Name: Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer hoe je angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen evalueert met het driedimensionale NICO-1 cocultuursysteem. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorinitiatie en therapeutische resistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research C (subsidie nr. 19K09834 aan K.N.) van het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur, Japan.

Alle procedures werden uitgevoerd volgens het protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie voor menselijk welzijn. Alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het onderzoeksgebruik van hun monsters, en de verzameling en het gebruik van weefsels voor deze studie werden goedgekeurd door de Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee aan de Teikyo University.
1. Isolatie en kweek van eierstokkankerstamcellen (OCSC's) van patiënten met eierstokkanker en ascites in een bioveiligheidskast van niveau 2
<ol><li>Isoleer kankerstamcellen van menselijke eierstokkanker ascites verkregen via paracentese. Verzamel ten minste 100-250 ml ascites van patiënten om voldoende kankerstamcellen te nemen. Evalueer daarnaast de expressieprofielen van kankerstamcelmarkers (d.w.z. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 en Oct4) en eierstokkankermarkers (pAX-8, WT-1) door flowcytometrie.<ol><li>Centrifugeer de menselijke eierstokkanker ascites bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur binnen 24 uur na ascites-aspiratie.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en voeg 2 ml OCSC-medium en 8 ml 30% Histodenz/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) toe.</li>
		<li>Bereid OCSC-medium voor: StemPro hESC-supplement, DMEM⁄F-12 met L-glutamine (GlutaMAX-medium), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoethanol, 8 ng/ml FGF BASIC, 10 μM insuline en 20 μM Y-27632.</li>
		<li>Leg voorzichtig 2 ml OCSC-medium over de celoplossing in stap 1.1.2 in een buis van 15 ml en centrifugeer op 450 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een zwenkbakrotor zonder te remmen.</li>
		<li>Breng de OCSC-laag (ongestoord in de interfase) voorzichtig over naar een nieuwe buis van 15 ml via een transferpipet.</li>
		<li>Vul met PBS tot 15 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.</li>
		<li>Resuspensie de celpellet in OCSC-medium en zaad op een ultra-low-attachment kweekschaal; culturen moeten worden gehandhaafd op 37 °C in 5% CO2.</li>
		<li>Verander het medium om de drie dagen. Laat de kweekschaal ongeveer 1 minuut staan en gooi een deel van het supernatant weg en voeg het nieuwe medium toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage van CSC's<ol><li>Verzamel OCSC's in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, vul met PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, voeg 1 ml van de celloslatingsoplossing toe, bestaande uit proteolytische en collagenolytische enzymen (bijv. AccuMax) en incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Meng goed door te pipetteren en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Zorg ervoor dat cellen zich in één suspensie bevinden.</li>
		<li>Meng goed door te pipetteren, vul met PBS en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in OCSC-medium voor daaropvolgende zaaiing op kweekschalen met ultralage hechting en onderhoud bij 37 °C in 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HUEhT-1 endotheelcelkweek
<ol><li>Passage van HUEhT-1 cellen<ol><li>Haal medium uit de HUEhT-1 kweekschaal en was de cellen met PBS.</li>
		<li>Voeg 1 ml 0,025% trypsine toe en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 5 ml endotheelcelgroeimedium 2 toe, verzamel cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, resuspendeer de celpellet in HUEhT-1 medium en zaai de cellen op collageen gecoate kweekschalen gevolgd door onderhoud bij 37 °C in 5% CO2.</li>
		<li>Verander het medium om de drie dagen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bereiding van de NICO-1 cocultuurplaat voor buisvormingstest met HUEhT-1-cellen
<ol><li>Monteer NICO-1 en coating met de extracellulaire hydrogel op basis van matrix (Matrigel Matrix).<ol><li>Monteer één kant van NICO-1 volgens de instructies van de fabrikant en houd deze op ijs.</li>
		<li>Bedek het oppervlak van NICO-1 met 300 μL koud PBS en verwijder vervolgens de buffer.</li>
		<li>Voeg 300 μL gekoelde extracellulaire hydrogel op basis van matrix toe en incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten.</li>
		<li>Om in evenwicht te komen, dompelt u het filter onder met 100% ethanol en wast u vervolgens een 13 mm ICCP-filter (0,6 μm) met PBS gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Monteer de NICO-1 inclusief de hoofdgedeelten A (rechterkamer) en B (linkerkamer) samen met de O-ring en het gebalanceerde filter.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hueht-1-cellen en CSC's op het NICO-1-systeem zaaien
<ol><li>Bereid HUEhT-1 celsuspensies door de celmonolagen te trypsiniseren en de cellen in endotheelcelgroeimedium te resuspenderen met 2% foetaal kalfsserum.</li>
	<li>Voeg 1,2 ml van de celsuspensie (1,5 x 105 cellen) toe aan elke extracellulaire hydrogel-gecoate put op basis van matrix.</li>
	<li>Voeg 1,5 ml OCSC's gekweekt gedurende vijf dagen toe aan de andere put.</li>
	<li>Incubeer NICO-1 bij 37 °C in 5% CO2; buisvorming kan worden waargenomen onder de microscoop en netwerkvorming op extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel gemeten door middel van het aantal takken.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe de tumormicro-omgeving van OCSC's in een in vitro setting kan worden nagebootst. De primaire component van de methode vormt het zeer reproduceerbare cocultuurmodel dat is verkregen met behulp van het NICO-1-systeem, een indirect Transwell-cocultuursysteem. Veel van de momenteel beschikbare cocultuurmodellen onderzoeken de effecten van direct cel-celcontact op coculturele celpopulaties 12,13,14,15,16,17,18.<sup...

Eierstokkanker is de achtste meest voorkomende maligniteit bij vrouwen wereldwijd, met ongeveer 300.000 nieuwe diagnoses en naar schatting 180.000 sterfgevallen per jaar1. Bij de eerste diagnose presenteert eierstokkanker zich vaak met ernstige symptomen, waarbij ongeveer 75% van de patiënten zich al in stadium III-IV bevindt. Dienovereenkomstig is de 5-jaarsoverleving <30% en het sterftecijfer is het hoogste onder gynaecologische kankers2, waarbij de efficiëntie van de behandeling van eierstokkanker sterk afhankelijk is van klinische factoren zoals het succesvol uitvoeren van debulkingchirurgie, resistentie tegen chemotherapie en herhaling na de initiële therapie.
Eierstokkankerweefsels zijn hiërarchisch georganiseerd, waarbij niet alle tumorcomponenten even goed in staat zijn om nakomelingen te genereren. De enige cellen die in staat zijn zichzelf te vernieuwen en een heterogene tumorcelpopulatie te produceren, worden beschouwd als kankerstamcellen (CSC's)3. CSC-zelfvernieuwing en tumorinitiatie gaan gepaard met de bevordering van angiogenese om hun tumormicro-omgeving te hermodelleren met als doel een ondersteunende niche te behouden. Eerdere modellen konden echter niet worden gebruikt voor in vitro analyses vanwege de beperkte reproduceerbaarheid van het kweken van CSC's afgeleid van klinische monsters als gevolg van de verstoring van sferoïden na meervoudige passaging. Meer recent zijn experimentele methoden ontwikkeld om CSC's van patiënten te kweken voor verschillende toepassingen 4,5,6,7. In het bijzonder, door gebruik te maken van het kenmerk van CSC's om te groeien door sferoïden te vormen in ultralage hechtingsplaten met serumvrij medium, worden de gecultiveerde CSC's geïnduceerd om een stamceloppervlakmarker tot expressie te brengen die niet tot expressie komt in normale tumorcellen met multilineaire differentiatiepotentiaal 8,9.
Recente gegevens hebben aangetoond dat de persistentie van slapende ovariële (O) CSC's gevisualiseerd als verspreiding aan het peritoneum geassocieerd is met hun regeneratie als terugkerende tumoren10. Inzicht in de moleculaire en biologische kenmerken van OCSC's kan dus effectieve targeting en uitroeiing van deze cellen mogelijk maken, wat resulteert in potentiële tumorremissie. In het bijzonder is er weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanistische kenmerken van CSC-rollen in angiogenese11. Daarom hebben we in het huidige protocol patiënt-afgeleide OCSC's in een in vitro setting gebruikt om de angiogene eigenschap van endotheelcellen te onderzoeken met behulp van het co-kweekmodel, dat de tumormicro-omgeving van CSC's en endotheelcellen op de gemetastaseerde plaats in de klinische setting kan nabootsen. Uiteindelijk, aangezien neovascularisatie een kritisch proces vormt dat nodig is om tumorgroei en metastase te ondersteunen, zal een beter begrip van het mechanisme de ontwikkeling van een nieuwe targetingtherapie voor OCSC's op de gemetastaseerde plaats mogelijk maken.
Hier presenteren we een protocol om de neovascularisatiestap rond de CSC's op een tijdsverloopmanier te visualiseren. Het voordeel van het protocol is het mogelijk maken van volledig reproduceerbaar onderzoek met behulp van het 3D-cocultuursysteem NICO-1, waardoor observatie van de effecten op patiënten van het ocsc-afgeleide tumorinitiatievermogen tijdens endotheelcelangiogenese mogelijk is.

```html
<table><tbody><tr><td>0.025% Trypsin&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro;L Pipet tip</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L Pipet tip</td><td>QSP</td><td>T110RS-NEW</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Collagen I 60mm Dish</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel Groeimedium 2&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-22011&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 cel</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>ICCP Filter 0.6 &micro;m</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, menselijk</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1</td><td></td></tr><tr><td>NICO-1</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>WAKO</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>
```

evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Kankerstamcellen (CSC's) bevinden zich in een ondersteunende niche en vormen een micro-omgeving die bestaat uit aangrenzende stromale cellen, bloedvaten en extracellulaire matrix. Het vermogen van CSC's om deel te nemen aan de ontwikkeling van endotheel vormt een belangrijk kenmerk dat direct bijdraagt aan het algemene begrip van de mechanismen van tumorigenese en tumormetastase. Het doel van dit werk is om een reproduceerbare methodologie vast te stellen om het tumorinitiatievermogen van eierstokkankerstamcellen (OCSC's) te onderzoeken. Hierin onderzochten we het neovascularisatiemechanisme tussen endotheelcellen en OCSC's, samen met de morfologische veranderingen van endotheelcellen met behulp van het in vitro co-kweekmodel NICO-1. Dit protocol maakt visualisatie van de neovascularisatiestap rond de OCSC's mogelijk op een tijdsverloopmanier. De techniek kan inzicht geven in de angiogenetische eigenschappen van OCSC's bij tumormetastase.

We verzamelden ascitesvloeistoffen verkregen van patiënten met gevorderde eierstokkanker tijdens een operatie of paracentese met als doel een langdurige stabiele kweek voor sferoïden uit te voeren. Hier presenteren we gevallen van een langdurige sferoïde cultuur van ovariële CSC's genaamd CSC1 en CSC2. Beide cellijnen dragen dezelfde diagnose en histologische profielen. De mechanistische rollen van OCSC's die ten grondslag liggen aan de interactie met endotheelcellen die nodig zijn om de ...

Eierstokkankerstamcellen (OCSC) zijn verantwoordelijk voor kankerinitiatie, recidief, therapeutische resistentie en metastase. De OCSC vasculaire niche wordt beschouwd als het bevorderen van zelfvernieuwing van OCSC's, wat leidt tot chemoresistance. Dit protocol vormt de basis voor het opzetten van een reproduceerbaar OCSC vasculair nichemodel in vitro.

Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Eierstokkanker heeft een hoge sterfteratio onder gynaecologische kwaadaardige gezwellen. Eierstokkanker stamcellen en hun vasculaire nis zijn in staat om de tumormicro-omgeving te hermodelleren. Echter, eerdere eierstokkanker stamcelmodellen hebben geen gedetailleerde analyse mogelijk gemaakt vanwege hun beperkte reproduceerbaarheid.Het voordeel van ons protocol omvat de reproduceerbaarheid van het 3D co-cultuursysteem, wat de studie van de effecten van eierstokkanker stamcellen-afgeleide tumorinitiatiecapaciteiten bij patiënten tijdens angiogenese vergemakkelijkt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Yuko Miyagawa, een onderzoeksmedewerker van ons laboratorium. Om kanker stamcellen te isoleren van humaan eierstokkanker ascites verkregen via paracentese, verzamel 100 tot 250 milliliter patiëntascites en centrifugeer het monster binnen 24 uur na verkrijging.Resuspendeer de pellets in twee milliliter OCSC medium en voeg acht milliliter van 30% niet-ionisch dichtheidsgradiënt medium in PBS toe aan elk monster. Breng de celsuspensies over naar individuele 15 milliliter buisjes en laat voorzichtig twee milliliter extra OCSC medium op de celoplossing in elke buis lagen. Scheid de cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie en draag de OCSC voorzichtig over van de interfase naar een nieuw 15 milliliter buisje.Was de verzamelde cellen met een volledig volume PBS en resuspendeer de pellets in vers OCSC medium. Zaai de cellen op ultra lage hechting kweekschotels en incubeer de culturen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na vijf dagen kweek, verzamel de cellen in één 15 milliliter buisje per plaat door centrifugatie.Na een tweede centrifugatie in PBS, resuspendeer de cellen in één milliliter van proteolytische en collagenolytische enzymceldetacheringsoplossing gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, meng goed door te pipetteren en plaats de cellen terug in 37 graden voor nog eens vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, meng de cellen opnieuw door te pipetteren en vul de buis met PBS voor wassen door centrifugatie.Vervolgens, resuspendeer het pellet in OCSC medium en zaai de cellen op nieuwe ultra lage hechting kweekschotels. Om een HUEhT-1 endotheelcelcultuur op te zetten, was de HUEhT-1 cellen met PBS en behandel de cellen met 0,025% trypsine gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de cellen losgelaten zijn, stop de reactie met vijf milliliter endotheelcelgroeimedium twee en verzamel de cellen in een 15 milliliter buisje voor centrifugatie.Vervolgens, resuspendeer het pellet in HUEhT-1 medium bij een concentratie van 1,5 bij 10 tot de vijfde en zaai de cellen op collageen gecoate kweekschotels. Om een interactieve co-cultuurplaat op te zetten voor een buisvormingstest, assembleer het NICO-1 apparaat volgens de instructies van de fabrikant en plaats het systeem op ijs. Was de assemblage met 300 microliters koude PBS voordat je 300 microliters gekoeld extracellulair matrix-gebaseerd hydrogel toevoegt aan het apparaat voor een incubatie van 60 minuten bij 37 graden Celsius.Aan het einde van de incubatie, dompel een steriele 13 millimeter filter in 100% ethanol gevolgd door een onderdompeling van een minuut in PBS. Aan het einde van de incubatie, plaats een O-ring en het geëquilibreerde filter in de juiste kamers in de lichaam van de assemblage. Wanneer het apparaat is geassembleerd, resuspendeer de HUEhT-1 cellen bij 1,25 bij 10 tot de vijfde cellen per milliliter endotheelcelgroeimedium aangevuld met 2% foetaal runder serumconcentratie en voeg 1,2 milliliter cellen toe aan elke extracellulair matrix-gebaseerd hydrogel gecoate put.Vervolgens, voeg 1,5 milliliter van vijf dagen gekweekte OCSC toe aan één put en plaats het NICO-1 systeem in de celkweekincubator. Buisvorming kan worden waargenomen door lichtmicroscopie en de vorming van celnetwerken op de extracellulair matrix-gebaseerde hydrogel kan worden gemeten door het aantal takken dat zich binnen de co-cultuur over tijd vormt te kwantificeren. Hier kan een vergelijking van de buisvormingsactiviteit geïnduceerd door twee verschillende CSC worden waargenomen.In deze analyse nam het aantal gevormde vasculaire buizen dramatisch toe in de loop van de tijd tijdens co-cultuur met de tweede CSC populatie. In deze beelden kan de angiogene eigenschap van HUEhT-1 na behandeling met vasculair endotheelgroeifactor zonder CSC2 co-cultuur worden waargenomen als een positieve controle. In dit OSCS endotheelcel co-cultuurmodel met behulp van het NICO-1 systeem, werden HUEhT-1 cellen gedurende 20 uur co-gekweekt met CSC2.Zoals waargenomen via time-lapse videobeelden, vormden de HUEhT-1 cellen vasculaire buizen gedurende het beloop van de 20 uur CSC co-cultuur. Recente ontdekkingen hebben geleid tot het klinische gebruik van PARP-remmers voor eierstokkanker, defect in homologe recombinatie herstel, evenals anti-angiogene bevacizumab. Ons protocol dat gebruik maakt van een 3D co-cultuursysteem kan inzicht geven in de angiogene eigenschap van eierstokkanker stamcellen bij tumormetastase.

evaluating-angiogenetic-properties-ovarian-cancer-stem-like-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Tumor-initiërende cellen (TIC's) kunnen een haalbaar therapeutisch doelwit zijn voor de behandeling van eierstokkanker, een zeer terugkerende en dodelijke ziekte. We presenteren een protocol voor kweekcondities die deze zeer tumorigene populatie cellen verrijken.

In vitro Verrijking van eierstokkanker tumor-initiërende cellen

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.

Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat

We beschrijven methoden om somatische cellen van muis-ovariumcellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van de eierstok en om somatische organoïden van muis-ovarium te genereren met een steigervrije benadering.

Onderzoek naar de ovariummicroomgeving: Methoden voor isolatie, 2D-kweek en organoïde kweek van somatische cellen van muis eierstokcellen

Leer hoe je angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen evalueert met het driedimensionale NICO-1 cocultuursysteem. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorinitiatie en therapeutische resistentie.

Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1 (Video) | JoVE Journal

Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1

Meer video's verkennen