, plaatst u de houder op het aangewezen gebied op het monsterstation en gebruikt u een koppelsleutel die is ingesteld op 40 centinewtonmeter om alle deksels aan te draaien. Start in de systeemsoftware een nieuw experiment en trek de invoegarm van het instrument in.

Plaats de bekerhouder op de brug met kolom acht naar de inbrengopening van het monster en duw de bekerhouder voorzichtig in het instrument op positie één. Wacht 10 minuten tot het systeem is gestabiliseerd voordat u de experimentele putten labelt. Duw vervolgens de inbrengarm van het monster totdat de bekerhouder op positie twee staat.

Nadat u het systeem gedurende 20 minuten hebt laten stabiliseren, duwt u de invoegarm van het monster op plaats drie en trekt u de invoegarm in totdat deze zich op de looppositie bevindt. Markeer alle putten in de software en selecteer reactiestart en voer het experiment uit totdat de warmte-emissie-reads stabiel terug zijn op nul. Selecteer aan het einde van de analyse de optie Stop.

De software zal dan vragen of u zeker bent. Selecteer ja en sla het experiment op voor gegevensanalyse. Steek vervolgens de invoegarm volledig in het instrument en schakel de magneten in om de bekerhouder op te halen.

Als u de gegevens wilt analyseren, opent u de software en selecteert u een geopend experiment. Selecteer in het pop-upvenster het interesse-experiment en klik op Openen. Klik op alles selecteren en definieer de basislijn om de gegevens in elke positie te normaliseren.

Selecteer in het pop-upvenster een periode van meer dan 30 minuten binnen de vertragingsfase. Na de selectie wordt de basislijn in het groen in het thermogram weergegeven. Sluit het sectievenster voor basislijn definiëren en klik op opslaan en sluit de software.

Open vervolgens de webgebaseerde SymCel-calorimetrieanalysetoepassing. Klik op Bladeren om het interessant bestand te uploaden en selecteer het experiment. De metabolische parameters worden automatisch berekend voor de 32 monsters.

Klik op groeifunctie om de warmtestroomgegevens aan Gompertz en/of Richards Growth-modellen aan te passen. Groeimodellen worden weergegeven in de cumulatieve sectie ter vergelijking met de ruwe gegevens in de stroomsectie. Als u de berekende parameters wilt downloaden, klikt u op downloadmaatjes, selecteert u de bestandslocatie en klikt u op Opslaan.

Het bestand wordt geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere analyse. Hier worden de thermogrammen weergegeven die worden verkregen door A.baumannii DSM-30008 bloot te stellen aan ciprofloxatine in seriële verdunning. Concentraties tussen 0,005 en 0,1 micromolar hebben een minimaal effect op de groei en stofwisseling van A.baumannii.

De behandeling van de cellen met 0,5 micromolar ciprofloxatine leidt echter tot een aanzienlijke verschuiving in de duur van de vertragingsfase en tot een lagere maximale warmtestroom. Deze twee veranderingen samen beïnvloeden de tijd tot piek, wat resulteert in een toename van ongeveer zes uur. In dit cijfer wordt de cumulatieve vrijgekomen warmte afgezet tegen de tijd met het effect van elke concentratie die wordt weerspiegeld door een hellingspunt.

Kwantificering van de thermogramhelling maakt de berekening mogelijk van de maximale stofwisseling van A.baumannii in aanwezigheid van ciprofloxatine met een gelijktijdige afname van de stofwisseling die wordt waargenomen in cellen die met 0,5 micromolar ciprofloxatine worden behandeld. Rifampicin behandeling heeft een dramatisch effect op de thermogrammen van A.baumannii DSM-30008. Een aanzienlijke vermindering van de warmte-emissie correleren met een afname van de metabole activiteit wordt ook waargenomen.

Let op de toename van de tijd om te pieken voor alle geteste concentraties en de daling van de stofwisseling veroorzaakt door de afname van de helling voor alle concentraties die meestal worden toegeschreven aan een bactericide effect. Om optimale resultaten te garanderen, gebruik maken van omgekeerde pipetting en voorkomen dat extra vloeistof aan de zijkanten van de insert bij het overbrengen van het monster, ook ervoor zorgen dat de deksels goed zijn gesloten.