Nanodeeltjes tracking analyse van gouden nanodeeltjes in waterige media door middel van een interlaboratorium vergelijking
20 oktober 2020
Het hier beschreven protocol heeft tot doel de hydrodynamische diameter van bolvormige nanodeeltjes, meer bepaald gouden nanodeeltjes, in waterige media te meten door middel van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Dit laatste omvat het volgen van de beweging van deeltjes als gevolg van Browniaanse beweging en het implementeren van de Stokes-Einstein-vergelijking om de hydrodynamische diameter te verkrijgen.
Dit protocol maakt gebruik van nanodeeltjesvolganalyse om nauwkeurige, betrouwbare en reproduceerbare metingen uit te voeren van de hydrodynamische diameters van interessante nanomaterialen. De methode is snel en eenvoudig uit te voeren, waardoor meting van de hydrodynamische sferische equivalentdiameter van deeltjes wordt vergemakkelijkt, via visuele analyse in real time, deeltje voor deeltje, en minimale monstervoorbereiding. Voordat u een meting uitvoert, filtert u het volume ultrapuur water dat voor de analyse wordt gebruikt, door een 0,02 micron spuitfilter.
Verdun het monster op de juiste manier in het gefilterde water. Voor dit 60 nanometer goudcolloïde dispersiemonster, verdunt u volumetrisch met een factor 50. Verbind de NTA-instrument, spuitpomp en computer, en schakel de hardware en software in.
Verwijder het lasermodule uit het systeem en gebruik een doek en perslucht om de glazen oppervlakken en de interne kanalen, buisjes en vloeistofpoorten van de LVFC volledig te drogen. Plaats de LVFC op de lasermodule en bevestig het met de vier schroeven door deze diagonaal vast te draaien. Bevestig de uitlaatbuis aan de poort aan de rechterkant van de cel.
Plaats de inlaatbuis in de afvalfles en spoel 900 microliters reinigingsoplossing zo snel mogelijk, zolang de tegendruk het toelaat. Vervang de spuit die aan de inlaatbuis is bevestigd door een nieuwe spuit met één milliliter gefilterd water en verbind de inlaatbuis met de linkerpoort van de flowcel. Breng vervolgens langzaam ongeveer 500 microliters vloeistof in de monsterkamer, en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd tijdens het laden.
Om de lasermodule te laden, plaatst u de met water gevulde LVFC in het instrument en vergrendelt u de cel op zijn plaats. Bevestig de spuit en de spuitpomphouder en klik op Start Camera in de software-interface om de camera te initialiseren. Klik in het hardwaretabblad op Scatter om de referentiepositie te verplaatsen en stel het cameraniveau in op 16.
Stel de focus handmatig in om het verdunningsmiddel op eventuele deeltjes te controleren en klik links en sleep in het hoofdweergavevenster om de positie van het gezichtsveld aan te passen om te controleren op eventuele deeltjes. Om het systeem te reinigen, vervangt u de spuit door een spuit vol lucht en vervangt u langzaam het water in de kamer door lucht. Verwijder de cel van de lasermodule uit het instrument en koppel de stukken buis los.
Reinig het optische glas van de lasermodule en de glazen oppervlakken van de LVFC met water en droog met een doek en perslucht. Nadat u de LVFC en de lasermodule weer hebt samengesteld en de buisjes hebt geprimed, verbindt u een spuit met één milliliter van de 60 nanometer goudnanodeeltjessuspensie aan de onderste poort en injecteert u langzaam 750 microliters van het monster in de LVFC-kamer. Nadat u de lasermodule hebt geladen en de camera hebt geïnitialiseerd, klikt u op Scatter om de referentiefocus in positie te brengen en bevestigt u dat de focus correct is ingesteld om een duidelijk beeld van de deeltjes te geven.
Controleer of het gezichtsveld centraal is ingesteld ten opzichte van de laserstraalpositie en voer de auto-setupfunctie uit om de focus en het cameraniveau automatisch te optimaliseren om te zorgen dat de optimale beeldkwaliteit wordt bereikt. Om het monster te analyseren, opent u het tabblad Standard Measurement Standard Operating Procedure en stelt u het instrument in om vijf video's van 60 seconden te verwerven onder langzame en constante stroming. Stel vervolgens de bestandsnaam en locatie voor de gegevens in en start de run.
Om de gegevens te analyseren, sleept u de schuifbalk in het tabblad Detection Threshold om de detectiedrempel in te stellen zodat zoveel mogelijk zichtbare deeltjes worden gedetecteerd en gevolgd. Zorg ervoor dat niet meer dan vijf blauwe kruisen, indicatief voor ruis, worden waargenomen. Om de deeltjesvolganalysevideo's automatisch te verwerken, klikt u op Instellingen, Oké en laat u alle verwerkingsparameters op hun automatische instellingen.
Nadat de gegevensverwerking voltooid is, exporteert u de gegevens als een CSV-formulier resultatenbestand. Hier worden de resultaten van een interlaboratoriumvergelijking van ronde een getoond die zijn verkregen met behulp van verschillende nanodeeltjesvolganalyse-instrumentconfiguraties. Met uitzondering van laboratorium zes, was de herhaalbaarheid tussen de vijf opnameherhalingen goed, ook al registreerden verschillende laboratoria een hogere dan verwachte modale grootte.
De nauwkeurigheid van de nanodeeltjesvolganalyseresultaten van ronde drie werd verbeterd door alle laboratoria die dezelfde standaard werkprocedure en instrumentinstellingen implementeerden, met een gemiddelde modus over alle laboratoria van 62,02 plus of min 1,97 nanometer. De gemiddelde diameter van de deeltjes kan worden berekend met behulp van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden als een aanvullende techniek voor NTA om de deeltjesgrootte, morfologie en aspectverhouding te valideren. In deze analyse lijken de deeltjes meestal sfeervormig te zijn met een gemiddelde aspectverhouding van 1,1.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de lage volumeflowcel goed is gereinigd voor gebruik, dat het monster op de juiste manier is verdund, goed is geladen en gefocust, en dat de SOP wordt gevolgd. Deze methode kan worden gebruikt voor elke andere nanodeeltje-karakterisering, inclusief exosomen en virussen om stabiliteitsstudies en kwaliteitsgecontroleerde processen te ondersteunen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van de hydrodynamische diameter van goudnanodeeltjes in waterige media met behulp van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). De techniek maakt gebruik van de Brownse beweging en de Stokes-Einstein-vergelijking voor een nauwkeurige bepaling van de grootte.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Karakterisering van nanodeeltjes
- Analytische chemie
- Materiaalkunde
Achtergrond
- NTA maakt real-time analyse van nanodeeltjes mogelijk.
- De hydrodynamische diameter is cruciaal voor het begrijpen van het gedrag van deeltjes in oplossingen.
- Goudnanodeeltjes worden veelvuldig gebruikt in diverse toepassingen.
- Nauwkeurige groottemeting is essentieel voor kwaliteitscontrole.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol op te stellen voor het meten van nanodeeltjesgroottes.
- Om de reproduceerbaarheid van nanodeeltjesanalyses tussen verschillende laboratoria te verbeteren.
- Om NTA-resultaten te valideren met complementaire technieken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van ultrapuur water en verdunning van het monster.
- Installatie en kalibratie van het NTA-instrument.
- Real-time tracking van nanodeeltjes om de grootte te bepalen.
- Data-analyse en export van resultaten voor verdere validatie.
Belangrijkste resultaten
- Nauwkeurige metingen van de grootte van goudnanodeeltjes zijn gerealiseerd.
- Een goede reproduceerbaarheid over meerdere laboratoria is aangetoond.
- De NTA-resultaten zijn gevalideerd met transmissie-elektronenmicroscopie.
- De gemiddelde modale grootte over de laboratoria was 62.02 ± 1.97 nanometers.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het karakteriseren van nanodeeltjes.
- Het volgen van standaardprocedures verhoogt de nauwkeurigheid.
- Deze methode kan worden aangepast voor andere nanomaterialen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Robuuste karakterisering van nanodeeltjes is essentieel voor biopharma R&D, waarbij de deeltjesgrootte een directe impact heeft op de stabiliteit van de formulering, de efficiëntie van de afgifte en de veiligheidsprofielen. Deze interlaboratoriumvergelijking van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) voor goudnanodeeltjes demonstreert de noodzaak van gestandaardiseerde protocollen en reproduceerbare analyses om de integriteit van gegevens over verschillende locaties te waarborgen. Betrouwbare meting van de hydrodynamische diameter vormt de basis voor het voorspellend vertrouwen in therapeutica en diagnostiek op basis van nanodeeltjes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt een nauwkeurige beoordeling van de grootteverdeling van nanodeeltjes mogelijk voor mechanistische risicoreductie bij de ontwikkeling van afgiftesystemen.
- Ondersteunt de functionele validatie van nanomateriaaleigenschappen die relevant zijn voor biologische targeting en opname.
- Faciliteert portfolio-triage door reproduceerbare, kwantitatieve partikelmetrieken te leveren voor de selectie van kandidaten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde nanodeeltjessuspensies voor voor downstream biologische assays en screeningsworkflows.
- Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door geharmoniseerde SOP's en instrumentinstellingen.
- Levert kwantitatieve resultaten die een betrouwbare vergelijking van nanodeeltjesformuleringen en batches mogelijk maken.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform door het vestigen van consistentie in metingen tussen verschillende laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt de karakterisering van nanodeeltjes af op de translationele biomarker-vereisten voor preklinische studies.
- Handhaaft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door cross-functionele vergelijkbaarheid van gegevens mogelijk te maken.
- Vermindert het risico bij het verder ontwikkelen van kandidaten op basis van nanomaterialen door gevalideerde, reproduceerbare groottegegevens te leveren.
Pipeline- & workflowintegratie
De op NTA gebaseerde meting van de hydrodynamische diameter is geïntegreerd van vroege ontdekking tot preklinische ontwikkeling, ter ondersteuning van de identificatie van lead-verbindingen en formulatieoptimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Levert kwantitatieve groottegegevens om hypothesen over het gedrag van nanodeeltjes en biologische interacties te testen.
- Screening: Levert reproduceerbare, gestandaardiseerde metingen die essentieel zijn voor de gereedheid van assays en vergelijkingen tussen batches.
- Analytiek: Genereert exporteerbare, kwantitatieve resultaten voor statistische analyse en benchmarking tussen laboratoria.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming op preklinische biomarker- en stabiliteitseisen bij het verder ontwikkelen van kandidaten.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een gevalideerd, overdraagbaar protocol voor de karakterisering van nanodeeltjes over verschillende programma's en locaties heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in R&D op basis van nanodeeltjes.
- Operationele waarde: Stimuleert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van nanodeeltjesanalyse.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte ontwikkeling van nanomateriaal-kandidaten mogelijk.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en cross-programma vergelijkbaarheid van nanodeeltjesgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in NTA-instrumentatie en data-interpretatie.
- Afhankelijk van toegang tot gekalibreerde NTA-systemen en aanvullende analytische infrastructuur.
- Vereist strikte naleving van gestandaardiseerde SOP's door het hele team voor reproduceerbaarheid.
- Kan aanpassing van protocollen vereisen voor verschillende typen nanodeeltjes of biologische matrices.
- Potentiële beperkingen omvatten de gevoeligheid voor monstervoorbereiding en instrumentconfiguratie, zoals benadrukt door inter-lab variabiliteit.
