Name: Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer hoe u horizontale hippocampale hersensneden van muizen bereidt voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode behoudt de integriteit van hippocampale vezels en maakt betrouwbare metingen van synaptische transmissie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de afdeling Elektrofysiologie van het VIB-KU Leuven Centrum voor Hersen- en Ziekteonderzoek onder begeleiding van Dr. Keimpe Wierda en Prof. Dr. Joris De Wit voor het gebruik van hun onderzoeksfaciliteiten. Verder bedanken we alle leden van het Laboratorium voor Ionenkanaalonderzoek en het Laboratorium voor Endometrium, Endometriose en Reproductieve Geneeskunde van de KU Leuven voor hun nuttige discussies en opmerkingen.
Dit project heeft financiering ontvangen van de Onderzoeksstichting-Vlaanderen (G.084515N en G.0B1819N aan J.V.) en de Onderzoeksraad van de KU Leuven (C1-funding C14/18/106 aan J.V.). K.P. is een FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow en ontving financiering van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie subsidieovereenkomst (665501) met de Onderzoeksstichting Vlaanderen (FWO) (12T0317N). K.H. is postdoctoraal fellow van de Onderzoeksstichting Vlaanderen, België (12U7918N).

Alle dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door de ethische toetsingscommissie van de KU Leuven (België) (P021/2012).
1. Bereiding van hoog-sacharose plakoplossing en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF)
<ol><li>Voorafgaand aan de experimentele dag<ol>
<li>Bereid 1 L van 10x plakjes vooroplossing met water van laboratoriumkwaliteit type 1 met (in mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (tabel 1). Om calciumfosfaatprecipitatie te voorkomen, mengt u de chemicaliën langzaam in een bekerglas voorgevuld met 800 ml H2O terwijl u constant roert met een magnetische roerder. Bewaar de oplossing bij 4 °C of kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op de experimentele dag<ol>
<li>Bereid 1 L van 1x ACSF met water van laboratoriumkwaliteit Type 1 met (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tabel 2). Gebruik een dampdruk osmometer om de osmolariteit tussen 305–315 mOsm (pH ~ 7,55–7,6) te valideren. OPMERKING: Om calciumfosfaatprecipitatie te voorkomen, mengt u langzaam alle vaste chemicaliën in een bekerglas voorgevuld met 800 ml H2O terwijl u constant roert met een magnetische roerder. Voeg mgso4 en cacl2 helemaal aan het einde toe en druppel langzaam in de benodigde hoeveelheid van 1 M voorraadoplossingen.</li>
		<li>Continu bellen 1x ACSF oplossing bij RT met carbogen om pH in te stellen tussen 7.3–7.4. OPMERKING: Als de pH iets te hoog of te laag is, zouden kleine aanpassingen in de carbogenatiesterkte voldoende zijn. Als de pH hoger is dan 7,45 bij carbogenatie, pas deze dan aan door enkele druppels van 1 M NaH2PO4-oplossing toe te voegen.</li>
		<li>Bereid 250 ml (per brein) van 1x hoogsucroseschijfoplossing in een bekerglas met 25 ml pre-oplossing van 10x plakjes en (in mM): 252 Sucrose, 26 NaHCO3en 10 glucose (tabel 3). Controleer of de osmolariteit tussen 320-325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6) ligt.</li>
		<li>Bubbel de high-sucrose slice oplossing gedurende 10-15 min met carbogen om de pH tussen 7.3–7.4 te regelen. OPMERKING: Als de pH hoger is dan 7,45 bij carbogenation, pas deze dan aan door een paar druppels 1 M KH2PO4-oplossing toe te voegen.</li>
		<li>Bewaar de high-sucrose slice oplossing 20-30 min in de ultravriezer (-80 °C) tot deze gedeeltelijk bevroren is.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van de werkruimte voor de hersendissectie
<ol><li>Bereid tijdens het afkoelen van de oplossing met hoge sacharoseschijf het volgende voor.<ol>
<li>Warm het waterbad op tot 32 °C.</li>
		<li>Vul de terugwinningskamer (figuur 2A) met de carbogenated ACSF-oplossing en plaats de kamer in het waterbad. Breng continu carbogen aan op de hoofd-ACSF-fles en de ACSF in de terugwinningskamer.</li>
		<li>Breng het dier naar de experimentele kamer. OPMERKING: De leeftijd, het geslacht en de stam van het dier moeten worden bepaald door de individuele experimenteerder en zijn afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag. De parameters van het dier moeten echter binnen één studie constant blijven om de vergelijkbaarheid tussen de verschillende experimentele dagen te garanderen. Dit protocol is ontworpen voor het gebruik van C57BL/6J mannelijke muizen op de leeftijd van 2-6 weken. Als oudere dieren worden gebruikt, moeten snij- en hersteloplossingen mogelijk dienovereenkomstig worden aangepast4,27 (bijv. NMDG+-gebaseerde oplossingen23,28) om de gezondheid van de hersenen van de acute plakjes te behouden.</li>
		<li>Bereid de anesthesiekamer voor.</li>
		<li>Leg tissuepapier, plastic Pasteur pipet met brede opening (opengesneden), 90 mm kweekschaal gevuld met ijs, een vierkant filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal, sterke schaar voor onthoofding, dissectieschaar, gebogen tang, spatel, 35 mm kweekschaal, fijne borstel, mes, monsterplaat (wordt geleverd met vibratome), superlijm, pipetpunt, vier riemen filterpapier (~ 2 cm x 0,5 cm) (figuur 2A).</li>
		<li>Stel de vibratome in: Programmeer eerst de vibratome voor de juiste instellingen (rijsnelheid van het blad: 0,08 mm/s, snijamplitude: 1,4 mm, snijfrequentie: 85 Hz) en bevestig de carbogenlijn in de snijkamer. Plaats vervolgens de snijkamer in de houder, vul de houder rond de snijkamer met ijs en bevestig alles aan de vibratome. Plaats ten slotte het scheermesje in de vibratome meshouder(afbeelding 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer na het invriezen van de hoog-sacharose-oplossing de volgende stappen uit.<ol>
<li>Haal na 20-30 minuten de high-sucrose slice oplossing uit de -80 °C ultravriezer en houd het bekerglas op ijs.</li>
		<li>Leg de high-sucrose oplossing naast de vibratome op je bankje, plet en meng de gedeeltelijk bevroren oplossing met een spatel om een lekkere slush te krijgen en begin te borrelen met carbogen.</li>
		<li>Neem wat high-sucrose slice oplossing met de plastic Pasteur pipet om het vierkante filterpapier bovenop de gekoelde 90 mm kweekschaal te weken.</li>
		<li>Vul de kweekschaal van 35 mm (of een equivalente kleine container die geschikt is om de hele hersenen op te slaan) tot 75% met de hoogsucrose-plakoplossing (voldoende om de hele hersenen te bedekken) en koel de kweekschaal op ijs die naast het bekerglas wordt bewaard met de rest van de oplossing. Karbogenate de oplossing in de 35 mm cultuurschaal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissectie en positionering van de murine hersenen
<ol><li>Verdoof het dier met 5% isofluraan. Bepaal de juiste diepte van anesthesie door de poot te knijpen. Er mag geen pootonttrekkingsreflex optreden.</li>
	<li>Breng het dier over op tissuepapier en onthoofd het met een sterke schaar of een kleine dierlijke guillotine.</li>
	<li>Gebruik een dissectieschaar om de hoofdhuid open te snijden.</li>
	<li>Snijd de calvaria langs de sagittale hechting open en verwijder deze met behulp van gebogen tang totdat de hele hersenen, inclusief de reukbollen, zichtbaar zijn. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de hersenen niet beschadigt met de scherpe randen van de calvaria of tang.</li>
	<li>Gebruik een spatel om de hersenen voorzichtig uit te scheppen (reukbollen moeten gehecht blijven).</li>
	<li>Breng de hersenen over in de gekoelde 35 mm kweekschaal en verwijder alle haar- of bloeddeeltjes uit het weefsel door de hersenen voorzichtig te wassen met een met ACSF gevulde Pasteur-pipet (bloed heeft cytotoxische effecten op hersenweefsel29).</li>
	<li>Breng de hersenen met behulp van de spatel over op het doorweekte filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal van 90 mm (figuur 2A).</li>
	<li>Gebruik een mes om de hersenen doormidden te snijden, de twee hemisferen te scheiden en beide hersenhelften aan de vers gesneden mediale kant te plaatsen.</li>
	<li>Gebruik een mes om het dorsale deel te verwijderen (5%–10%) van de hersenen van elke hemisfeer met een parallelle snede naar de rugtop (figuur 2C)30 en plaats beide hersenhelften aan de vers gesneden kant met het ventrale deel van de hersenen naar boven gericht.</li>
	<li>Plaats een druppel superlijm op de monsterplaat en spreid deze goed uit met een pipetpunt om beide hemisferen te huisvesten.</li>
	<li>Gebruik een filterpapierriem om één halfrond met capillaire krachten op te pakken door de ventrale kant aan te raken met de filterpapierband, waardoor het weefsel niet wordt beschadigd.</li>
	<li>Gebruik een andere filterpapierband om de dorsale kant van de hersenen voorzichtig halfdroog te drogen voordat u de hersenhelft met de rugzijde op de lijm op de monsterplaat plaatst. Herhaal dezelfde procedure met de tweede hemisfeer. OPMERKING: De hemisferen moeten op een gespiegelde manier in horizontale uitlijning op de vibratomeplaat worden geplaatst, waarbij de rostrale zijden naar buiten wijzen en de caudale zijden naar elkaar gericht (maar niet aanraken) in het midden. De mediale zijden van beide hemisferen moeten naar het vibratomeblad en de zijkanten naar de experimenteerder wijzen (figuur 2D).</li>
	<li>Plaats de monsterplaat in de snijkamer en bedek deze snel, maar voorzichtig, met ijskoude high-sucrose slice solution slush. Zodra de oplossing de lijm raakt, zal deze stollen en de hemisferen correct op de monsterplaat lijmen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de hemisferen goed zijn bedekt met hoogsucrose slice-oplossing en bevestig dat de oplossing is bubbels met carbogen. OPMERKING: De hele dissectieprocedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de hersenen niet blijven zonder de toevoer van zuurstof voor een zeer lange tijd. Het duurt slechts ongeveer 1-1,5 minuut van onthoofding tot hersenonderdompeling in de high-sucrose slice oplossing slush. Dit is de meest kritieke vereiste voor acute brain slice preparaten om een hoge kwaliteit van de plak te garanderen.</li>
</ol>4. Horizontaal snijden van de hersenen
<ol><li>Plaats het vibratomeblad voor de mediale kant van de hemisferen en verlaag het tot dezelfde hoogte als de ventrale zijden van de hemisferen die nu naar boven gericht zijn. Laat het zaagblad met behulp van de vibratomeregeling verder in de dorsale richting zakken tot 600 μm en begin met snijden. Het mes moet het weefsel raken (zo niet, draai het mes om en laat het iets meer zakken). Snijd tot de eerste twee plakjes volledig van de twee hemisferen zijn gescheiden.</li>
	<li>Draai het mes om en laat nog eens 300 μm zakken en snijd opnieuw.</li>
	<li>Wanneer de hippocampus zichtbaar wordt (gebruik indien nodig de muis31 hersenatlas voor hulp) (figuur 2E) verzamel de plakjes met de verbrede plastic Pasteur pipet. Verzamel de plakjes totdat de caudate putamen zichtbaar wordt naast de hippocampus. Meestal kunnen tussen 8-12 plakjes van 300 μm (4-6 per halfrond) worden verzameld voor de muishersenen.</li>
	<li>Gebruik de plastic Pasteur pipet om de plakjes te verzamelen en over te brengen naar de terugwinningskamer in het waterbad(afbeelding 2F) (verzamel plakjes na elke snijronde om te voorkomen dat ze rondzweven in de snijkamer). OPMERKING: Werk zo snel mogelijk en zorg ervoor dat de hoogsucrose slice-oplossing ijskoud is en gedurende de hele procedure wordt gecarbogen. Vul indien nodig het ijs rond de snijkamer bij.</li>
</ol>5. Herstel van hersenplakken voor elektrofysiologische opnames
<ol><li>Laat de plakjes in de met ACSF gevulde terugwinningskamer gedurende 1 uur in het waterbad van 32 °C. OPMERKING: Herstelkamers zijn ook in de handel verkrijgbaar.</li>
	<li>Haal de herstelkamer uit het waterbad.</li>
	<li>Plaats de plakjes minstens nog 30 minuten op RT voor herstel voordat u met een verdere toepassing begint.</li>
</ol>6. fEPSP-opnames in het mediale perforantpad (MPP) van de hippocampus
<ol><li>Trek opnamepizetten van borosilicaatglascapillairen met een horizontale pipettrekker om pipetten ter grootte van ~ 2 MΩ te ontvangen wanneer ze zijn gevuld met ACSF-oplossing en ondergedompeld in de met ACSF gevulde opnamekamer.</li>
	<li>Vul ACSF-badoplossing en ACSF-oplossing met de juiste chemicaliën (bijv. Bicuculline) in een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem met meerdere vaten dat op de opnamekamer is aangesloten. Continu alle oplossingen karbogen.</li>
	<li>Schakel een peristaltische of vacuümpomp in die is aangesloten op een zuigslang die tegenover de perfusielijn in de opnamekamer eindigt. Open het met ACSF gevulde vat en begin een continue stroom vast te stellen (1-2 druppels per seconde). Controleer of de referentieelektrode is ondergedompeld in de ACSF-oplossing.</li>
	<li>Schakel de installatiecomputer, de versterker, de micromanipulator, de stimulator, de microscooplamp(s), de camera en de monitor (indien van toepassing) in.</li>
	<li>Open de juiste software voor elektrofysiologische opnames (er bestaan verschillende hardware- en softwareleveranciers voor elektrofysiologische apparatuur).</li>
	<li>Breng één hersenschijfhersenhelft over van de herstelkamer naar de opnamekamer van de plakopstelling en plaats deze in de juiste richting met de dentate gyrusgranulaatcellaag en de moleculaire laag in het gezichtsveld. Zorg ervoor dat de stimulatie-elektrode het MPP in de plak kan bereiken vanuit de richting van de entorhinale cortex en dat de opname-elektrode toegang heeft tot het MPP vanaf de precies tegenovergestelde kant vanuit de richting van CA3.</li>
	<li>Stabiliseer het segment in de opnamekamer met een paperclip (figuur 3A) of een in de handel verkrijgbaar hersenschijfraster. OPMERKING: Het kan handig zijn om de perfusie uit te schakelen tijdens het overbrengen en positioneren van plakjes. Dit mag echter niet te lang duren om de kwaliteit van de hersenschijf te garanderen.</li>
	<li>Verlaag en plaats de opname- en stimulatie-elektroden in het MPP in het onderste derde deel van de moleculaire laag dicht bij de korrelcellaag(figuur 3B),tegenover elkaar op een afstand van ongeveer 100-150 μm. De stimulatie-elektrode moet minimaal contact maken met het oppervlak, terwijl de opname-elektrode de bovenste plaklaag enigszins moet infiltreren.</li>
	<li>Breng een stimulus met een lage intensiteit (30-50 μA gedurende 0,1 ms) aan op de hersenschijf om het fEPSP-signaal te verkrijgen. Pas indien nodig de positie van de elektroden aan (bijv. laag of atypisch gevormd fEPSP-signaal).</li>
	<li>Begin met het opnemen van Input-Output curven: breng toenemende stimulusintensiteiten toe op het hersensegment in intervallen van 30 s.</li>
	<li>Stel de stimulusintensiteit in op 50% van de maximale fEPSP-respons en start baseline fEPSP-opnames waarbij de 50% stimulus-intensiteit gedurende 20-40 minuten in intervallen van 30 s op het hersensegment wordt toegepast.</li>
	<li>Als de basislijn stabiel lijkt te zijn, gaat u verder met aanvullende opnamen (bijv. LTP/LTD-protocollen en/of geneesmiddeltoepassingen). (Voor LTP-inductie in het MPP werd hier een protocol gebruikt dat bestond uit vier keer 1 s 100 Hz pulsen die in een interval van 5 min werden toegepast. Bicuculline werd 10 minuten voor en tijdens de conditioneringsfase aangebracht.) OPMERKING: Alle opnamen moeten worden uitgevoerd in de huidige klemmodus met de juiste low-pass filtering (<5 kHz) en sampling rates (>10 kHz).</li>
	<li>Pak de gegevens uit in een geschikte bestandsindeling en analyseer fEPSP-parameters, zoals fiber volley, fEPSP amplitude en fEPSP-helling.</li>
</ol>7. Calcium beeldvorming opnames van hersenen plakjes
<ol><li>Breng een hersenschijf halfrond over in een 12-put kamer en laad deze gedurende 30 minuten tot 1 uur met een geschikte calciumkleurstof. Carbogeneer continu de laadoplossing door een carbogenatiebuis door een zelfgemaakt gat (met een hete 18G-naald) in het deksel van de 12-putplaat te steken. OPMERKING: Deze stap is niet nodig in het geval van hersenschijfpreparaten van genetisch gemodificeerde dieren die endogeen een fluorescerende verslaggever zoals GCaMP uitdrukken.</li>
	<li>Bereid de opname-instelling voor zoals beschreven in stap 6.2–6.5. OPMERKING: Er zijn geen versterkers of micromanipulator nodig voor microfluorimetrische beeldvormingsexperimenten. Het gebruik van een stimulator is experimentafhankelijk. Specifieke software voor fluorescentie-beeldvormingsexperimenten is essentieel.</li>
	<li>Pas de software aan de juiste beeldinstellingen aan: dit omvat cameraversterker en binning-instelling, instelling van de golflengte, belichtingstijd en timingprotocol. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van de exacte experimenten. (Voor de voorbeeldsporen werd 1 x 1 binning, 2,4x voorversterkerwinst, 300 EM-camerawinst, belichting van 50 ms bij 488 nm herhaald om de 500 ms gedurende de duur van het experiment gebruikt.)</li>
	<li>Breng na het laden met de calciumkleurstof de hersenschijfhelft over van de 12-put naar de opnamekamer en plaats deze op het microscoopstadium.</li>
	<li>Stabiliseer het segment in de opnamekamer met een paperclip (figuur 3A) of een in de handel verkrijgbaar hersenschijfraster vergelijkbaar met het in stap 6.7 beschreven.</li>
	<li>Zorg ervoor dat het interessegebied zich in het juiste microscopische veld en in focus bevindt.</li>
	<li>Gebruik de fluorescentiebeeldvormingssoftware om verschillende interessegebieden (ROC's) op uw segment te selecteren. OPMERKING: Het kan handig zijn om het hele gezichtsveld te selecteren om de algemene helderheidsschommelingen te volgen als gevolg van fotobleaching.</li>
	<li>Start de opname en breng de experimentele testgeneesmiddelen aan op de gekozen tijdstipen. OPMERKING: Het is raadzaam om aan het einde van elk experiment een hoge K+ -oplossing toe te passen om het neuronale karakter van de cellen en de segmentkwaliteit te verifiëren.</li>
	<li>Pak de gegevens uit in een geschikte bestandsindeling en analyseer de fluorescentiesignaalveranderingen die gedurende de hele meting in de ROC's optreden. ROI's kunnen ook worden aangepast tijdens de off-line analyse. OPMERKING: Andere protocollen die fEPSP-opnamen en calciummicrofluorimetrie in hersensegmenten beschrijven , zijn beschikbaar in literatuur24,32,33,34,35.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel vaak gebruikt onder de neurowetenschappen gemeenschap, hersenen slice preparaten worden ook geconfronteerd met verschillende nadelen. Invoer- en uitvoerverbindingen met de interessegebieden van de hersenen zijn bijvoorbeeld niet langer verbonden in een hersensegment. Bovendien begint het weefsel, eenmaal geïsoleerd, langzaam af te smelten in de loop van de tijd en dit proces kan de fysiologische omstandigheden van het hersensegment veranderen. Dit onderwerp in het bijzonder is zeer zorgwekkend omdat de meeste opnames van hersensegmenten enkele minuten tot uren duren, wat resulteert in lange experimentele dagen met opnames uitgevoerd op weefsel dat tot 6-8 uur voor het begin van het experiment werd geïsoleerd. Bovendien worden de cerebrospinale vloeistof en bloedcirculatie onderbroken tijdens plakjepreparaten, wat kan leiden tot het ontbreken van belangrijke endogene verbindingen in een hersenschijf. En het meest duidelijk is dat de snijprocedure zelf mechanische weefselschade kan veroorzaken die de verkregen resultaten in gevaar kan brengen. De werkelijke voordelen van hersenschijfpreparaten wegen echter nog steeds op tegen hun nadelen, daarom presenteren ze een zeer gewaardeerde en gebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek.
Acute hippocampale hersensegmenten vormen een krachtige en daarom veel gebruikte techniek om neuronale processen te onderzoeken van moleculair niveau tot complexe hersencircuitstudies. Dit is gebaseerd op de ideale neuroanatomie van de hippocampus die gemakkelijk kan worden bewaard in een plakbereiding18. Bijgevolg worden hippocampale hersensegmenten gebruikt in een breed scala aan wetenschappelijke onderzoeksprojecten, waaronder geneesmiddelenscreenings17, studies naar neuronale en synaptische eigenschappen die betrokken zijn bij cognitieve functies40,41, en onderzoeken naar pathologische hersenaandoeningen14,42,43. Een breed spectrum van verschillende toepassingen veroorzaakt echter ook een breed scala aan beschikbare segmentvoorbereidingsprotocollen die kunnen verschillen in verschillende parameters, zoals dissectieomstandigheden en snijvlakoriëntatie, onder andere. Daarom moet de exacte onderzoeksvraag van een wetenschappelijk project worden bepaald om een geschikt plakvoorbereidingsprotocol te kiezen.
De tissue chopper presenteert een van de oudste gebruikte technieken om hippocampale hersenschijfjes44, 45te bereiden. De belangrijkste voordelen van deze bereidingsmethode zijn de lage kosten van de chopper en het snelle en gemakkelijke gebruik46. Weefselhakselaars veroorzaken echter mechanische stress die resulteert in morfologische veranderingen en celdood47. Ter vergelijking: de vibratome is een vrij dure machine en de tijd voor de bereiding van de plakjes wordt aanzienlijk verhoogd, wat van invloed kan zijn op de kwaliteit van de plak. De vibratome biedt echter meestal een zachtere manier om de plakjes van het weefsel te scheiden en maakt het mogelijk om de hersenen mooi gekoeld en zuurstofrijk te houden gedurende de hele isolatieprocedure, waardoor de plakeigenschappen worden verbeterd46. Daarom maken verschillende groepen standaard gebruik van deze techniek en hebben ze protocollen voorgesteld voor de voorbereiding van acute hippocampale hersensegmenten met behulp van de vibratome16,30,48. Hoewel sommige protocollen slechts een paar details bieden voor het snijden zelf, maar zich eerder richten op een specifieke toepassing van een dergelijke segmentvoorbereiding48, bieden andere gedetailleerde segmentprotocollen die verschillen in snijvlak of andere protocoldetails (bijv. agarose-inbeddings - of slice/recovery-oplossingen) die in dit artikel27,30worden gegeven .
Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige methode om acute horizontale hippocampale muishersenenschijfjes van hoge kwaliteit van jonge dieren te bereiden. Het protocol is bijzonder nuttig om het perforantpad (mediaal en lateraal) te behouden dat het hippocampale invoerpad presenteert, dat projecteert van de entorhinale cortex naar de hippocampus8,49,50. Sagittale, coronale, evenals geïsoleerde hippocampus transversale plakpreparaten behouden het perforantpad niet goed, dat voornamelijk afkomstig is uit lagen II en V van de entorhinale cortex en projecten naar verschillende gebieden binnen de hippocampus18. Vanwege de anatomische positionering van de entorhinale cortex ten opzichte van de hippocampus zijn horizontale hersensegmenten een noodzaak om volledig intacte perforante padvezels binnen de plakvoorbereiding te behouden31. Bovendien behoudt horizontaal snijden idealiter de bemoste vezels die projecteren van de dentate gyrus naar de CA3-neuronen in de hippocampus9,30,50. Daarom is deze bereidingsmethode van grote waarde voor studies die hippocampale inputtrajecten en DG-gerelateerde processen onderzoeken. Bovendien maakt dit protocol het onderzoek van het Schaffer collateral pathway50mogelijk . Sagittale en coronale brain slice preparaten worden echter vaker gebruikt bij het onderzoeken van CA3 tot CA1 vezelprojecties, vermoedelijk vanwege hun iets snellere bereidingstijd die de kans op het verkrijgen van plakjes van hoge kwaliteit kan vergroten. Niettemin vormen horizontale hippocampale segmentpreparaten een krachtig onderzoeksinstrument, omdat het het behoud en onderzoek van alle hippocampale vezelroutes binnen één segment halfrond mogelijk maakt. Dit kan met name nuttig zijn wanneer circuitreacties worden bestudeerd, bijvoorbeeld in multi-elektrodetestopnamen.
Een grote zorg bij het bereiden van hersenschijfjes is het goed bewaren van het hersenweefsel. Dit wordt bereikt door verschillende kritieke stappen in ons protocol, waaronder een snelle dissectie, de continue en voldoende oxygenatie en koeling van het weefsel en de bescherming van het hersenweefsel door gebruik te maken van de beschermende snijmethode met een natriumarme, hoogsucrose snijoplossing39,51. Ondanks het feit dat het hier beschreven protocol een slagingspercentage van ongeveer 90% oplevert, kunnen mogelijk aanvullende beschermende stappen nodig zijn bij het werken met weefsel afkomstig van oudere of genetisch diverse dieren of bij het proberen een specifieke celpopulatie te behouden. Verschillende methoden werden al gemeld om gevoelige hersenweefselpreparaten te beschermen. Deze methoden omvatten het gebruik van op NMDG gebaseerde snijoplossingen om de natriumpermeatie52te verminderen , het gebruik van hoge magnesiumgehalten in de snijoplossing om NMDA-receptoractiviteit53te blokkeren , en het langdurige gebruik van beschermende oplossingen ook tijdens de herstelperiode23. Al deze maatregelen zullen resulteren in een verminderde excitotoxiciteit. Bovendien wordt vaak een transcardiale perfusie met ijskoude beschermende ACSF-oplossingen gebruikt en noodzakelijk bij het werken met oudere dieren27.
Acute hippocampale hersenplakken zijn bij uitstek geschikt en worden veel gebruikt voor elektrofysiologisch onderzoek om redenen zoals de hoge amplitudesignalen die kunnen worden verkregen uit een relatief dikke (300-500 μm) acute hersenschijf, die een hoge signaal-ruisverhouding11garandeert. Standaard gebruikte elektrofysiologische toepassingen omvatten extracellulaire veldopnamen en intracellulaire hele celopnamen in een spannings- of stroomklemmodus. Om elektrofysiologische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, is de gezondheid van de segmenten van primair belang en kan worden gegarandeerd door het gepresenteerde protocol strikt te volgen. Aangezien plakpreparaten echter een zeer gevoelige techniek vormen, moet een kwaliteitscontrole routinematig worden opgenomen vóór het begin van elk experiment. Verschillende parameters kunnen worden gebruikt als kwaliteitscontrole van het segment en worden standaard beoordeeld via input-outputcurven en baseline fEPSP - of EPSC-opnamen19. Niettemin moet worden opgemerkt dat suboptimale elektrofysiologische eigenschappen kunnen voortvloeien uit experimentele fouten zoals elektrodepositionering, oriëntatie of zelfs schade en niet alleen de gezondheid van de bereide plak vertegenwoordigen. Daarom is het raadzaam om aanvullende kwaliteitscontroles uit te voeren, zoals eenvoudige visualisatie en beoordeling van de cellen onder een 40x-doelstelling of een DAPI-kernkleuring. Dergelijke kwaliteitscontroles kunnen worden gebruikt om de constante segmentstatus tijdens verschillende segmentvoorbereidingssessies te bevestigen.
Calciummicrofluorimetrie presenteert een minder vaak gebruikte techniek om hippocampale hersensegmenten te bestuderen. Deze techniek is echter van toegevoegde waarde voor de standaard extracellulaire en intracellulaire elektrode-opnamen, omdat het intracellulaire calciumfluxen kan visualiseren en kwantificeren, die van groot belang zijn bij neuronale en synaptische signalering. Veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties zijn betrokken bij de afgifte van neurotransmitterblaasjes, postynaptische potentiële generatie, regulering van synaptische plasticiteit en axonale zenuwgeleiding54,55,56. Ter illustratie van deze techniek(figuur 4)hebben we gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare calciumkleurstof. Ontegenzeggelijk kan de behandeling van weefselplakken met calciumkleurstoffen problemen opleveren, zoals een verhoogd experimenteel tijdsbestek en inefficiënte belasting van lager gelegen neuronale cellen. Variaties op deze techniek kunnen echter worden gebruikt om deze technische uitdagingen te omzeilen. Het is bijvoorbeeld mogelijk om calciummetingen en patchklemopnames in hippocampale plakjes te combineren. Op deze manier kan een calcium-fluorescerende kleurstof via de patchpipet in een specifieke cel worden geladen, waardoor de metingen van de calciumdynamiek in één specifieke cel van belangzijn 57. Als alternatief kunnen genetisch gemanipuleerde dieren die de calciumindicator uitdrukken, GCaMP58, hetzij in de hele hersenen, hetzij aangedreven door een celspecifieke promotor, worden gebruikt. Interessant is dat hersenweefsel van GCaMP-dieren met een directe linker naar een eiwit van belang mogelijkheden kan bieden om het neuronale expressiepatroon te bepalen of de betrokkenheid bij calciumvonken en golven te onderzoeken.
Al met al bieden we de richtlijnen voor de succesvolle voorbereiding van gezonde en levensvatbare horizontale hippocampale hersenplakken van muizen voor elektrofysiologische en beeldvormingsopnames. Deze methodologie is zeer nuttig om toegang te krijgen tot neurologische veranderingen die optreden in hersenpathologieën die worden beschreven in de dentaat gyrus.

De uitgebreide verkenning van de hippocampus begon toen Scoville en Milner het onvermogen van een patiënt (H.M.) meldden om nieuw, declaratief geheugen te vormen na chirurgische verwijdering van de hippocampus en nabijgelegen temporale kwabstructuren als een behandeling voor ernstige epilepsie1. Vanaf dat moment is de hippocampus uitgebreid bestudeerd, beginnend met algemene neuronale eigenschappen en functies tot de ontwikkeling van ernstige hersenaandoeningen, zoals epilepsie en de ziekte van Alzheimer2,3,4,5. De hippocampus maakt deel uit van het limbische systeem, bestaande uit een groep verwante hersenstructuren die betrokken zijn bij emotie en geheugenvorming6,7. Een dicht netwerk van verschillende vezelroutes bereikt een nauwe hippocampale connectiviteit met interne en externe hersenstructuren. Deze paden omvatten het mediale en laterale perforantpad (entorhinale cortex om gyrus, CA3 – CA1 en subiculum te deuken)8,het bemoste vezelpad (dentaat gyrus tot CA3)9 en het Schaffer collateral/associational commissural pathway (CA3 tot CA1)10 (Figuur 1). De hippocampus presenteert een van de meest breed verkende hersengebieden tot nu toe vanwege de sterk geconserveerde laminaire organisatie van de neuronale laagvorming en de mogelijkheid om vitale neuronale culturen en hersensegmenten met relatief gemak te verkrijgen5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg"> Figuur 1: Cartoon ter illustratie van de verschillende hippocampale regio's en belangrijkste vezelroutes. De verschillende hippocampale gebieden worden aangegeven door effen gekleurde lijnen: entorhinale cortex (EC; zwart), dentate gyrus (DG; oranje), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyaan), 2 (geel) en 1 (magenta) en het subiculum (groen). Vezelpaden worden weergegeven met een gekleurde stippellijn: het mediale (MPP, rood) en het laterale perforantpad (LPP, blauw) (van de entorhinale cortex tot de dentaat gyrus, CA3, CA1 en subiculum), de bemoste vezelroute (MF, violet) (van de dentate gyrus naar CA3) en de Schaffer collateral (SC, brown) (ipsilateral van CA3 naar CA1)/associational commissural pathways (AC, lichtgroen) (contralaterale van CA3 naar CA1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Hersensegmentprotocollen leiden vaak tot het verlies van verbindingen van verder weg gelegen hersengebieden naar het interessegebied5. Bovendien zijn de haarvaten niet langer functioneel5 en wordt de bloedcirculatie beroofd11. Ondanks deze beperkingen worden hersenplakken nog steeds voornamelijk gebruikt voor het onderzoek naar neurofysiologische functies van de hippocampus vanwege een aantal voordelen. Ten eerste is de extractie van de hippocampus snel12 en vereist niet veel materialen. De enige essentiële instrumenten zijn een dissectiekit, een laboratoriumwaterbad, toegang tot carbogen en een trillende microtome (vibratome)13. Andere troeven van de hersenschijftechniek zijn de omzeiling van de bloed-hersenbarrière (BBB) en de wash-out van endogeen vrijgekomen moleculen vóór het begin van het experiment5, waardoor het mogelijk is het effect van geneesmiddelen met relatief nauwkeurige doseringscontrole te bestuderen14. Bovendien behouden hersensegmenten de cyto-architectuur en synaptische circuits binnen de hippocampus15,16, waar de neuroanatomie en de lokale omgeving met neuronale connectiviteit en complexe neuron-glia-interacties behouden blijven4,11,17. Bovendien zijn hippocampale vezelverbindingen overwegend unidirectioneel en hippocampale neuronen hebben een hoge synaptische plasticiteit, wat de verzameling en interpretatie van hoogwaardige elektrofysiologische opnames enorm vereenvoudigt om neurologische processen te begrijpen18,19. Belangrijk is dat hersensegmenten een waardevol goed vormen dat toepasbaar is in een breed scala aan verschillende wetenschappelijke technieken, variërend van moleculaire biologische technieken over beeldvormingsopnamen tot elektrofysiologische metingen12,20,21,22,23,24,25,26.
Zoals hierboven beschreven, hippocampale hersensegmenten presenteren een krachtig experimenteel hulpmiddel om structurele en functionele kenmerken van de synaptische connectiviteit te bestuderen. Dit biedt de mogelijkheid om de effecten van chemicaliën of mutaties op neuronale prikkelbaarheid en plasticiteit te beoordelen16.
Acute hersenschijfpreparaten vormen een relatief gevoelige techniek en de optimale snijkwaliteit is sterk afhankelijk van ideale experimentele omstandigheden, waaronder de leeftijd van het dier, de euthanasiemethode, de snelheid van dissectie en snijden, de snijoplossingen en parameters (bijv. snijsnelheid) en de omstandigheden voor plakherstel4. Daarom is een goed ontworpen protocol van het grootste belang en beveiligt het de reproduceerbaarheid in verschillende onderzoekseenheden13.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor acute horizontale hippocampale plakpreparaten, met als doel de integriteit van het hippocampale laterale en mediale perforantpad en het bemoste vezelpad te behouden, waardoor het onderzoek naar dentaat gyrusgerelateerde processen mogelijk is9. We zullen in detail de belangrijkste stappen beschrijven om de murinehersenen te ontleden, te extraheren en horizontaal te snijden, gevolgd door representatieve resultaten van calcium-microfluorimetrische opnamen en veldopwekkende postsynaptische potentiële opnames (fEPSP's) onder basisomstandigheden en tijdens LTP-inductieprotocollen in hersensegmenten van wilde type C57BL/6J-muizen.

<table><tbody><tr><td>Anesthesia chamber</td><td>home made - Generic</td><td>N/A</td><td>plexiglas</td></tr><tr><td>Anesthesia vaporizer</td><td>Dr&auml;ger &amp; MSS International Ltd</td><td>Isoflurane Vapor 19.3 &amp; MSS Isoflurane</td><td>om isofluraang te verdampen voor anesthesie bij knaagdieren</td></tr><tr><td>Barrels for the perfusion system</td><td>TERUMO</td><td>Hypodermic syringes without needle</td><td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td></tr><tr><td>Bicuculline methiodide</td><td>hellobio</td><td>HB0893</td><td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td></tr><tr><td>Borosilcate glass capillaries</td><td>Science Products</td><td>GB150F-8P</td><td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td></tr><tr><td>Calcium chlorid dihydrate</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Calcium Imaging software</td><td>Till Photonics</td><td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen tank</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz mix B50</td><td>Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5</td></tr><tr><td>Cluster microelectrode</td><td>FHC</td><td>CE2C55</td><td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td></tr><tr><td>Culture dish (35 mm)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353001</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&reg;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td></tr><tr><td>Culture dish (90 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11270-20</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>hellobio</td><td>HB0225</td><td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16301</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&amp;region=BE</td></tr><tr><td>Digital CMOS camera</td><td>HAMAMATSU</td><td>ORCA-spark C11440-36U</td><td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-09</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&reg;/14058-09</td></tr><tr><td>DNQX</td><td>hellobio</td><td>HB0262</td><td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td><td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td></tr><tr><td>EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895278</td><td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>VWR</td><td>516-0818</td><td>grade 413</td></tr><tr><td>Fine brush</td><td>Raphael Kaerell</td><td>8204</td><td>Size #1</td></tr><tr><td>18G needle</td><td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td><td>18G X 1 1/2" 4710012040</td><td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>250 ml fles</td></tr><tr><td>Loctite 406</td><td>Henkel Adhesive technologies</td><td>Loctite 406</td><td>Superlijm</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>SM-10 with SM-7 remote control system</td><td>https://www.luigs-neumann.org</td></tr><tr><td>Microscope (for calcium imaging)</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td></tr><tr><td>Microscope (for ephys recordings)</td><td>Zeiss</td><td>Axio Examiner.A1</td><td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td></tr><tr><td>Microscope light source</td><td>CAIRN Research</td><td>dual OptoLed power supply</td><td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Till Photonics</td><td>Polychrome V</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&amp;region=BE</td></tr><tr><td>Oregon Green&reg; 488 BAPTA-1</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>#06807</td><td>10x50ug</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Wescor</td><td>5500 vapor pressure osmometer</td><td>om osmolariteit van zout oplossingen te verifiëren</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Masterflex C/L 77120-62</td><td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>WTW</td><td>inoLab series pH 720</td><td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td></tr><tr><td>Potassium chlorid</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.11

horizontale hippocampal plakjes van de hersenen van de muis

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

De hippocampus is een sterk georganiseerde structuur in de hersenen die deel uitmaakt van het limbische systeem en betrokken is bij geheugenvorming en consolidatie, evenals de manifestatie van ernstige hersenaandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer en epilepsie. De hippocampus krijgt een hoge mate van intra- en interconnectiviteit, waardoor een goede communicatie met interne en externe hersenstructuren wordt gewaarborgd. Deze connectiviteit wordt bereikt via verschillende informatiestromen in de vorm van vezelbanen. Hersensegmenten zijn een veelgebruikte methodologie bij het verkennen van neurofysiologische functies van de hippocampus. Hippocampale hersensegmenten kunnen voor verschillende toepassingen worden gebruikt, waaronder elektrofysiologische opnames, licht microscopische metingen en verschillende moleculaire biologische en histochemische technieken. Daarom vertegenwoordigen hersensegmenten een ideaal modelsysteem om eiwitfuncties te beoordelen, om patofysiologische processen te onderzoeken die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen en voor drugsontdekkingsdoeleinden.
Er bestaan verschillende manieren om preparaten te snijden. Brain slice preparaten met een vibratome zorgen voor een betere conservering van de weefselstructuur en garanderen een voldoende zuurstoftoevoer tijdens het snijden, wat voordelen biedt ten opzichte van het traditionele gebruik van een tissue chopper. Bovendien kunnen verschillende snijvlakken worden toegepast voor vibratome brain slice preparaten. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor een succesvolle voorbereiding van vibratome-gesneden horizontale hippocampale plakjes muishersenen. In tegenstelling tot andere segmentpreparaten maakt horizontaal snijden het mogelijk om de vezels van het hippocampale invoerpad (perforantpad) in een volledig intacte toestand binnen een segment te houden, wat het onderzoek naar entorhinal-hippocampale interacties vergemakkelijkt. Hier bieden we een grondig protocol voor de dissectie, extractie en acute horizontale snijden van het murine-brein en bespreken we uitdagingen en mogelijke valkuilen van deze techniek. Tot slot zullen we enkele voorbeelden laten zien voor het gebruik van hersensegmenten in verdere toepassingen.

Algemeen overzicht van tools en kritieke stappen die nodig zijn voor het protocol Figuur 2 bevat alle benodigde hulpmiddelen en kritieke stappen voor de voorbereiding van horizontale acute hippocampale hersensegmenten zoals beschreven in dit protocol. Over het algemeen zijn een beperkt aantal belangrijke instrumenten vereist, waaronder een paar dissectiegereedschappen en een plakterugwinningskamer (figuur 2A),een laboratoriumwaterbad en een vibratome (figuur 2B). Figuur 2C–E visualiseert belangrijke stappen en oriëntaties van de hersenen en hemisferen tijdens het slice preparation protocol. Figuur 2F is een illustratie van een verwacht resultaat van horizontale hersensegmenten.
fEPSP-opnamen in het mediale perforantpad Na de herstelperiode kunnen de hersenplakken worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames van fEPSP's. Hier gebruikten we een rechtopstaande microscoop uitgerust met een meerkanaals zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem(figuur 3A en figuur 3B). Een glazen micropipette (~ 2 MΩ) werd gevuld met ACSF-oplossing en bevestigd bovenop een met chloride gecoate zilveren elektrode die is gemonteerd op een operationele versterker in circuit met een gechloreerde badelektrode. fEPSP's werden opgenomen en gevisualiseerd met een versterker en geschikte opnamesoftware door de glazen micropipette in het MPP van de hippocampus in de bovenste laag van de hersenschijf te plaatsen. fEPSP's werden geïnduceerd door stimulatie met een 2-contact cluster microelectrode, waarbij verschillende stroomintensiteiten werden toegepast op het MPP stroomopwaarts van de opnameelektrode. Merk op dat dit protocol niet bedoeld is om uit te leggen hoe U MPP-opnamen verkrijgen, maar gebruikt eenvoudig opnames in het MPP als voorbeeld om het succes van het hier beschreven segmentvoorbereidingsprotocol aan te tonen. Als iemand MPP-opnamen probeert uit te voeren, kunnen bepaalde besturingselementen (bijv. gekoppelde pulsopnamen) nodig zijn om de juiste opnamelocatie te garanderen en het MPP te onderscheiden van de LPP8,36,37.
Figuur 3C illustreert een negatief (linkerpaneel, segment van lage kwaliteit) en positief (rechterpaneel, segment van hoge kwaliteit) voorbeeld van een fEPSP-opname. Het negatieve voorbeeldspoor toont een grote vezelvolleybal (FV) amplitude die zelfs hoger is dan de werkelijke fEPSP-amplitude (≈0,5 mV). Het voorbeeld van een segment van hoge kwaliteit (rechterpaneel) toont daarentegen een kleine FV-fEPSP-verhouding en een hoge fEPSP-amplitude (>0,5 mV). De vezelvolleybal is het signaal dat optreedt bij depolarisatie van de gestimuleerde neuronale vezels en gaat daarom vooraf aan de postsynaptische potentiëring (fEPSP). De relatie van FV met fEPSP-eigenschappen biedt belangrijke informatie over het behoud van de axonale en synaptische eigenschappen. Plakjes van hoge kwaliteit met intacte zenuwvezels moeten een hoge fEPSP-amplitude/FV-verhouding vertonen. Integendeel, segmenten van lage kwaliteit met verminderde geleidingseigenschappen hebben een verminderde fEPSP-fV-verhouding. Evenzo kan de levensvatbaarheid van een hersensegment worden geanalyseerd door fEPSP-hellingen te plotten versus de vezelvolleybalitudes (figuur 3D).
Bovendien worden input-outputcurven (fEPSP-helling en FV-amplitude ten opzichte van stimulusintensiteit) standaard gebruikt om de segmentkwaliteit te bepalen. Dergelijke curven worden verkregen door toenemende stroomprikkels toe te passen op het hersensegment en door de daaropvolgende fEPSP-reacties te monitoren. Hersensegmenten van lage kwaliteit vertonen een verminderde input-outputcurve als gevolg van suboptimale geleidingseigenschappen van slecht bewaard hersenweefsel (figuur 3E,F). Bovendien zijn input-outputcurven nodig om het ideale stimulatie-intensiteitsbereik voor het onderzoek van synaptische processen te definiëren. Idealiter moet de stimulusintensiteit worden ingesteld rond 50% van de intensiteit voor maximale reacties. Bij deze gekozen stimulusintensiteit zijn de fEPSP-reacties zeer gevoelig voor veranderingen in synaptische plasticiteit, wat de mogelijkheid biedt om zowel langdurige potentiëring (LTP) als langdurige depressie (LTD) te onderzoeken.
Om de synaptische plasticiteit te bestuderen, wordt de synaptische overdracht van het hersensegment (fEPSP-helling) bij de gekozen 50% stimulusintensiteit gedurende een langere periode (meestal tussen 20-40 minuten) vóór de conditioneringsfase gecontroleerd. Levensvatbare hersensegmenten hebben stabiele basislijnen, terwijl hersensegmenten met een onstabiele basislijn niet kunnen worden gebruikt voor verdere conditioneringsprotocollen om synaptische plasticiteit van de hersencircuits te bestuderen(figuur 3G,bovenste paneel). fEPSP baseline opnames kunnen ook nuttig zijn om de effecten van geneesmiddelen op synaptische transmissie zelf te monitoren(figuur 3G,onderste paneel). Het gemiddelde van de geregistreerde fEPSP-basislijnsignalen wordt meestal gebruikt om een fEPSP-tijdcursus te normaliseren en is standaard ingesteld op 100%.
Synaptische plasticiteit kan worden bestudeerd door specifieke conditioneringsprotocollen toe te passen op de hersensegmenten. Deze protocollen zijn afhankelijk van het onderzochte hersencircuit en het mechanisme van belang (bijv. LTP of LTD). Om LTP in het MPP van de dentate gyrus op te wekken, is een sterk conditioneringsprotocol nodig vanwege de sterke GABAergetische remming die aanwezig is bij de MPP-synapsen38. Er wordt gemeld dat de GABAerge remming nog meer uitgesproken is in hersenschijfjes bereid met hoog-sacharose snijoplossingen39. Hier gebruiken we een protocol bestaande uit vier stimulaties van 1 s lange 100 Hz pulsen toegepast in een interval van 5 minuten tijdens de behandeling met de GABAA receptor antagonist Bicuculline(figuur 3H). De co-toevoeging van NMDA en Bicuculline tijdens de conditioneringsperiode resulteert in een verhoogde LTP (figuur 3H). Lage kwaliteit van de slice en onstabiele synaptische transmissie (fEPSP baseline) kunnen leiden tot gewijzigde of mislukte LTP en LTD inductie. Daarom is het van groot belang om te werken met hoogwaardige segmentpreparaten en gebruik te maken van strenge uitsluitingscriteria (lage fEPSP-amplitude tot vezelvolleybalverhouding (<3), kleine fEPSP-helling (<0,5 mV/ms) of amplitude (<0,5 mV) en onstabiele fEPSP-basislijn (verandering van meer dan 5%) voor niet-benijdenswaardige segmenten bij het onderzoeken van synaptische processen.
Calciummicrofluorimetrische metingen in de korrelcellaag van de dentaat gyrus Na herstel werd een hersenschijfje geïncubeerd bij kamertemperatuur met 2 μM van een calciumgevoelige kleurstof gedurende 1 uur in gecarbogeneerde ASCF, afgeschermd van licht. De plak werd overgebracht naar een opnamekamer (figuur 3A) op een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop uitgerust met een multichannel zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem. Fluorescentie-emissiebeelden werden om de 500 milliseconden verkregen na verlichting bij 488 nm (figuur 4A,B). Excitatie werd gedaan met een Xenon-lamp en een op scanner gemonteerde diffractieroostermonochromator en beeldverwerving werd uitgevoerd met een computergestuurde CCD-camera. Tijdens de metingen werd de plak behandeld met de NMDA-receptorantagonist APV, wat resulteerde in een afname van de intracellulaire calciumconcentratie. Stimulatie van de plak met een extracellulaire oplossing met een hoge kaliumconcentratie (50 mM) resulteerde in een massale instroom van extracellulair calcium als gevolg van de depolarisatie van de neuronen en het openen van spanningsgedekte ionenkanalen (figuur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Concentratie (mM)</td>
			<td>Molecuulgewicht (g/mol)</td>
			<td>Bedrag (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2POST4
</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: 10 x plak vooroplossing (1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Concentratie (mM)</td>
			<td>Molecuulgewicht (g/mol)</td>
			<td>Bedrag (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>vanaf 1 M CaCl2 oplossing</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>vanaf 1 M MgSO4-oplossing</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4 * 2U2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: 1x ACSF (1 L) (osmolariteit tussen 305–315 mOsm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Samengestelde</td>
			<td>Concentratie (mM)</td>
			<td>Molecuulgewicht (g/mol)</td>
			<td>Bedrag (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x plakje voorsolution</td>
			<td>N/a</td>
			<td>N/a</td>
			<td>25 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sacharose</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: 1x hoog-sacharose plakoplossing (250 ml) (osmolariteit tussen 320-325 mOsm).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg"> Figuur 2: Gedetailleerde informatie over de bereiding van horizontale hippocampale hersenschijfjes. (A) Afbeelding van gereedschappen die nodig zijn voor de dissectie en het snijden van de knaagdierhersenen: a) ±2 cm lang en ±0,5 cm brede riemen filterpapier (bijv. klasse 413); b) blad; c) superlijm; d) pipetpunt; e) monsterplaat (wordt geleverd met vibratome); f) kweekschaal van 35 mm; g) fijne borstel; h) spatel; i) gebogen tang; j) dissectieschaar; k) sterke schaar (bladlengte boven 10 cm); l) kunststof Pasteur pipet met brede opening (tussen 0,6 en 0,8 cm in diameter); m) terugwinningskamer (zelf gemaakt met 250 ml bekerglas, plastic ring, nylon gaas, stuk van een serologische pipet van 10 ml); n) kweekschaal van 90 mm gevuld met ijs en o) vierkant filterpapier bovenop de gekoelde kweekschaal. (B) Afbeelding van een vibratome met a) houder van een met ijs gevulde plakkamer; b) snijkamer; c) carbogenlijn en d) het snijden van scheermesjes. (C) Cartoon ter illustratie van de oriëntatie van de snede van de rugzijde van één halfrond om de hersenen voor te bereiden op horizontaal snijden (zie stap 3.9). (D) Isometrische projectie van de hersenoriëntatie op de monsterplaat van de vibratome. (E) Cartoon die een bovenaanzicht illustreert van de positie van de twee hemisferen op de monsterplaat. (F) Cartoon toont de positie van de hippocampus in een horizontaal hersensegment. De dentate gyrus (DG) en Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) gebieden van de hippocampus zijn geïndiceerd. (G) Afbeelding van een herstelkamer met carbogenated ACSF met tien vers gesneden horizontale hersenschijfjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg"> Figuur 3: Elektrofysiologische opnames van hippocampale hersenplakken. (A) Afbeelding van een opnamekamer met perfusie en zuiging, gebruikt onder een rechtopstaande microscoop. Een hersenschijf wordt in de kamer geplaatst en geïmmobiliseerd met een stuk van een paperclip voor het begin van de opnames. (B) Helder veldbeeld van een hippocampale hersenschijf onder een rechtopstaande microscoop (10x objectief). Het dentaat gyrus (DG) en CA3-gebied worden aangegeven, evenals de stimulatie (linksonder) en opname (rechtsonder) elektroden, gericht op het mediale perforantpad tijdens fEPSP-opnamen. (C) Links: weergave van een segment van lage kwaliteit voorbeeld van een fEPSP-opname met een robuuste vezelvolleybal en een kleine amplitude. Rechts: segmentvoorbeeld van hoge kwaliteit van een fEPSP-opname. De grijze lijn geeft het basislijnniveau aan. De stippellijnen wijzen op de afgesneden amplitude van 0,5 mV. (D) Plot van de fEPSP helling versus de FV amplitude voor hoge kwaliteit (zwart; n= 10) en lage kwaliteit hersensegmenten (grijs; n = 4). Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. (E) Input-Output plot (fEPSP-helling) voor verschillende stimulatie-intensiteiten (μA) voor segmenten van hoge kwaliteit (zwart; n = 10) en segmenten van lage kwaliteit (grijs; n = 4)). (F) Hetzelfde als in (E) maar voor de FV amplitudes versus de stimulusintensiteiten. (G) Tijdsloop van drie verschillende baseline fEPSP-opnamen (helling van fEPSP in %; genormaliseerd tot de gemiddelde fEPSP-helling van de eerste 5 minuten). Het bovenste paneel vertegenwoordigt een positief (zwart) en negatief (rood) voorbeeld, waarbij het laatste een onstabiele basislijn heeft als gevolg van het weglaten van carbogen tijdens de opname. Het onderste paneel toont twee stabiele basisopnamen bij behandeling (na 20 minuten stabiele uitgangswaarde werden AMPA-receptoren geblokkeerd door toepassing van de AMPA-receptorantagonist DNQX (10 μM)) (blauw) en onbehandelde toestand (zwart). (H) Tijdsduur van LTP-opnames voor verschillende behandelingsomstandigheden (aangegeven in het onderste paneel). Zwarte kleur voor toepassing van Bicuculline (20 μM) tijdens conditionering en blauw voor gelijktijdige toepassing van Bicuculline (20 μM) en NMDA (10 μM) tijdens conditionering. Pijlen in het bovenste paneel geven de tijdspunten aan waar hoogfrequente stimulatie is toegepast (4 x 1s van 100Hz). Staafgrafiek in lager paneel vertegenwoordigt de gemiddelde fEPSP-hellingen (%) gedurende 50-60 minuten na LTP-inductie van de experimenten in het bovenpaneel (enkele representatieve opname voor elke aandoening). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg"> Figuur 4: Calcium-microfluorimetrie van hippocampale hersensegmenten. (A en B) Fluorescentiebeeld (opgewekt bij 488 nm) (A) en bijbehorende hittekaart (B) van een horizontaal hippocampaal hersensegment van de muishersenen. De dentaat gyrus (DG), CA3-regio en een voorbeeld van een interessegebied (ROI) worden aangegeven in deel A. (C) Tijdsverloop van calciumresponsen (F488 nm) van een ROI in de dentate gyrus van een acuut hippocampaal hersensegment tijdens de behandeling met de NMDA-receptorantagonist APV (50 μM) en oplossing met hoog extracellulair kalium (K+) (50 mM). Het spoor wordt genormaliseerd tot de hoogste calciumrespons tijdens een hoge K+ perfusie en is baseline gecorrigeerd voor fotobleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Dit protocol vergemakkelijkt de voorbereiding van horizontale hippocampushersenslices voor hun gebruik in verschillende wetenschappelijke toepassingen. Deze techniek behoudt de integriteit van alle hippocampale vezelbanen binnen een enkele schijf van het halfrond. Dit slice-protocol is bij uitstek geschikt om neurologische veranderingen te beoordelen die optreden bij hersenpathologieën die zich ontwikkelen en manifesteren in de dentate gyrus.Het belangrijkste aspect van dit protocol is het vinden van de balans tussen een zo snel mogelijke uitvoering en de zachte behandeling van het hersenweefsel. Om een liter ACSF te bereiden, meng langzaam alle vaste chemicaliën zoals aangegeven in 800 milliliter water onder constant roeren met een magnetische roerbare voordat je langzaam de juiste volumes magnesiumsulfaat en calciumchloride druppelt. Gebruik vervolgens een dampdrukosmometer om de osmolariteit tussen 305 en 315 milliosmol te valideren en laat de ACSF-oplossing continu bij kamertemperatuur borrelen met carbogen om de pH tussen 7,3 en 7,4 in te stellen.Om 250 milliliter hoge-sucrose slice-oplossing te bereiden, voeg de verbindingen toe aan 25 milliliter van de voorgesneden oplossing zoals aangegeven in de tabel en controleer of de osmolariteit tussen 320 en 325 milliosmol ligt. Laat vervolgens de hoge-sucrose slice-oplossing 10 tot 15 minuten borrelen met carbogen om de pH tussen 7,3 en 7,4 in te stellen en bewaar de hoge-sucrose slice-oplossing gedurende 20 tot 30 minuten op min 80 graden Celsius totdat deze gedeeltelijk bevroren is. Om een werkruimte voor de dissectie voor te bereiden, vul een herstelkamer met carbogenated ACSF-oplossing en plaats de kamer in een 32 graden Celsius waterbad.Stel het vibratoom in op het juiste snijprogramma en vul de houder met ijs, monteer deze op het vibratoom en bevestig een mes aan de vibratoom-arm. Gebruik een spatel om de gedeeltelijk bevroren hoge-sucrose slice-oplossing te pletten en te mengen tot een heterogene slush wordt verkregen. Laat vervolgens de oplossing borrelen met carbogen en gebruik de oplossing om een stuk filterpapier te hydrateren bovenop een gekoelde 90 millimeter kweekschaal en vul een 35 millimeter kweekschaal op ijs.Gebruik dissectiescharen om de schedel van een twee tot zes weken oude mannelijke muis open te snijden en om de calvaria langs de sagittale sutuur te openen. Gebruik gebogen pincetten om de schedel te verwijderen tot de hele hersenen inclusief de reukbollen zichtbaar zijn en gebruik een spatel om voorzichtig het intacte hersenweefsel uit te scheppen. Plaats de hersenen in de 35 millimeter kweekschaal en gebruik een Pasteur-pipet gevuld met hoge-sucrose slice-oplossing om voorzichtig eventuele haar- of bloeddeeltjes uit het weefsel te verwijderen.Gebruik de spatel om de schoongemaakte hersenen over te brengen naar het stuk geweekt filterpapier en gebruik een mes om de hersenen longitudinaal in het midden door te snijden. Plaats beide hemisferen op de vers gesneden mediale zijde en gebruik het mes om een parallelle snede te maken aan de dorsale bovenkant van elk hemisferen om het dorsale gebied van elk stuk hersenen te verwijderen. Plaats beide hemisferen op de vers gesneden dorsale zijde met de ventrale kant van de hersenen naar boven en plaats een druppel superlijm op een monsterplaat.Gebruik een pipettentip om het lijm in een groot gebied te verspreiden om beide stukken weefsel te bergen en raak een stuk filterpapierriem aan de ventrale zijde van één hemisferen aan. Gebruik een andere filterpapierriem om voorzichtig de dorsale kant van de hersenen semi-droog te maken en plaats het hemisferen met de dorsale kant naar beneden op het lijm op de monsterplaat. Gebruik twee extra filterpapierriemen om het tweede hemisferen op het lijm te plaatsen zoals net is gedemonstreerd en plaats de monsterplaat in de snijkamer.Bedek vervolgens snel maar voorzichtig de plaat met ijskou hoge-sucrose slice solution slush. Om secties van het hersenweefsel te verkrijgen, plaats de vibratoom-mes voor de mediale zijde van de hemisferen en til de vibratoom-tafel op zodat het mes op dezelfde hoogte is als de ventrale zijden van de hemisferen, die nu naar boven kijken. Gebruik de vibratoom-bediening om het mes 600 micron verder in de dorsale richting te laten zakken en snij het weefsel totdat de eerste twee plakken volledig gescheiden zijn van de twee hemisferen.Wanneer de eerste twee weefselplakken zijn verkregen, draai de snijrichting om en laat het mes nog eens 300 micron zakken voordat je opnieuw snijdt. Wanneer de hippocampus zichtbaar wordt, gebruik een verbreed plastic Pasteur-pipet om de plakken te verzamelen en over te brengen naar de herstelkamer in het waterbad. Laat de plakken een uur in de met ACSF gevulde herstelkamer staan en plaats vervolgens de herstelkamer 30 minuten bij kamertemperatuur voordat je elektrofysiologische opnames van de weefselmonsters uitvoert.Hier kunnen representatieve negatieve en positieve veldexcitatoire postsynaptische potentiaalopnamen van respectievelijk lage en hoge kwaliteit slices worden waargenomen. Het negatieve voorbeeldspoor vertoont een grote vezel volley amplitude bij depolarisatie van de gestimuleerde neuronale vezels die zelfs hoger is dan de werkelijke fEPSP-amplitude, terwijl het hoogwaardige spoor een kleine vezel volley tot fEPSP-verhouding en een hoge fEPSP-amplitude vertoont. De levensvatbaarheid van een hersenslice kan ook worden geanalyseerd door veldexcitatoire postsynaptische potentiaal hellingen uit te plotten tegen de vezel volley amplitudes.Input/output-curven die meestal worden gebruikt om de slice-kwaliteit te bepalen, kunnen worden verkregen door toenemende stroomstimuli op de hersenslice toe te passen en de daaropvolgende fEPSP-reacties te monitoren. Vanwege de suboptimale geleidingseigenschappen van slecht bewaard hersenweefsel, tonen laagwaardige hersenslices verminderde input/output-curven. Levensvatbare hersenslices hebben stabiele synaptische transmissie baselines, terwijl hersenslices met een onstabiele baseline niet kunnen worden gebruikt voor verdere conditioneringsprotocollen om de synaptische plasticiteit van hersencircuits te bestuderen.fEPSP baseline opnamen kunnen ook nuttig zijn voor het monitoren van medicijn

horizontal-hippocampal-slices-of-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

This video demonstrates a detailed protocol for preparing horizontal hippocampal brain slices from mice, focusing on preserving the integrity of hippocampal fiber pathways. The process involves carefully bisecting and securing the brain, using a vibratome for slicing, and maintaining optimal tissue conditions with a carbogenated fluid, resulting in hippocampal brain slices ready for further experimentation.

Obtaining Horizontal Mouse Hippocampal Brain Slices

The video demonstrates a procedure to record the local field potential (LFP) in mouse hippocampal-entorhinal cortex slices. Electrical stimulation is provided at the CA3 stratum radiatum of the hippocampus, which causes changes in the postsynaptic potential at the CA1 stratum pyramidale. The combined change in the membrane potential of CA1 neurons, termed the local field potential, is recorded.

Recording of Local Field Potential in Mouse Hippocampal-Entorhinal Cortex Slices

Dit document presenteert een complete methodiek voor te bereiden en te...

Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.

Onderzoek op lange termijn synaptische plasticiteit in Interlamellar Hippocampus CA1 door elektrofysiologische veld opname

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Leer hoe u horizontale hippocampale hersensneden van muizen bereidt voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode behoudt de integriteit van hippocampale vezels en maakt betrouwbare metingen van synaptische transmissie mogelijk.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Meer video's verkennen