High-Throughput cellulaire profilering van gerichte eiwitafbraakverbindingen met behulp van HiBiT CRISPR-cellijnen
9 november 2020
Dit protocol beschrijft de kwantitatieve luminescerende detectie van eiwitafbraakkinetiek in levende cellen die zijn ontworpen met CRISPR / Cas9 om antilichaamvrije endogene eiwitdetectietag tot expressie te brengen die is gefuseerd tot een doeleiwit. Gedetailleerde instructies voor het berekenen en verkrijgen van kwantitatieve afbraakparameters, snelheid, Dmax, DC50 en Dmax50 zijn inbegrepen.
Deze benadering maakt cellulaire monitoring van eiwitdegradatie en snelle screening van degradeermiddelen mogelijk. De dynamica van degradatie kan in een cellulaire context op een zeer gevoelige en kwantitatieve manier worden gemonitord, waardoor nauwkeurige bepaling van belangrijke degradatieparameters mogelijk is. Deze methoden maken HTS-profilering van de activiteit van degradeermiddelen mogelijk, wat triage in de vroege fase van therapeutische ontdekking mogelijk maakt.
Ze bieden ook inzicht voor iedereen die de modulatie van endogene doelniveaus wil bestuderen, of deze nu toenemen of afnemen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Celia Bisbach, een onderzoekswetenschapper in mijn laboratorium. Begin met het voorbereiden en plateren van hechtende of suspensiecellen van zoogdieren.
Pas de celdichtheid aan tot 2,22 keer 10 tot de 5de cellen per milliliter en verdeel ze in platen met minimaal drie putjes per experimentele en controleconditie. Bereid seriëel verdunde PROTAC of degradeertestverbindingplaten voor, op 1000x concentratie in 100%DMSO. Verdun het vervolgens tot 10x eindconcentratie in het celkweekmedium.
Voeg een gelijk volume DMSO toe aan het medium om een DMSO-controle zonder verbinding te creëren. Voeg de juiste hoeveelheid 10x verbinding of controleoplossing toe aan de cellen in de plaat en incubeer de platen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Om het luminescente signaal op het eindpunt te meten, bereid 2x lytisch detectiereagens voor door 20 microliter lytisch substraat en 10 microliter LgBiT-eiwit toe te voegen voor elke milliliter lytisch buffer.
Bereid voldoende reagens voor voor alle putjes die moeten worden getest, inclusief extra volume om rekening te houden met pipetfouten. Voeg het bereide lytische detectiereagens toe aan cellen en meng de plaat gedurende 10 tot 20 minuten op 350 RPM op een vortexmixer voor microplates. Meet de luminescentie op een luminometer die in staat is om een 96 of 384 welplaat te lezen.
Als u multiplexing van celviabiliteit gebruikt, doe dit voor de toevoeging van het lytische reagens. 30 tot 40 minuten voorafgaand aan de gewenste eindpuntmeting, bereid een 6x oplossing voor detectie van celviabiliteit door 10 microliter van het substraat toe te voegen aan twee milliliter van de assaybuffer. Voeg het bereide reagens toe aan de putjes en meng kort op een vortexmixer voor microplates.
Vervolgens incubeert u de plaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius. Op het gewenste eindpunt, meet u de fluorescentie op een instrument dat in staat is om fluorescentie in 96 of 384 wel formaat te lezen. Bereid 2x lytisch reagens zoals eerder beschreven.
Voeg vervolgens het reagens toe aan de putjes en meng de plaat op een vortexmixer voor microplates gedurende 10 tot 20 minuten. Na het mengen, gebruikt u een luminometer om de luminescentie te meten. Om enkelvoudige concentratie-eindpunt lytische degradatieanalyse te demonstreren, werden verschillende CDK-doelwitten endogenelijk getagd met HiBiT en behandeld met de pan-kinase cereblon-gebaseerde PROTAC TL12-186.
Het CDK-eiwitpeil werd op verschillende tijdstippen gemeten en het fractionele RLU werd bepaald. Om te begrijpen hoe CDK-eiwitten zich direct met elkaar vergelijken in termen van eiwitverlies, werden de fractionele RLU's berekend als totaal percentdegradatie. Een kinetische degradatieanalyse werd uitgevoerd door BET-familie-eiwitleden endogenelijk te taggen met HiBiT en HEK293-cellen die stabiel het LgBiT-eiwit tot expressie brengen.
De cellen werden vervolgens behandeld met drie verschillende concentraties van de pan-BET PROTACs. De cereblon-gebaseerde dBET6 en de VHL-gebaseerde ARV-771. Kinetische dosisresponsdegradatieprofielen van Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-cellen die stabiel LgBiT-eiwit tot expressie brengen en behandeld met vier verschillende moleculaire lijmverbindingen worden hier getoond.
Er worden significante verschillen in degradatierespons waargenomen tussen de verbindingen, evenals over de concentratiereeks. Om de degradatie en rangorde van de verbindingen kwantitatief te beoordelen, werden de dosisresponsprofielen gebruikt om belangrijke degradatieparameters te berekenen, waaronder de degradatiesnelheid, maximale degradatie en Dmax50-waarden. Cellenlevensvatbaarheidsmultiplexassays vertoonden geen verlies aan cellevensvatbaarheid voor de geteste concentraties.
De belangrijkste stappen in dit protocol zijn het bepalen van de fractionele RLU of het procentuele degradatie door normalisatie naar de DMSO-controle. Volgens dit protocol zou men een fenotypopstelling kunnen uitvoeren om te begrijpen hoe het verlies van een bepaald eiwit de cellulaire gezondheid of functie kan beïnvloeden. Bovendien kunnen deze HiBiT-cellijnen ook worden gebruikt om eiwitinteracties of kleine molecuulbinding te bestuderen met behulp van NanoBRET-technologie.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het kwantitatief detecteren van eiwitdegradatiekinetiek in levende cellen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie. Het geeft gedetailleerde instructies voor het berekenen van degradatieparameters zoals snelheid en Dmax.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Eiwitdegradatie
- CRISPR/Cas9-technologie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitdegradatie is cruciaal voor de celgezondheid.
- CRISPR/Cas9 maakt nauwkeurige genetische modificaties mogelijk.
- Het monitoren van degradatie kan helpen bij therapeutische ontdekking.
- Kwantitatieve methoden verbeteren de nauwkeurigheid van degradatiestudies.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het monitoren van eiwitdegradatie in levende cellen.
- Om high-throughput screening van degradeerbare verbindingen mogelijk te maken.
- Om inzichten te bieden in de modulatie van endogene eiwitniveaus.
Gebruikte methoden
- Bereiding en plateren van zoogdiercellen bij specifieke dichtheden.
- Seriematige verdunning van PROTAC-verbindingen voor testen.
- Gebruik van luminescente detectie reagentia voor het meten van degradatie.
- Berekening van degradatieparameters uit luminescentiegegevens.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van eiwitdegradatiekinetiek in levende cellen.
- Identificatie van significante verschillen in degradatiereacties tussen verbindingen.
- Kwantitatieve beoordeling van degradatiesnelheden en maximale degradatiewaarden.
- Geen verlies aan celviabiliteit waargenomen tijdens de experimenten.
Conclusies
- Dit protocol vergemakkelijkt de studie van eiwitdegradatiedynamica.
- Het kan worden toegepast om de impact van eiwitverlies op celfuncties te beoordelen.
- HiBiT-gelabelde cellijnen zijn nuttig voor het bestuderen van eiwitinteracties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
