Name: Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer histonen isoleren uit Sorghum-bladweefsel voor top-down massaspectrometrie-profiling van epigenetische markers. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van post-translatie modificaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Ronald Moore en Thomas Fillmore voor het helpen met massaspectrometrie-experimenten, en Matthew Monroe voor gegevensdepositie. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het Us Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research via het Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) project onder awardnummer DE-SC0014081, van het Amerikaanse Ministerie van Landbouw (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), en via het Joint BioEnergy Institute (JBEI), een faciliteit gesponsord door DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en DOE. Het onderzoek werd uitgevoerd met behulp van Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research.

<ol><li>Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+drought+stress%3A+Effects%2C+mechanisms+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Plant drought stress: Effects, mechanisms and management.</a> Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).</li>
<li>Dai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+under+global+warming%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Climate+Change%22%5BJournal%5D)">Drought under global warming: a review.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).</li>
<li>Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+sorghum+as+a+dedicated+bioenergy+feedstock%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%2C+Bioproducts+and+Biorefining%22%5BJournal%5D)">Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock.</a> Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).</li>
<li>Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorghum+bicolor+-+an+important+species+for+comparative+grass+genomics+and+a+source+of+beneficial+genes+for+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+delays+development+of+the+sorghum+root+microbiome+and+enriches+for+monoderm+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+succession+in+arbuscular+mycorrhizal+fungal+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities.</a> ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+community+assembly+in+drought-stressed+sorghum+shows+stochasticity%2C+selection%2C+and+universal+ecological+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics.</a> Nature Communications. 11 (1), (2020).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+modifications+in+plant+abiotic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of histone modifications.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li>
<li>Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+individual+histone+posttranslational+modifications+and+their+combinatorial+patterns+by+mass+spectrometry-based+proteomics+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).</li>
<li>Maile, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+quantification+of+histone+post-translational+modifications+by+a+hybrid+chemical+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).</li>
<li>Dang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+pilot+project+of+the+consortium+for+top-down+proteomics%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report.</a> Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).</li>
<li>Schaffer, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+proteoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry.</a> Proteomics. 19 (10), 1800361(2019).</li>
<li>Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative top-down proteomics.</a> Molecular Omics. , (2020).</li>
<li>Varoquaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+field-droughted+sorghum+from+seedling+to+maturity+reveals+biotic+and+metabolic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124(2019).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+histone+post-translational+modifications+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopPIC%3A+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Ocford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>LeDuc, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-Score%3A+a+bayesian+framework+to+sharply+improve+proteoform+scoring+in+high-throughput+top+down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).</li>
<li>Fornelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+top-down+analysis+of+the+human+proteome+using+a+benchtop+quadrupole-orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).</li>
<li>Sun, R. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTop+1.0%3A+A+high-accuracy+and+high-efficiency+search+engine+for+intact+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification.</a> Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).</li>
<li>Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+protein+identification+using+isotopic+envelope+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting.</a> Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASH+Suite+Pro%3A+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+mass+spectrometry+of+histone+modifications+in+sorghum+reveals+potential+epigenetic+markers+for+drought+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation.</a> Methods. , San Diego, Calif. (2019).</li>
<li>Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+combinatorial+modification+of+histone+H3+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells.</a> Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unabridged+analysis+of+human+histone+H3+by+differential+top-down+mass+spectrometry+reveals+hypermethylated+proteoforms+from+MMSET%2FNSD2+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+quantitative+top-+and+middle-down+analysis+of+GluC-digested+histone+H4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).</li>
<li>Tian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+top-down+characterization+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), (2012).</li>
<li>Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+separation+using+high-pH+and+low-pH+reversed+phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).</li>
<li>Gargano, A. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+separation+capacity+of+intact+histone+proteoforms+chromatography+coupling+online+weak+cation+exchange-HILIC+to+reversed+phase+LC+UVPD-HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).</li>
</ol>

Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe histonen uit sorghumbladmonsters (of meer in het algemeen plantenblad) kunnen worden geëxtraheerd. De gemiddelde histonopbrengst zal naar verwachting 2-20 μg per 4-5 g sorghumbladmateriaal zijn. De materialen zijn voldoende zuiver voor de downstream histonanalyse door LC-MS (meestal histonen met ~20% ribosomale eiwitbesmetting). Een lager rendement kan worden verkregen als gevolg van monstervariaties of mogelijke verkeerde behandeling/fouten in het hele protocol. Het handhaven v...

De toenemende ernst en frequentie van de droogte zal naar verwachting van invloed zijn op de productiviteit van graangewassen1,2. Sorghum is een graanvoedsel - en energiegewas dat bekend staat om zijn uitzonderlijke vermogen om waterbeperkende omstandigheden te weerstaan3,4. We streven naar mechanistisch begrip van het samenspel tussen droogtestress, plantenontwikkeling en epigenetica van sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planten. Ons vorige werk heeft sterke verbindingen aangetoond tussen het microbioom van planten en rhizosfeer bij droogte acclimatisatie en reacties op moleculair niveau5,6,7. Dit onderzoek zal de weg vrijmaken voor het gebruik van epigenetische engineering bij het aanpassen van gewassen aan toekomstige klimaatscenario's. Als onderdeel van de inspanningen om epigenetica te begrijpen, streven we ernaar eiwitmarkers te bestuderen die de genexpressie in het plantenorganisme beïnvloeden.
Histonen behoren tot een sterk geconserveerde familie van eiwitten in eukaryoten die DNA in nucleosomen verpakken als fundamentele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen zijn dynamisch gereguleerd om de chromatinestructuur te beheersen en de genexpressie te beïnvloeden. Net als andere epigenetische factoren, waaronder DNA-methylatie, spelen histon-PTM's een belangrijke rol in veel biologische processen8,9. Op antilichamen gebaseerde tests zoals westerse vlekken zijn veel gebruikt om histon-PTM's te identificeren en te kwantificeren. Bovendien kan de interactie van histon-PTM's en DNA effectief worden onderzocht door Chromatine-immunoprecipitatie – sequencing (ChIP-seq)10. In ChIP-seq wordt chromatine met specifieke gerichte histon PTM verrijkt met antilichamen tegen die specifieke PTM. Vervolgens kunnen de DNA-fragmenten uit het verrijkte chromatine worden vrijgegeven en worden gesequentieerd. Regio's van genen die interageren met de beoogde histon PTM worden onthuld. Al deze experimenten zijn echter sterk afhankelijk van antilichamen van hoge kwaliteit. Voor sommige histonvarianten/homologen of combinaties van PTM's kan de ontwikkeling van robuuste antilichamen zeer uitdagend zijn (vooral voor meerdere PTM's). Bovendien kunnen antilichamen alleen worden ontwikkeld als de beoogde histon PTM bekend is. 11 Daarom zijn alternatieve methoden nodig voor ongetargette, globale profilering van histon-PTM's.
Massaspectrometrie (MS) is een aanvullende methode om histon-PTM 's te karakteriseren, met inbegrip van onbekende PTM 's waarvoor geen antilichamen beschikbaar zijn11,12. De gevestigde "bottom-up" MS-workflow maakt gebruik van proteasen om eiwitten te verteren tot kleine peptiden voorafgaand aan vloeistofchromatografie (LC) scheiding en MS-detectie. Omdat histonen grote aantallen basisresten (lysine en arginine) hebben, snijdt de trypsinevertering (protease specifiek voor lysine en arginine) in de standaard bottom-up workflow de eiwitten in zeer korte peptiden. De korte peptiden zijn technisch moeilijk te analyseren door standaard LC-MS, en behouden niet de informatie over de connectiviteit en stoichiometrie van meerdere PTMs. Het gebruik van andere enzymen of chemische etikettering om lysines te blokkeren genereert langere peptiden die meer geschikt zijn voor karakterisering van histone PTMs13,14.
Als alternatief kan de spijsverteringsstap volledig worden weggelaten. In deze "top-down" benadering worden intacte eiwitionen in de MS geïntroduceerd door elektrospray ionisatie (ESI) na online LC-scheiding, wat ionen oplevert van de intacte histon proteoformen. Bovendien kunnen ionen (d.w.z. proteoformen) van belang worden geïsoleerd en gefragmenteerd in de massaspectrometer om de sequentie-ionen voor identificatie en PTM-lokalisatie op te leveren. Daarom heeft top-down MS het voordeel dat de informatie op proteoform-niveau behouden blijft en de connectiviteit van meerdere PTM 's en terminale afknijpingen op hetzelfde proteoform15,16vastlegt . Top-down experimenten kunnen ook kwantitatieve informatie bieden en inzichten bieden van biomarkers op het intacte eiwitniveau17. Hierin beschrijven we een protocol om histon uit sorghumblad te extraheren en de intacte histonen te analyseren door LC-MS van bovenaf.
De voorbeeldgegevens in figuur 1 en figuur 2 zijn afkomstig van sorghumblad dat in week 2 na het planten is verzameld. Hoewel variatie van de opbrengst wordt verwacht, is dit protocol over het algemeen agnostisch voor specifieke steekproefomstandigheden. Hetzelfde protocol is met succes gebruikt voor sorghum plantenbladweefsel verzameld vanaf 2, 3, 5, 8, 9 en 10 weken na het planten.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4L</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 500mM oplossing, pH 8,0</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>324504-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinehydrochloride</td><td>Sigma</td><td>G3272-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, dibasisch</td><td>Sigma</td><td>P3786-100G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Sigma</td><td>303410-5G</td><td>Gebruikt voor histone deacetylase inhibitor</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>Sigma</td><td>S7020-100G</td><td>Gebruikt voor fosfatase inhibitor</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243-10G</td><td>Gebruikt voor fosfatase inhibitor</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zwakte kationenuitwisselingshars, maas 100-200 analytisch (BioRex70)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-5842</td><td></td></tr><tr><td>Dispositiefs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromatografie kolom (Bio-Spin)</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Maas 100 filterdoek</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY1H09000</td><td>Dit maakt deel uit van het Sigma-kit (catalogus # CELLYTPN1) voor plantennuclei extractie. Vergelijkbare filters met dezelfde maas kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Micropipettips (P20, P200, P1000)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buis, 50mL/15mL, Centrifuge, Conische</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>Buis, Microcentrifuge, 1,5/2 mL</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-912-401</td><td></td></tr><tr><td>Bekers (50mL &ndash; 2L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge met koeling</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-006</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwaaiende-emmer centrifuge met koeling</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-336-120</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van histone van sorghum leaf tissue voor top down mass spectrometry profiling van potentiële epigenetische markers

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histonen behoren tot een familie van sterk geconserveerde eiwitten in eukaryoten. Ze verpakken DNA in nucleosomen als functionele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM's) van histonen, die zeer dynamisch zijn en door enzymen kunnen worden toegevoegd of verwijderd, spelen een cruciale rol bij het reguleren van genexpressie. In planten zijn epigenetische factoren, waaronder histon-PTM's, gerelateerd aan hun adaptieve reacties op het milieu. Inzicht in de moleculaire mechanismen van epigenetische controle kan ongekende mogelijkheden bieden voor innovatieve bio-engineeringoplossingen. Hierin beschrijven we een protocol om de kernen te isoleren en histonen te zuiveren uit sorghumbladweefsel. De geëxtraheerde histonen kunnen in hun intacte vormen worden geanalyseerd door top-down massaspectrometrie (MS) in combinatie met online reversed-phase (RP) vloeibare chromatografie (LC). Combinaties en stoichiometrie van meerdere PTM's op dezelfde histon proteoform kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Bovendien kan histone tail clipping worden gedetecteerd met behulp van de top-down LC-MS workflow, wat het wereldwijde PTM-profiel van kerntonen oplevert (H4, H2A, H2B, H3). We hebben dit protocol eerder toegepast om histon-PTM's te profileren uit sorghumbladweefsel verzameld uit een grootschalig veldonderzoek, gericht op het identificeren van epigenetische markers van droogtebestendigheid. Het protocol kan mogelijk worden aangepast en geoptimaliseerd voor chromatine immunoprecipatie-sequencing (ChIP-seq), of voor het bestuderen van histon PTM's in vergelijkbare planten.

Volgens het protocol kunnen de histonen worden geëxtraheerd en geïdentificeerd met behulp van de LC-MS-analyse. De ruwe gegevens en verwerkte resultaten zijn beschikbaar bij MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via toetreding: MSV000085770. Op basis van de TopPIC-resultaten van de representatieve steekproef (ook verkrijgbaar bij MassIVE) identificeerden we 303 histon proteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 en 22 H4 proteoforms). Co-gezuiverde ribosomale proteoformen zijn ook gedetecteerd, meestal eluting vroeg in de LC. Ze ...

Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Ons protocol onthult epigenetische markers voor de ontwikkeling van sorghumplanten en droogtebestendigheid. Een dergelijk moleculair begrip zal helpen betere oplossingen te ontwikkelen om gewassen in de toekomst aan te passen aan extreme klimaten. Dit protocol genereert hoge zuiverheid histonen uit sorghum bladweefsel geschikt voor niet-gerichte profilering van post-translationele modificaties door massaspectrometrie.Shadan Abdali en Tanya Winkler, post-bachelor onderzoeksmedewerkers van EMSL, demonstreren de procedure. Om te beginnen maal je een paar sorghumblaadjes met vloeibare stikstof en bewaar je ze in een centrifugebuis van 50 milliliter bij min 80 graden Celsius. Gebruik ongeveer vier gram bladpoeder voor de histonanalyse van elk monster.Bereid extractiebuffers 1, 2A en 2B voor zoals beschreven in het teksthandschrift en voeg een proteaseremmertablet toe aan extractiebuffer 1 om een uiteindelijke concentratie van 0,2X te maken. Voeg vervolgens 20 milliliter van de bereide extractiebuffer één toe aan het gemalen bladpoeder en meng of vortex voorzichtig gedurende 10 minuten. Spoel het gefilterde materiaal met mesh 100 telkens twee keer af met twee milliliter extractiebuffer.Centrifugeer vervolgens het filtraat op 3.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het celafval en grote subcellulaire organellen te pelleten. Bereid tegelijkertijd extractiebuffer 2A voor door proteaseremmer toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,4X. Gooi de supernatant weg zonder de pellet te storen.Resuspender vervolgens de pellet in vijf milliliter van de voorbereide extractiebuffer 2A. Incubeer het gedurende 10 minuten op ijs met zacht mengen. Centrifugeer de oplossing op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het puin en de kernen te pelleten.Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen. Bereid extractiebuffer 2B voor door de proteaseremmers toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1X. Voeg vijf milliliter van deze voorbereide buffer toe aan de pellet die na de centrifugatie is verkregen.Centrifugeer op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in de slingerende emmerrotor tot pelletresten en kernen. Bereid tegelijkertijd kernlysebuffer voor door een proteaseremmertablet toe te voegen. Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen en resuspendeer de pellet in 250 microliters van de lysisbuffer.Vortex de oplossing gedurende 15 seconden op maximale snelheid om het te homogeniseren en het materiaal opnieuw te gebruiken. Soniceer het vervolgens vijf minuten op vier graden Celsius en bewaar het op min 80 graden Celsius. Ontdooi het bevroren kernmonster en voeg 750 microliters van 5% guanidinebuffer toe.Soniceer het vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng het monster over in een buis van twee milliliter en draai het gedurende 10 minuten op 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Bereid tegelijkertijd een ionenuitwisselingschromatografiekolom voor door deze te spoelen met twee milliliter acetonitril en vier milliliter water om verontreiniging op het oppervlak te minimaliseren.Laad ongeveer 200 tot 300 microliter zwakke kationenuitwisselingshars op de chromatografiekolom en laat de hars bezinken. Was de hars vier keer met guanidinebuffer en plaats de buis en kolom op ijs. Plaats de kolom op een verzamelbuis van twee milliliter en laad het supernatant van het voorbereide monster langzaam op het harsbed zonder de hars te verstoren.Terwijl de oplossing doorstroomt, laadt u de eluent zes tot acht keer terug naar de bovenkant van de kolom om een maximale binding aan de hars mogelijk te maken. Laad vervolgens twee milliliter van 5% guanidinebuffer om de niet-histoneiwitten van de kolom te wassen. Eluteer de histoneiwitten met één milliliter van 5% guanidinebuffer en verzamel het eluent.Reinig een drie kilodalton cutoff spinfilter met 500 microliter wasmiddel en ontsalt vervolgens de resterende eluent met behulp van het voorgeschoonde spinfilter. Belangrijke histoneiwitten werden waargenomen in specifieke regio's van de LC-MS-functiekaart die het succes van het experiment aangeeft. Deze representatieve kaart toont intacte full-length histonen in gestreepte dozen.De LC-MS feature map van H2B en 16 kilodalton H2A proteoforms laat zien dat beide meerdere homologen hebben met vergelijkbare sequenties zoals opgemerkt door de unieke productsessienummers. Een andere groep H2A-histonen zonder de verlengde staarten is te zien. De N-terminale acetylatie, extra lysine acetylations en methionine oxidaties in H4 histone eiwitten kunnen worden waargenomen door de massaverschillen in de hier getoonde LC-MS feature map te onderzoeken.Er werden twee eiwitsequenties geïdentificeerd voor H3-histoneiwitten, H3.3 en H3.2. Elektronenoverdracht dissociatie fragmentatie werd gebruikt om het fragmentatiespectrum van de geïdentificeerde H3.2 proteoform te genereren. De precursorionen en de vorige en volgende Ms1 spectra worden hier getoond met hun overeenkomende isotooppieken gemarkeerd in paars.Post-translationele wijzigingen kunnen worden gelokaliseerd met behulp van de dekkingskaart van de reeks. Door de relatieve overvloed van de proteoformen te vergelijken, werden veranderingen van afgeknotte histon proteoformen ontdekt die specifiek zijn voor de steekproefomstandigheden. C-terminale afkapping van H4 werd slechts in week drie en negen waargenomen voor sommige monsters.Voor H3.2 waren N-terminal afgeknotte proteoformen over het algemeen overvloediger in week 10. C-terminal afgeknotte H3.2 werden daarentegen in eerdere tijdspunten gezien. De H4 C-terminal afgeknotte proteoformen waren significant overvloediger in BTx642 dan in RTx430.Let bij het proberen van dit protocol goed op de kleuren van de supernatant en de pellet. De kleurverandering helpt bij het identificeren van mogelijke problemen bij het slijpen of lyse van de chloroplast. We hopen dat dit robuuste protocol voor histonisolatie van sorghumbladeren epigeenonderzoek voor andere vergelijkbare planten mogelijk zal maken.

isolation-histone-from-sorghum-leaf-tissue-for-top-down-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&amp;Tag) is een efficiënte chromatine epigenomische profileringsstrategie. Dit protocol presenteert een verfijnde CUT&amp;Tag strategie voor de profilering van histonmodificaties in planten.

Profilering van H3K4me3 Modificatie in Planten met behulp van Splitsing onder Doelen en Tagmentatie

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer histonen isoleren uit Sorghum-bladweefsel voor top-down massaspectrometrie-profiling van epigenetische markers. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van post-translatie modificaties.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Meer video's verkennen