T- en B-celreceptor immuunrepertoireanalyse met behulp van next-generation sequencing

Deze methode maakt het mogelijk om specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau te verkennen en kan zo dynamische veranderingen in lymfocytenpopulaties en diversiteitsparameters bij verschillende aandoeningen identificeren. Het voordeel van next-generation sequencing is de mogelijkheid om unieke T- of B-celklonen te identificeren en te volgen op verschillende anatomische locaties of in verschillende individuen. Dit heeft het potentieel voor identificatie van nieuwe biomarkers bij verschillende ziekten.

Die procedure zal Naomi Salamon zijn, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Begin met het uitvoeren van spijsvertering en cellysis van intestinale biopten. Haal darmbiopten op die vers zijn verzameld of opgeslagen bij negatief 20 of negatief 80 graden Celsius.

Als u bevroren biopten gebruikt, ontdooi ze dan op ijs. Voeg 600 microliter kernenoplossing toe aan een steriele microcentrifugebuis van 1,7 milliliter, gekoeld op ijs. Plaats vervolgens een biopsie in de buis en incubeer deze gedurende 15 tot 30 minuten op 65 graden Celsius.

Voeg 17,5 microliter 20 milligram per milliliter proteinase K toe en incubeer de tube 's nachts op 55 graden Celsius, met zachtjes schudden. Laat het monster na de incubatie vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Voor DNA-isolatie uit bloed, schommel de buis voorzichtig totdat deze grondig is gemengd.

Breng vervolgens bloed over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter met negen milliliter cellysisoplossing. Keer de buis meerdere keren om tijdens een incubatieperiode van 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer op 600g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Gooi vervolgens zoveel mogelijk supernatant weg zonder de zichtbare witte pellet te verstoren. Draai de buis gedurende 15 seconden krachtig om volledig geresuspendeerd. Voeg drie milliliter kernanalyseoplossing toe en pipetteer meerdere keren, waardoor de oplossing stroperig wordt.

Voeg eiwitprecipitatiebuffer toe aan het monster. Draai vervolgens krachtig gedurende 20 seconden en incubeer het gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer gedurende vier minuten op 16.000 g om een strakke pellet te vormen die de neergeslagen eiwitten bevat.

Breng supernatant voorzichtig over zonder de pellet te verstoren in een nieuwe buis van 1,7 milliliter. Voeg een milliliter 2-propanol toe aan de buis met het supernatant en meng het voorzichtig door om te keren. Het DNA moet zichtbaar worden als een witte zwevende substantie.

Centrifugeer gedurende één minuut op 16.000 keer g en verwijder het supernatant volledig. Voeg een milliliter vers bereide 70% ethanol toe en keer de buis meerdere keren om. Centrifugeer het op 16,000g gedurende een minuut op kamertemperatuur.

Gooi vervolgens het supernatant voorzichtig weg. Herhaal de ethanolwas. Laat de DNA-pellet vervolgens 10 tot 15 minuten aan de lucht drogen.

Voeg 50 microliters ultrazuiver water toe aan het DNA en voer DNA-kwantificering uit zoals beschreven in het teksthandschrift. Gebruik 150 nanogram DNA om de bibliotheek voor te bereiden op sequencing. Plaats pipetten en tips 15 minuten in de kap met UV-licht om rest-DNA af te breken.

Laat ondertussen de verschillende indexbuizen en DNA-polymerase ontdooien op ijs. Voeg in een biologische kap 45 microliters van de verschillende indexbuizen toe aan de PCR-buizen, waarbij kruisbesmetting wordt voorkomen. Voeg vervolgens 0,2 microliter van het DNA-polymerase en vijf microliters van het voorbereide DNA toe aan de PCR-buizen.

Voer PCR uit met behulp van een vooraf ingesteld programma volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik magnetische kralen voor het verwijderen van overtollige primers, nucleotiden en enzymen. Verwarm de kralen minstens 30 minuten op kamertemperatuur en bereid voldoende verse 80% ethanol voor 400 microliter per monster.

Voeg de kralen toe aan elke PCR-buis en meng door 10 keer te pipetten. Incubeer de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het gemengde monster gedurende vijf minuten op de magnetische standaard.

Aspireer dan de heldere vloeistof en gooi weg. Aspireer de resterende vloeistof met behulp van een tip van 10 microliter. Voeg 200 microliters van 80% ethanol toe aan elk monster en incubeer gedurende 30 seconden.

Aspireer 195 microliter ethanol en gooi weg. Aspireer vervolgens de resterende vloeistof met behulp van een 10-microliter tip. Herhaal de ethanolwas.

Open vervolgens de doppen van de buizen en laat ze vijf minuten aan de lucht drogen. Verwijder na vijf minuten de monsters van de magnetische standaard en voeg 25 microliters elutiebuffer toe. Meng door pipetten tot homogeen en incubeer op kamertemperatuur gedurende twee minuten.

Plaats de buizen vijf minuten op de magnetische standaard. Breng vervolgens 22 microliters over naar een nieuwe PCR-buis en meet de DNA-concentratie. Kwantificeer het amplicon zoals beschreven in het teksthandschrift.

Na het berekenen van de uiteindelijke DNA-concentratie en de grootte in basisparen van de piek van het product, bereidt u voor elk monster een nieuwe verdunningsmix voor en zet u er twee microliters van over naar een nieuwe poolmix. Bereid een verse oplossing van 0,2 normaal natriumhydroxide en voeg 10 microliters toe aan de verdunde bibliotheek. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om het dubbelstrengs DNA te denatureren.

Voeg vervolgens 980 microliters voorgekoelde buffer uit de kit toe aan de buis met DNA en vortex kort. Plaats 600 microliters van de uiteindelijke bibliotheek op de daarvoor bestemde cartridge en plaats de monsters in de machine. Als u sequencinganalyse wilt uitvoeren, downloadt u sequencingstatistieken van de sequencer en controleert u of de gegevens zich binnen de juiste bereiken bevinden.

Herhaal de uitvoering voor monsters die niet aan de criteria voldoen. Dit protocol werd gebruikt om een basisanalyse uit te voeren van representatieve autologe bloed- en rectale monsters van een patiënt met IL10-receptordeficiëntie en een voorgeschiedenis van ernstige infantiele IBD. Samples werden onderzocht voor zowel TCR-beta als IGH repertoire.

Alle klonen kunnen worden geïdentificeerd door hun unieke volgorde op het nucleotide- of aminozuurniveau. Deze sequenties kunnen worden vergeleken tussen verschillende patiënten op zoek naar gedeelde klonen of bij dezelfde patiënt tussen verschillende anatomische sites. De vijf meest voorkomende klonen voor elk monster worden hier weergegeven.

TreeMap afbeeldingen werden gegenereerd voor een breed overzicht van het repertoire. Elk gekleurd vierkant vertegenwoordigt een andere kloon en de grootte correleert met de frequentie. Deze TreeMap-afbeeldingen tonen klonale expansie in het intestinale IGH-repertoire.

In het TCR-bètarepertoire daarentegen wordt een duidelijke klonale expansie waargenomen in het bloed in vergelijking met de autologe darm. Op genniveau geeft NGS informatie over het gebruik van V, D en J op het niveau van het gen, de familie of het allel. Bovendien kunnen specifieke VDJ-combinaties worden afgeleid uit de gegevens voor TCR-beta- en IGH-repertoires, waardoor differentiële gengebruikspatronen in verschillende omstandigheden worden onthuld.

Dit protocol kan worden toegepast op zowel DNA als RNA en kan worden gebruikt om TCR-alpha, TCR-gamma en IGL repertoires te genereren. Het is ook compatibel met andere organen na lichte spijsverteringsmodificaties.