Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen

Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt voor het correct screenen en analyseren van bioactieve kandidaten in natuurlijke producten om orale biofilms te beheersen. Het kan ook worden aangepast voor toepassingen in andere biofilmonderzoeksgebieden. Deze meest zetmeelscreenings- en analysemethode maakt het mogelijk om bioactieve componenten tegelijkertijd te verwijderen.

Tandcariës is een biofilmdieet afgeleid van, zeer voorkomende, chronische ziekte. Dit protocol kan helpen om natuurlijke producten te identificeren om biofilms en bijgevolg tandcariës te beheersen. Begin met het bereiden van het extractiemiddel met een hydroalcoholisch mengsel.

U bemonstert concentraties tussen 50 en 100 milligram per milliliter van het extractieoplosmiddel en voert 15 minuten ultrasone hulpextracties uit in microbuisjes. Herhaal de extractie drie keer. Centrifugeer na elke extractiestap het monster om het vaste residu te onthoofden en het supernatant te verwijderen.

Combineer de supernatanten van elke extractiestap en filter ze. Bewaar de aliquots voor chemische analyse en bioassays. Verdun voor fractionering het ruwe extractmonster om een oplossing van 100 milligram per milliliter te verkrijgen met behulp van het oorspronkelijke extractieoplosmiddel.

Breng vervolgens een milliliter van dit monster over naar een geconditioneerde extractiepatroon in vaste fase met één gram absorberend stof en een capaciteit van zes milliliter. Voer fractionering uit met behulp van ongeveer drie dode volumes van elke extractie-LUN en verzamel één breuk op LUN-samenstelling. Bewaar aliquots voor chemische analyse en bioassays.

Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm, stikstofstroom of lyophilisatie en registreer het gewicht en de opbrengst. Reconstitueren van de droge stof met de best mogelijke oplosmiddelen. Bereken de oplosmiddelconcentratie voor de voorraadoplossing met behulp van de formule in het teksthandschrift.

Reactiver de microbiële stam van S.mutans UA 159 op bloedagar en kweek deze in vloeibaar kweekmedium. Voer een verdunning van één tot 20 van de oorspronkelijke cultuur uit met behulp van hetzelfde kweekmedium en incubeer deze totdat deze de groeifase in het midden van het blok bereikt. Bereid het entmateriaal met een gedefinieerde populatie in TYEG voor op anti-microbiële tests en TYE met 1%sucrose voor biofilmtests.

Definieer voor anti-microbiële activiteit de concentratie van het monster voor analyse en voeg deze toe aan een plaat met 96 putten. Voeg een set besturingselementen toe aan elke plaat, zoals beschreven in het teksthandschrift. Stel met TYEG het volume in op 100 microliter, inent 100 microliter microbiële cultuur en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide.

Analyseer de bacteriële groei op basis van troebelheid door visuele inspectie van de putten. Ent een aliquot van de gewenste verdunning in specifieke agarplaten in duplicaten en incubeer de platen. Voer na de incubatie kolonietellingen uit.

Weeg hydroxyapatiete kralen in microbuisjes en steriliseer ze. Was vervolgens de kralen, met behulp van adsorptiebuffer Ab.Voeg 500 microliters speeksel toe aan de microbuisjes om een speekselfilm te vormen en incuberen bij 37 graden Celsius met 24 rotaties per minuut gedurende 40 minuten. Verwijder het speekselsupernatant en was de kralen drie keer met Ab om ze voor te bereiden op downstreamtests.

Voeg 500 microliters van het monster of de controle toe aan elke microbuis met kralen met speeksel pellicle en incub ze bij 24 rotaties per minuut en 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Was de kralen drie keer met Ab.Voeg 500 microliters microbiële kweek toe aan elke microbuis en incubeer de buizen gedurende een uur in vergelijkbare omstandigheden. Was vervolgens de niet-gebonden cellen drie keer met Ab-buffer.

Resuspendeer elk monster met één milliliter Ab-buffer en centicade gedurende 30 seconden op zeven Watt. Serieel verdunde aliquots van elke suspensie, vertienvoudigen, en plaat ze op specifieke agar platen. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide en tel de kolonies.

Voor gegevensanalyse voert u de ruwe gegevens voor de bioassays in een spreadsheet in en berekent u het logboek van microbiële groeiremming door elke behandeling en het logpercentage van microbiële groeiremming in vergelijking met de controle. Corrigeer de optische dichtheid van de metingen en bereken het percentage biomassaremming. Het chemische profiel van biologische screening op de hoeveelheid diterpenen van het Clerodane-type en geglycosyleerde flavonoïden in drie variëteiten van C.sylvestris-extracten, namelijk sylvestris, intermediate en lingua, worden hier weergegeven.

Na analyse van de ruwe gegevens vertoonden vier extracten een gunstige respons. De chromatografische gegevens van deze vier extracten tonen de gelijktijdige aanwezigheid van Clerodane-achtige diterpenen en geglycosyleerde flavonoïden. Bovendien bevatten ze hetzelfde bioom en dezelfde variëteit.

Berekend percentage CFU van behandelde planktonische cellen, percentage biomassa van de behandelde biofilms en percentage CFU van de behandelde biofilm worden hier weergegeven. Geen ruw extract beïnvloedde significant de verwijdering van S.mutans cellen hecht aan de speeksel pellicle. De hechting van S.mutans cellen aan de glucan matrix werd verzwakt door drie van de ruwe extracten.

Aangezien elke plantensoort geoptimaliseerde en specifieke chemische analysemethoden vereist, moeten de beste oplosmiddelfractie en analysemethode worden geselecteerd uit eerdere rapporten of worden gedefinieerd door middel van een experimenteel ontwerp. Het is van cruciaal belang om formuleringen met het meest actieve ruwe extract en breuken voor te bereiden en ze te testen op complexe modellen om de ontwikkeling van biofilms en holtes te voorkomen.