Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Ons protocol onthult epigenetische markers voor de ontwikkeling van sorghumplanten en droogtebestendigheid. Een dergelijk moleculair begrip zal helpen betere oplossingen te ontwikkelen om gewassen in de toekomst aan te passen aan extreme klimaten. Dit protocol genereert hoge zuiverheid histonen uit sorghum bladweefsel geschikt voor niet-gerichte profilering van post-translationele modificaties door massaspectrometrie.

Shadan Abdali en Tanya Winkler, post-bachelor onderzoeksmedewerkers van EMSL, demonstreren de procedure. Om te beginnen maal je een paar sorghumblaadjes met vloeibare stikstof en bewaar je ze in een centrifugebuis van 50 milliliter bij min 80 graden Celsius. Gebruik ongeveer vier gram bladpoeder voor de histonanalyse van elk monster.

Bereid extractiebuffers 1, 2A en 2B voor zoals beschreven in het teksthandschrift en voeg een proteaseremmertablet toe aan extractiebuffer 1 om een uiteindelijke concentratie van 0,2X te maken. Voeg vervolgens 20 milliliter van de bereide extractiebuffer één toe aan het gemalen bladpoeder en meng of vortex voorzichtig gedurende 10 minuten. Spoel het gefilterde materiaal met mesh 100 telkens twee keer af met twee milliliter extractiebuffer.

Centrifugeer vervolgens het filtraat op 3.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het celafval en grote subcellulaire organellen te pelleten. Bereid tegelijkertijd extractiebuffer 2A voor door proteaseremmer toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,4X. Gooi de supernatant weg zonder de pellet te storen.

Resuspender vervolgens de pellet in vijf milliliter van de voorbereide extractiebuffer 2A. Incubeer het gedurende 10 minuten op ijs met zacht mengen. Centrifugeer de oplossing op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmerrotor om het puin en de kernen te pelleten.

Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen. Bereid extractiebuffer 2B voor door de proteaseremmers toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 1X. Voeg vijf milliliter van deze voorbereide buffer toe aan de pellet die na de centrifugatie is verkregen.

Centrifugeer op 2, 100 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in de slingerende emmerrotor tot pelletresten en kernen. Bereid tegelijkertijd kernlysebuffer voor door een proteaseremmertablet toe te voegen. Decanteer het supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen en resuspendeer de pellet in 250 microliters van de lysisbuffer.

Vortex de oplossing gedurende 15 seconden op maximale snelheid om het te homogeniseren en het materiaal opnieuw te gebruiken. Soniceer het vervolgens vijf minuten op vier graden Celsius en bewaar het op min 80 graden Celsius. Ontdooi het bevroren kernmonster en voeg 750 microliters van 5% guanidinebuffer toe.

Soniceer het vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng het monster over in een buis van twee milliliter en draai het gedurende 10 minuten op 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Bereid tegelijkertijd een ionenuitwisselingschromatografiekolom voor door deze te spoelen met twee milliliter acetonitril en vier milliliter water om verontreiniging op het oppervlak te minimaliseren.

Laad ongeveer 200 tot 300 microliter zwakke kationenuitwisselingshars op de chromatografiekolom en laat de hars bezinken. Was de hars vier keer met guanidinebuffer en plaats de buis en kolom op ijs. Plaats de kolom op een verzamelbuis van twee milliliter en laad het supernatant van het voorbereide monster langzaam op het harsbed zonder de hars te verstoren.

Terwijl de oplossing doorstroomt, laadt u de eluent zes tot acht keer terug naar de bovenkant van de kolom om een maximale binding aan de hars mogelijk te maken. Laad vervolgens twee milliliter van 5% guanidinebuffer om de niet-histoneiwitten van de kolom te wassen. Eluteer de histoneiwitten met één milliliter van 5% guanidinebuffer en verzamel het eluent.

Reinig een drie kilodalton cutoff spinfilter met 500 microliter wasmiddel en ontsalt vervolgens de resterende eluent met behulp van het voorgeschoonde spinfilter. Belangrijke histoneiwitten werden waargenomen in specifieke regio's van de LC-MS-functiekaart die het succes van het experiment aangeeft. Deze representatieve kaart toont intacte full-length histonen in gestreepte dozen.

De LC-MS feature map van H2B en 16 kilodalton H2A proteoforms laat zien dat beide meerdere homologen hebben met vergelijkbare sequenties zoals opgemerkt door de unieke productsessienummers. Een andere groep H2A-histonen zonder de verlengde staarten is te zien. De N-terminale acetylatie, extra lysine acetylations en methionine oxidaties in H4 histone eiwitten kunnen worden waargenomen door de massaverschillen in de hier getoonde LC-MS feature map te onderzoeken.

Er werden twee eiwitsequenties geïdentificeerd voor H3-histoneiwitten, H3.3 en H3.2. Elektronenoverdracht dissociatie fragmentatie werd gebruikt om het fragmentatiespectrum van de geïdentificeerde H3.2 proteoform te genereren. De precursorionen en de vorige en volgende Ms1 spectra worden hier getoond met hun overeenkomende isotooppieken gemarkeerd in paars.

Post-translationele wijzigingen kunnen worden gelokaliseerd met behulp van de dekkingskaart van de reeks. Door de relatieve overvloed van de proteoformen te vergelijken, werden veranderingen van afgeknotte histon proteoformen ontdekt die specifiek zijn voor de steekproefomstandigheden. C-terminale afkapping van H4 werd slechts in week drie en negen waargenomen voor sommige monsters.

Voor H3.2 waren N-terminal afgeknotte proteoformen over het algemeen overvloediger in week 10. C-terminal afgeknotte H3.2 werden daarentegen in eerdere tijdspunten gezien. De H4 C-terminal afgeknotte proteoformen waren significant overvloediger in BTx642 dan in RTx430.

Let bij het proberen van dit protocol goed op de kleuren van de supernatant en de pellet. De kleurverandering helpt bij het identificeren van mogelijke problemen bij het slijpen of lyse van de chloroplast. We hopen dat dit robuuste protocol voor histonisolatie van sorghumbladeren epigeenonderzoek voor andere vergelijkbare planten mogelijk zal maken.