Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

In vitro of geconstrueerd menselijk epidermismodel werd voor het eerst ontwikkeld in de jaren negentig met als primair doel alternatieve testmethoden voor dierproeven te ontwikkelen. Die 3D-epidermale modellen worden nu vaak gebruikt om zowel de veiligheid als de werkzaamheid van cosmetische ingrediënten te testen. Terwijl het bij verschillende weefselleveranciers kan worden gekocht, geeft het kunnen reconstrueren van een 3D-model in een laboratorium meer flexibiliteit tot het eindpunt van het belang.

Er zijn verschillende onderzoeksartikelen die kort het reconstitutieprotocol van een 3D-epidermale model beschrijven, maar er was tot op heden geen video beschikbaar die de kritieke stappen van het reconstitutieproces liet zien. Dit is de reden achter de publicatie van dit videodocument. De voorbereiding van interne gereconstrueerde menselijke epidermis zorgt voor veel vrijheid in het cultiveringsproces, zoals veranderingen in de gemiddelde samenstelling van de cultuur, pro-inflammatoire of oxidatieve stresstriggers, het uitschakeling van genen van belang en de remming of stimulatie van bepaalde biologische processen.

Om te beginnen ontdooit u een flacon met 1 miljoen cryo-geconserveerde normale menselijke epidermale keratinocyten, of NHEKs, in een waterbad bij 37 graden Celsius door een deel van de flacon in water onder te dompelen. Incubeer de flacon gedurende één tot twee minuten in het waterbad, totdat slechts een klein stukje ijs zichtbaar is. Resuspend de cellen zeer zorgvuldig door pipetting op en neer twee tot drie keer.

Breng de celsuspensie over in twee T75-kolven met in totaal 15 milliliter vooraf gewaarschuwd ontdooimedium, wat resulteert in een zaaidichtheid van 6,7 maal 10 tot de vierde cel per vierkante centimeter. Vul 24 putplaten voor met 1,5 milliliter ondergedompeld medium, idealiter met een dispenserpipet. Na het cultiveren van de cellen tot 80% samenvloeiing, zijn ze klaar voor het zaaien in inserts voor de teelt van gereconstrueerde menselijke epidermis, of RHE's.

Verwijder het basale medium uit de T75-kolven met de NHEKs. Spoel de cellen af door vijf milliliter voorverwarmde PBS aan elke T75-kolf toe te voegen en verwijder vervolgens het PBS uit de kolven. Voeg aan elke kolf twee tot drie milliliter voorverwarmde 0,05% Trypsine-EDTA toe en zorg ervoor dat de trypsineoplossing gelijkmatig over het celkweekgebied van de kolf wordt verdeeld.

Plaats de kolven gedurende vier minuten in de celkweek-incubator en controleer vervolgens of de cellen met behulp van de microscoop bij een vergroting van 10 X loskomen. Rap de kolf om de cellen van het oppervlak van de kolf te helpen loslaten. Zodra alle cellen zijn losgemaakt, voegt u een gelijk volume voorverwarmde trypsineremmer toe aan elke T75-kolf en brengt u de celsuspensie van de kolven over naar een centrifugebuis.

Spoel de kolven af met vijf milliliter voorverwarmde PBS en breng deze over op de centrifugebuis met de celsuspensie. Centrifugeer de geoogste cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G. Gooi het grootste deel van het supernatant voorzichtig weg en laat ongeveer 100 tot 200 microliter in de buis achter.

Beweeg de buis voorzichtig met uw vingers om de pellet voorzichtig los te maken. Resuspend de pellet van cellen voorzichtig in een laag volume ondergedompeld medium, pipetting op en neer 5 tot 10 keer om een uniforme cel suspensie te garanderen. Begin met een laag volume om de vorming van celaggregaten te voorkomen en voeg tot één milliliter ondergedompeld medium per eerste T75-kolf toe.

Tel de cellen in de suspensie met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode. Verdun de celsuspensie met extra ondergedompeld medium om een concentratie van 3.525 keer 10 tot de vijfde cel per milliliter te bereiken, met behulp van de eerste vergelijking in het teksthandschrift. Voer een tweede celtelling van de verdunde oplossing uit en gebruik de tweede vergelijking in het teksthandschrift om het celsuspensievolume te berekenen dat in de kweekinvoeging moet worden gezaaid.

Hang de 24 putcultuur inzetstukken in de hoogste positie van de draagplaat en breng de draagplaat over naar de 24 putplaat die voorgevuld is met ondergedompeld medium. Voeg het bepaalde volume van de celsuspensie toe aan elke insert, waarbij u ervoor zorgt dat u de insert niet aanraakt. Na het zaaien, incubeer de 24 putplaten gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur om een randeffect te overwinnen.

Verplaats de platen gedurende deze tijd niet. Breng de platen over naar de celkweek-incubator en laat ze drie dagen onder water staan. Na een incubatie van drie dagen in de celkweek-incubator, stel de cellen die zich aan het membraanoppervlak hebben vastgekleefd bloot aan de luchtvloeistofinterface, of ALI, door het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment te verwijderen met een aspiratiesysteem en een glazen Pasteur-pipet.

Vul nieuwe 24 putplaten met 1,5 milliliter vers voorverwarmd ALI-medium en breng de draagplaten met de kweekinzetstukken over naar de nieuwe multi-well platen. Breng de multi-well platen terug naar de celkweek incubator. Ververs het ALI-medium om de twee tot drie dagen, gedurende 14 dagen.

Keratinocyten in 2D-cultuur vertonen een traditionele morfologie met een consistente veelhoekige vorm. Na 15 dagen bij ALI vormt de gereconstrueerde menselijke epidermis een volledig gelaagd weefsel, wat wordt aangegeven door de vier belangrijkste epidermale lagen. Ultrastructurele analyse van de gereconstrueerde menselijke epidermis op verschillende tijdstippen in het reconstitutieprotocol onthult het cornificatieproces, met een verhoogd aantal hoornvliesplaatslagen in de loop van de tijd.

Keratinocyten in de epidermis vertonen verschillende eiwitexpressieprofielen volgens hun differentiatiefase. Involucrine-expressie komt meer voornamelijk voor in de SG-laag, terwijl de expressie van filaggrin en loricrine zich in de bovenste lagen bevindt. Keratine-10 expressie werd gevonden in alle levensvatbare lagen behalve de SB laag.

De gereconstrueerde menselijke epidermis vertoont functionele desmosomale verbindingen, zoals aangegeven door de expressie van Desmoglein-1 in de intercellulaire ruimte van de levensvatbare epidermale lagen. De barrière-eigenschappen van het gereconstrueerde epidermismodel werden onderzocht door de levensvatbaarheid van het weefsel te beoordelen bij topische behandeling met een bekende barrièreverstoorder en door de weefselintegriteit te beoordelen. De weefselintegriteit werd na 15 dagen bepaald door de TEER te meten met een voltmeter.

Responsiviteit van de epidermis op Lipopolysaccharide en Tumor Necrosis Factor alpha werd onderzocht. Zowel LPS- als TNF-alfabehandelingen waren niet giftig. ten opzichte van de Triton X-100 besturing.

De afgifte van Interleukine-1 alfa en Interleukine-8 in het RHE-medium werd gekwantificeerd met behulp van IL-lysis. Lps behandeling resulteerde in een statistisch significante up-regulatie in de release van Interleukin-1 alfa en Interleukine-8. TNF-alfabehandeling resulteerde in een statistisch significante up-regulatie in alleen de afgifte van Interleukine-1 alfa.

Echter, een duidelijke tendens van verhoogde Interleukin-8 niveaus werd ook waargenomen bij stimulatie met TNF alpha. Volgens dit protocol kan TEER worden gemeten als een waarde voor barrière-integriteit. De levensvatbaarheid of cytotoxiciteit kan bijvoorbeeld worden gemeten aan de hand van een MTT- of LDH-test.

Het supernatant kan worden gebruikt om de afscheiding van cytokinen of andere eiwitten te meten. Bovendien kan het weefsel worden gebruikt om de expressie van eiwitten of genen van belang te bestuderen.