Name: Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis kweken op grote schaal met normale humane epidermale keratinocyten. Deze methode maakt flexibele experimenten mogelijk voor huidonderzoek zonder dierproeven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidie met de subsidieovereenkomst nr. 765602 dit werk gefinancierd. Alle auteurs erkennen de steun van de Adolphe Merkle Foundation en de Universiteit van Ferrara en erkennen dow silicones belgium dankbaar. Dr. Miguel Spuch-Calvar wordt erkend voor het voorbereiden van de grafische afbeeldingen van het RhE-teeltproces. De auteurs danken Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati en Dr. Agnès Tessier voor hun technische ondersteuning en discussies.

Nationale en internationale ethische overwegingen en voorwaarden met betrekking tot het gebruik van menselijke weefsels of cellen beoordelen en naleven voordat u onderzoeksactiviteiten met betrekking tot dit protocol plant en uitvoert. OPMERKING: Alle stappen van dit protocol moeten worden uitgevoerd in aseptische omstandigheden. Bioveiligheid Niveau 2 praktijken zijn de minimale vereiste voor de teelt van RhEs. Bij het hanteren van de in dit protocol beschreven chemicaliën/reagentia moeten alle nodige veiligheidsmaatregelen worden genomen.
1. Voorbereiding van celkweekmedia
OPMERKING: Er zijn drie verschillende soorten serumvrije kweekmedia die worden gebruikt voor de teelt van RHE's (tabel 1): i) het basale medium met een laag calciumgehalte (60 μM Ca2+) dat wordt gebruikt voor de 2D-cultuur van NHEKs; ii) het ondergedompelde medium met een hoog calciumgehalte (1,5 mM Ca2+) dat wordt gebruikt voor het zaaien van NHEK's in het celkweekinzetsysteem; en (iii) het lucht-vloeistof interface (ALI) medium met een hoog calciumgehalte (1,5 mM Ca2+),ascorbinezuur en keratinocyt groeifactor (KGF).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gemiddeld</td>
			<td>Middelgrote informatie</td>
			<td>Vereiste hoeveelheid</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Basaal medium</td>
			<td>Keratinocyt groeimedium</td>
			<td rowspan="3">36 ml/24 putten</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Ondergedompeld medium</td>
			<td>Keratinocyt groeimedium</td>
			<td rowspan="4">36 ml/24 putten</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Lucht-vloeistof interface medium</td>
			<td>Keratinocyt groeimedium</td>
			<td rowspan="6">216 ml/24 putten</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibioticum-antimycoticum</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/ml ascorbinezuur</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/ml keratinocyt groeifactor</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Overzichtstabel van de verschillende cultuurmedia die worden gebruikt om RhEs te cultiveren. Lijst van verschillende cultuurmedia met supplementen.
<ol><li>Bereid het basale medium voor.<ol>
<li>Vul de fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml menselijke keratinocytgroeisupplementen (HKGS) om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] runderfysuitextract (BPE), 0,2 ng/ml humane recombinante epidermale groeifactor (EFG), 0,18 μg/ml hydrocortison te bereiken 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml recombinante humane insuline-achtige groeifactor-I (IGF-I).</li>
		<li>Voeg 5 ml 100x antibiotica-antimycotische oplossing toe met 10.000 eenheden/ml penicilline, 10.000 μg/ml streptomycine en 25 μg/ml amfotericine B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid het ondergedompelde medium voor.<ol>
<li>Vul de fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml HKGS om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humaan recombinant EFG, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml humaan recombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml μg rundertransferrine te bereiken.</li>
		<li>Voeg 5 ml 100x antibioticum-antimycotische oplossing toe.</li>
		<li>Voeg 5 ml van een cacl2 (calciumchloride) 0,144 m toe om een eindconcentratie van 1,5 mM Ca2+te bereiken. OPMERKING: De calciumconcentratie is al verhoogd tijdens de ondergedompelde fase om de differentiatie van de keratinocyten te stimuleren en het stratificatieproces te starten49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid het lucht-vloeistof interface (ALI) medium voor.<ol>
<li>Vul één fles van 500 ml keratinocytgroeimedium (tabel metmaterialen)aan met 5 ml HKGS om de eindconcentraties van 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humaan recombinant EFG, 0,18 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml rundertransferrine en 0,01 μg/ml humaan recombinant EGF te bereiken.</li>
		<li>Voeg 5 ml 100x antibioticum-antimycotische oplossing toe.</li>
		<li>Voeg 5 ml van een 0,144 M CaCl2 stamoplossing toe om een eindconcentratie van 1,5 mM Ca2+te bereiken .</li>
		<li>Voeg 1 ml ascorbinezuuroplossing van 25 mg/ml toe om een eindconcentratie van 50 μg/ml ascorbinezuur te bereiken.</li>
		<li>Voeg 50 μL van een 100 μg/ml KGF toe aan 1% [w/v] runderserumalbumine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 10 ng/ml KGF te bereiken. OPMERKING: Aangezien ascorbinezuur gevoelig is voor oxidatie, wordt aanbevolen om een stabiel ascorbinezuurderivaat te gebruiken, zoals magnesium l-ascorbyl-2-fosfaat59 of L-ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesium60. Als ascorbinezuur wordt gebruikt, wordt aanbevolen om het ALI-medium vers aan te vullen met ascorbinezuur voor elke vernieuwing.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultuur van NHEKs
OPMERKING: Aangezien primaire menselijke keratinocyten proliferatieve blijven bij hun vierde of vijfde passage61,worden NHEKs in hun derde passage gebruikt voor de teelt van RhEs. Primaire keratinocyten moeten zeer zorgvuldig worden behandeld vanwege hun hoge gevoeligheid. Zorgvuldig en langzaam pipetten van celsuspensingen op elk moment is erg belangrijk, om de toestand van de cellen niet te verstoren.
<ol><li>Ontdooi een flacon met 1 x 106 cryopreserved NHEKs in een waterbad bij 37 °C, door een deel van de flacon in het water onder te dompelen. Incubeer de flacon gedurende 1-2 minuten in het waterbad, totdat slechts een klein stukje ijs zichtbaar is. LET OP: Dompel de hele flacon niet onder in het waterbad om verontreinigingen te voorkomen. Ontdooi de cellen niet langer dan 2 minuten; dit kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen. Veeg de flacon af met een 70% ethanoloplossing voordat u de buis in de laminaire kap brengt.</li>
	<li>Resuspend de cellen zeer zorgvuldig, door pipetting op en neer 2-3 keer. Breng de celsuspensie over in twee T75-kolven met in totaal 15 ml voorverwarmd ontdooimedium, wat resulteert in een zaaidichtheid van 6,7 x 104 cellen/cm2. OPMERKING: Voor de eerste twee passages en het ontdooien van cryopreserved NHEKs wordt celkweekmedium gebruikt volgens de aanbevelingen van de leverancier.</li>
	<li>Plaats de kolven in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% relatieve vochtigheid (RH)).</li>
	<li>Vervang na ongeveer 24 uur het ontdooimedium door het basale medium om dimethylsulfoxide (DMSO) uit de keratinocytvriesoplossing te verwijderen.</li>
	<li>Ververs het basale medium om de twee dagen.</li>
	<li>Na 4-6 dagen teelt moeten de cellen ongeveer 80% samenvloeien en klaar zijn om in inserts te zaaien voor de teelt van RhEs. OPMERKING: Keratinocyten moeten worden gekweekt tot maximaal 80% samenvloeiing om hun proliferatieve capaciteit te behouden62. Bij het aantal te ontdooien cellen moet rekening worden gehouden met verschillende parameters, zoals het celpassagenummer, de levensvatbaarheid van de cel bij het ontdooien, de zaaiefficiëntie en de verdubbelingstijd.</li>
</ol>3. Zaaien van NHEKs
OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor gebruik binnen een 24-well carrier plate formaat. Als andere plaatformaten nodig zijn (bijv. 12-well of 6-well formaat), moeten optimalisaties in de seeding density en medium volume worden overwogen. Figuur 1 geeft een overzicht van een voorgestelde tijdlijn voor rhe-teelt en toont de teeltomstandigheden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> Figuur 1: Schematische tijdlijn van het reconstitutieprotocol. Presentatie van het RhE-modelvoorbereiding, teeltproces en toepassing (blootstelling aan chemische stof). Het schema bevat de juiste celcultuurmediatypen voor elke stap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<ol><li>Vul 24-putplaten voor met 1,5 ml ondergedompeld medium, idealiter met behulp van een dispenserpipet.</li>
	<li>Verwijder het basale medium uit de T75-kolven die worden gebruikt voor de kweek van de NHEKs.</li>
	<li>Spoel de cellen af door aan elke T75-kolf 5 ml voorverwarmde PBS toe te voegen.</li>
	<li>Verwijder PBS uit de kolven. OPMERKING: Deze stap is cruciaal, omdat het medium eiwitten en calcium bevat die de trypsineactiviteit remmen.</li>
	<li>Voeg 2-3 ml voorverwarmd 0,05% [v/v] trypsine/ethyleendiaminetetra azijnzuur (EDTA) toe aan elke T75-kolf. Zorg ervoor dat de trypsineoplossing gelijkmatig over het celkweekgebied van de kolf wordt verdeeld. LET OP: Het volume van 2 ml is gebaseerd op de hierboven genoemde samenvloeiing van 80%. Gebruik 3 ml voor kolven met een hogere samenvloeiing.</li>
	<li>Plaats de kolven gedurende 4 minuten in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV). Controleer of de cellen loskomen met behulp van de microscoop bij een vergroting van 10x. Rap de kolf tegen de palm van de hand om de cellen te helpen los te komen van het oppervlak van de kolf. Losgemaakte cellen kunnen worden waargenomen als afgeronde cellen die in de trypsineoplossing zweven. LET OP: Incubeer de cellen in trypsine niet langer dan 6 minuten. Over-trypsinization kan de cellen beschadigen en hun therapietrouw verminderen63.</li>
	<li>Zodra alle cellen zijn losgemaakt, voegt u aan elke T75-kolf een gelijk volume (d.w.z. 2-3 ml) voorverwarmde trypsineremmer toe.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over van de kolven naar een centrifugebuis.</li>
	<li>Spoel de kolven af met 5 ml voorverwarmde PBS en breng deze over naar de centrifugebuis met de celsuspensie. OPMERKING: Zorg ervoor dat de meeste cellen worden verzameld door het aantal restcellen in de kolven onder de microscoop te controleren. Het oppervlak van de kolf moet voor 95% leeg zijn. Als dit niet het geval is, is het mogelijk om de trypsinisatiestap (3.3-3.9) te herhalen. Merk echter op dat her trypsinisatie moet worden vermeden.</li>
	<li>Centrifugeer de geoogste cellen gedurende 5 min op 400 x g.</li>
	<li>Gooi het grootste deel van het supernatant voorzichtig weg en laat ongeveer 100-200 μL in de buis achter. LET OP: Aspireer de pellet niet tijdens deze procedure. </li>
	<li>Resuspend de pellet van cellen voorzichtig in een laag volume ondergedompeld medium, pipetteer 5-10 keer op en neer om een uniforme celsuspensie te garanderen. Begin met een laag volume (d.w.z. 500 μL) om de vorming van celaggregaten te voorkomen en tel in totaal tot 1 ml ondergedompeld medium per eerste T75-kolf op. OPMERKING: Veeg de buis voorzichtig met de vingers om een deel van de celkorrel in het supernatant voorzichtig op te lossen.</li>
	<li>Tel de cellen in de suspensie met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode.<ol>
<li>Verdun 0,4% [v/v] trypan blauwe vlek en de celsuspensie in een verhouding van 1:1, door 10 μL van 0,4% [v/v] trypan blauwe vlek toe te voegen aan 10 μL celsuspensie. Voeg 10 μL van de oplossing toe aan een telschuif. Meet het aantal cellen onmiddellijk na het mengen van de celsuspensie met trypanblauw, omdat trypanblauw de levensvatbaarheid van de cel begint te verminderen na blootstelling langer dan 1 min65. LET OP: Trypan blauw bleek een potentieel mutageen, kankerverwekkend en teratogen64. Ga zorgvuldig om met de kleurstof en gooi het afval veilig weg volgens de plaatselijke laboratoriumvoorschriften. OPMERKING: Een alternatieve benadering van het gebruik van trypanblauw is de niet-gevaarlijke kleurstof Erythrosin B66.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdun de celsuspensie met extra ondergedompeld medium om een concentratie van 3,525 x 105 cellen/ml in ondergedompeld medium te bereiken door het volume V2 toe te voegen zoals weergegeven in vergelijking 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = getelde celconcentratie in de celsuspensie verkregen in 3,12 (cellen/ml) V1 = volume dat wordt gebruikt om de pellet van cellen in 3,12 (ml) te resuspenden C2 = gerichte celconcentratie in de suspensie (d.w.z. 3,525 x 105 cellen/ml) V2 = volume dat moet worden toegevoegd om de beoogde celconcentratie (ml) te bereiken OPMERKING: De oppervlakte van de aanbevolen kweekinzet is 0,47 cm2; daarom is de overeenkomstige zaaidichtheid 3,75 x 105 cellen/cm2.</li>
	<li>Voer een tweede celtelling (C3) uit van de verdunde oplossing verkregen in stap 3.14. Gebruik vergelijking 2 om het celsuspensievolume (V4) te berekenen dat in de kweekinvoeging moet worden gezaaid: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = gerichte celconcentratie in de suspensie (d.w.z. 3,525 x 105 cellen/ml) V3 = gericht volume van de celsuspensie die in de kweekinzet moet worden gezaaid (d.w.z. 0,5 ml) C4 = getelde celconcentratie in de verdunde suspensie verkregen in 3,14 (cellen/ml) V4 = werkelijk volume van de celsuspensie die in de kweekinzet (ml) moet worden gezaaid</li>
	<li>Hang de 24 celkweekinzetstukken in de hoogste stand van de aanbevolen draagplaat en breng de draagplaat over op de 24-putplaat die voorgevuld is met ondergedompeld medium (zie 3.1). LET OP: Let er bij het overbrengen van de draagplaat op de multi-well plaat op dat er geen luchtbellen tussen het wisselplaatmembraan en het ondergedompelde medium uit het basale compartiment worden opgesloten, omdat dit de voeding van de cellen zal beïnvloeden en uiteindelijk de levensvatbaarheid en morfologie van de RhE in gevaar zal brengen.</li>
	<li>Voeg het bepaalde volume V4 (uit vergelijking 2) van de celsuspensie toe aan elke insert. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de omgekeerde pipettechniek te gebruiken om de celsuspensie nauwkeurig aan de kweekinzetstukken te geven. LET OP: Zorg ervoor dat u het membraan niet beschadigt bij het doseren van de celsuspensie in de kweekinzet. Een voorzorgsmaatregel is om de celsuspensie langs de wand van het wisselplaatsysteem af te geven zonder het oppervlak van het membraan aan te raken.</li>
	<li>Na het zaaien de 24-putplaten 10-15 minuten bij kamertemperatuur incuberen om een randeffect te overwinnen (d.w.z. niet-uniforme temperatuurverdeling tussen alle putten67). Verplaats de platen gedurende deze tijd niet.</li>
	<li>Breng de platen over naar de celkweekincubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV). De cellen worden drie dagen onder water gehouden. OPMERKING: Om weefselvariabiliteit te voorkomen, moet u de platen na het zaaien niet in de incubator stapelen om ervoor te zorgen dat elke insert dezelfde hoeveelheid warmte ontvangt. Na drie dagen (d.w.z. tijdens ali-teelt) is stapelen van platen mogelijk.</li>
</ol>4. Teelt bij Air-Liquid Interface
<ol><li>Na een incubatie van drie dagen in de celkweek-incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV) stellen de cellen die zich aan het membraanoppervlak hebben vastgeklampt bloot aan de ALI door het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment te verwijderen, bij voorkeur met behulp van een aspiratiesysteem en een glazen Pasteurpipet. OPMERKING: Als alternatief kan het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment worden verwijderd met een handmatige micropipet.</li>
	<li>Vul nieuwe 24-putplaten met 1,5 ml vers voorverwarmd ALI-medium en breng de draagplaten met de kweekinzetstukken over naar de nieuwe multi-well platen.</li>
	<li>Breng de multi-well platen terug naar de celkweek incubator (37 °C, 5% CO2en 95% RV).</li>
	<li>Ververs het ALI-medium elke 2-3 dagen gedurende 14 dagen.</li>
	<li>Voer de vernieuwing in twee stappen uit: 1) maak een nieuwe plaat met 1,5 ml/put vers voorverwarmd ALI-medium en 2) breng de draagplaat over op de nieuwe plaat. LET OP: Tijdens de gehele reconstitutieprocedure kunt u het beste het deksel van de draagplaat niet verwijderen om de RhEs te beschermen tegen mogelijke verontreiniging. OPMERKING: De ALI-stap is cruciaal voor de ontwikkeling van een gelaagd epidermaal model omdat het terminale differentiatie van de keratinocyten68mogelijk maakt. Na het gaan naar ALI is een visuele controle van de inserts vereist, om te controleren of er 'lekkende weefsels' zijn: middelgrote druppeltjes op het weefseloppervlak die uit het basolaterale compartiment komen. Als de lekkage optreedt op ALI dag 3, verwijder dan voorzichtig het medium uit de kweekinzet zonder het oppervlak van het weefsel aan te raken. Als de lekkage aanhoudt, wordt aanbevolen om lekkende weefsels weg te gooien, omdat dit een indicatie is dat er geen juiste barrièrevorming is in het RhE-model.</li>
	<li>Aan het einde van het reconstitutieproces kunnen de weefsels worden blootgesteld aan verschillende stressoren om bijvoorbeeld oxidatieve stress of ontsteking te veroorzaken. Tegelijkertijd kunnen ze worden behandeld met chemische verbindingen of cosmetische ingrediënten. OPMERKING: Tijdens de blootstelling/behandeling worden weefsels meestal in ondergedompeld medium gehouden vanaf ALI D14. Wanneer weefsels naar verwachting gedurende een lange periode (d.w.z. 48-72 uur) worden blootgesteld/behandeld, wordt aanbevolen (i) de blootstelling/behandeling eerder in het ALI-teeltproces, zoals D7-D9, te starten om het dunner worden van de levensvatbare lagen en de verdikking van de SC te voorkomen, en (ii) de weefsels in ALI-medium te incuberen, om de celproliferatie te blijven stimuleren.</li>
	<li>Verzamel voor rhe-oogsten de weefsels en het celkweekmedium op het moment dat het van belang is voor histologische analyse, levensvatbaarheidstesten, eiwit/RNA-extractie en enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISAs).</li>
</ol>

Marc Eeman en Benedetta Petracca zijn medewerkers van Dow Silicones Belgium. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

RhEs worden wijd gebruikt als het onderzoeken hulpmiddelen op de farmaceutische en dermato-kosmetische gebieden36,75,76,77,78. Hoewel verschillende bedrijven dergelijke RhEs commercieel beschikbaar hebben gesteld, blijven ze duur en beperken ze de mogelijkheid om de teeltparameters te variëren als dat nodig is om nieuwe onderzoeksvragen aan te pakken. Dit document beschrijft de productieprocedure van interne RhEs op een robuuste en betrouwbare manier en biedt een gedetailleerde karakterisering van de verkregen weefsels om de relevantie van het model als alternatieve benadering van dierproeven te bevestigen.
Sommige stappen in het protocol zijn cruciaal om een goede keratinocytdifferentiatie en RhE-reproduceerbaarheid te garanderen. Dit kan worden uitgevoerd door gebruik te maken van de optimale cellen, medium type(s) en teeltomstandigheden. In het voorgestelde RhE-model werden neonatale NHEK's geselecteerd op hun gebrek aan antigene blootstelling, vergeleken met volwassen NHEKs. Bovendien waren keratinocyten beperkt tot kaukasische etniciteit om variabiliteit tussen soorten te voorkomen. Primaire keratinocyten worden meestal gebruikt voor hun vermogen om te differentiëren en te stratificeren79. Ze kunnen commercieel of door interne isolatie van volwassen huid worden verkregen80. De teelt van een cellijn (d.w.z. HaCaT) op een polycarbonaatmembraan, heeft aangetoond dat differentiatie mislukt en een verminderd vermogen heeft aangetoond om lipiden te synthetiseren die nodig zijn voor barrièrevorming81. De opname van verschillende cultuurmatrices, zoals hydrogels, collageen-, fibrine- en sferoïdenculturen, resulteerde echter in de succesvolle ontwikkeling van 3D-huidmodellen78,82,83,84,85,86. De vereeuwigde cellijnen, N/TERT, zijn geschikt gebleken voor de ontwikkeling van RhEs35. Primaire keratinocyten blijven proliferatieve bij hun vierde of vijfde passage61, daarom omvat het huidige protocol het gebruik van keratinocyten in hun derde passage. De Vuyst et al. hebben aangetoond dat de celzaderijdichtheid van belang is en voldoende moet zijn (d.w.z. ≥ 2,5x105 cellen/cm2) ervoor te zorgen dat het medium uit het basolaterale compartiment niet naar het apicale compartiment verspreidt. Een onvoldoende zaaidichtheid (d.w.z. < 2.5x105 cellen/cm2) kan resulteren in een onvermogen om een goede barrière te vormen, wat wordt aangegeven door de verspreiding van medium van het basolaterale naar het apicale compartiment, wat resulteert in ondergedompelde in plaats van ALI-cultuuromstandigheden62. Serumvrij keratinocytgroeimedium (zie Tabel met materialen) de voorkeur kreeg voor reproduceerbaarheidsdoeleinden, omdat het het voordeel biedt van het werken met een chemisch gedefinieerd medium en het risico op besmetting vermindert. Dit medium heeft een lagere calciumconcentratie (d.w.z. 60 μM) en stimuleert daarom de proliferatie van keratinocyten87. Verhoging van de calciumconcentratie (d.w.z. 1,5 mM) vanaf de eerste stap van de RhE-teelt, bevordert keratinocytdifferentiatie en huidbarrièrevorming en homeostase49. Bovendien wordt het ALI-medium aangevuld met ascorbinezuur, dat cruciaal is gebleken voor de vorming van SC-lipiden en om differentiatie te bevorderen52,53,54. Het ALI-medium bevat ook KGF, een groeifactor die wordt afgescheiden door fibroblasten die zich kunnen binden aan keratinocyt transmembrane receptoren en bij activering een dubbele rol heeft bij differentiatie en wondherstel55,88. Het is belangrijk om het ALI-medium met specifieke tijdsintervallen te vernieuwen, om een constante toevoer van verse voedingsstoffen aan de RhEs te bieden. Het gebruik van een draagplaatsysteem is cruciaal voor rhe-teelt op grotere schaal (d.w.z. 24 wisselplaten/plaat). Het biedt het voordeel van tijdsbesparing, het verminderen van het risico op besmetting en laat minder ruimte over voor de introductie van menselijke fouten. Het biedt ook de mogelijkheid om RhEs te culteren in een hoog volume media (d.w.z. 1,5 ml), wat het vereiste aantal ALI-mediumvernieuwingen vermindert. Bovendien biedt het de mogelijkheid om een volledige plaat wisselplaten over te brengen naar een plaat met vers medium, contact met de inzetstukken afzonderlijk te vermijden of het deksel van de plaat bloot te leggen.
Er zijn verschillende beperkingen van het RhE-model die moeten worden opgemerkt. In de inheemse menselijke huid is er een evenwicht tussen de proliferatie van keratinocyten in de basale laag en de loslating van corneocyten in de SC (d.w.z. desquamatie)89. In vitro vindt desquamatie echter niet plaats. Daarom blijven de corneocyten gehecht aan de RhE en vormen ze een dikke SC die minder fysiologisch relevant is. Daarom is er een beperkte teelttijdspanne van RhEs. Bovendien is dit RhE-model eenvoudig en eenvoudig, omdat het bestaat uit een enkel celtype, d.w.z. de keratinocyt, het meest voorkomende celtype van de epidermis. Er zijn echter andere celtypen die in de epidermis voorkomen, zoals melanocyten, dendritische cellen (d.w.z. Langerhans-cellen), T-cellen (bijv. CD8+ cellen) en Merkel-cellen13. Om de fysiologische relevantie van het huidmodel te verbeteren, hebben onderzoekers huidmodellen complexer gemaakt door melanocyten toe te voegen38 , immuuncellen39, of van de patiënt afgeleide cellen90. Men moet in gedachten houden dat de barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen anders zijn in vergelijking met de inheemse menselijke huid, met name vanwege een andere SC-lipidesamenstelling en een hogere barrièredoorlaatbaarheid 91,92,93,94,95. Verschillende studies hebben echter veranderingen in barrière-eigenschappen van menselijke huidmodellen gemeld door de teelt onder hypoxie96 of verminderde relatieve vochtigheid97, de modulatie van de dermale matrix met chitosan98, en wijziging van de vrije vetzuren in het kweekmedium99. Bovendien kunnen in zowel eenvoudige als complexere RhEs de cultuuromstandigheden en de gemiddelde samenstelling worden gemoduleerd om pathologische kenmerken na te bootsen. Door het model uit te dagen met cytokinen, een abnormale morfologie100 en veranderingen in gen- en eiwitexpressieniveaus kunnen worden vastgesteld die meestal worden waargenomen bij veel voorkomende huidaandoeningen, zoals atopische dermatitis en psoriasis35,101,102,103,104,105. Het dempen van specifieke genen in keratinocyten voordat het reconstitutieproces van het 3D-model wordt gestart, is een andere benadering die wordt gebruikt om kenmerken van huidaandoeningen na te bootsen en nieuwe therapeutische oplossingen te onderzoeken106,107. Naast het modelleren van alleen een epidermale laag, kan een dermaal compartiment in het model worden opgenomen (d.w.z. benoemde menselijke huidequivalenten of modellen met volledige dikte) door fibroblasten in een collageenmatrix te verankeren voorafgaand aan RhE-reconstitutie, waardoor het fysiologisch relevanter en geschikter wordt voor verouderings- en wondgenezingsgerelateerde studies108,109,110. Bovendien zijn tumorsferoïden toegevoegd aan menselijke huidequivalenten om de progressie van melanoom te bestuderen111,112. De nieuwste ontwikkelingen op het gebied van huidmodellen zijn bioprinten en skin-on-a-chip. Meerdere onderzoeksgroepen zijn er onlangs in geslaagd om (perfusable) bio-geprinte huidequivalenten te ontwikkelen45,113,114. Het voorgestelde protocol maakt gebruik van een 24-well formaat en een draagplaat, waardoor wisselplaten niet afzonderlijk moeten worden behandeld. De studieschaal is echter nog steeds vrij beperkt en mist automatisering. Door het gebruik van bioprinten of skin-on-a-chip te implementeren, kunnen kleinere huidmodellen worden gebruikt met meer geautomatiseerde processen en op grotere schaal.
De RhE beschreven in dit protocol heeft meerdere overeenkomsten met de reeds ontwikkelde en goed gekarakteriseerde commerciële epidermale modellen. De morfologische analyse heeft aangetoond dat, hoewel het aantal levensvatbare lagen in het voorgestelde RhE-model lager is in vergelijking met dat van de inheemse menselijke huid (d.w.z. 6-7 in vergelijking met 7-14), het vergelijkbaar is met dat van het EpiDerm RhE-model (d.w.z. 8-12)70. Net als bij de Modellen EpiDerm, EpiSkin en SkinEthic toont de bovenste RhE-laag een mandweefselpatroon van dicht opeengepakte corneocytlagen28. Bovendien bleek uit tem-analyse dat het aantal SC-lagen in het voorgestelde RhE-model (d.w.z. 15-25) vergelijkbaar is met dat van EpiDerm (d.w.z. 16-25)70. Over het algemeen vertoont het voorgestelde RhE-model een vergelijkbare structuur als die van andere gecommercialiseerde epidermale modellen, die de inheemse menselijke epidermis nabootsen. De weefselintegriteit zoals gemeten door TEER ligt binnen het bereik van commerciële RhE-modellen (d.w.z. tussen 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 en andere interne RhE's (d.w.z. ongeveer 5000 Ω,cm2)74,115. Het voorgestelde RhE-model blijkt goed gedifferentieerd te zijn, zoals blijkt uit de aanwezigheid en correcte lokalisatie van differentiatie- en weefseladhesiemarkers. Bovendien blijkt het voorgestelde RhE-model te reageren op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. LPS en TNF-α).
Tot slot laat het huidige protocol zien hoe rhEs op een betrouwbare manier en op relatief grote schaal kunnen worden produceren om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in zowel academische als particuliere instellingen. Het voorgestelde RhE-model vertoont vergelijkbare morfologie, epidermale differentiatie en biologische responsiviteit als andere bestaande commerciële modellen. Het biedt een alternatief hulpmiddel voor zowel het farmaceutische als dermato-cosmetische veld wanneer toegang tot een relevant huidmodel vereist is.

De epidermis is de buitenste laag van de huid, op de directe interface tussen het menselijk lichaam en de externe omgeving. De belangrijkste functies zijn bescherming en hydratatie1. De opperhuid fungeert als een effectieve fysieke barrière tegen externe middelen en voorkomt overmatig waterverlies uit het lichaam. Deze huidfuncties zijn voornamelijk afhankelijk van de cellulaire opstelling in de buitenste lagen van de huid, de samenstelling en organisatie van intercellulaire lipiden2. De epidermis bestaat voornamelijk uit keratinocyten die naar boven migreren naar de buitenkant van het weefsel en differentiatie ondergaan. Er zijn 4-5 epidermale lagen die worden gekenmerkt door hun differentiatiestadium. Van binnen naar buiten beginnen de epidermale lagen van de levensvatbare epidermis, d.w.z. het stratum basale (SB), het stratum spinosum (SS) en het stratum granulosum (SG), tot de niet-levensvatbare bovenste laag, d.w.z. het stratum corneum (SC)3. De basale laag bestaat voornamelijk uit proliferatie van keratineverrijkte keratinocyten, die bij differentiatie door het SS migreren4. Tijdens de rijping van keratinocyt treden verschillende veranderingen in eiwitexpressie en structuur op. Keratinocyten hechten zich door de vorming van desmosomale verbindingen5. In de SG wordt de generatie van lamellaire lichamen geïnitieerd. Ze bestaan uit lipidenprecursoren en enzymen die cruciaal zijn voor de vorming van de huidbarrièrefunctie6. De SG wordt ook gekenmerkt door de aanwezigheid van keratohyalinekorrels in het cytoplasma van de keratinocyten. Op het raakvlak met de SC wordt het gehalte van de lamellaire lichamen geëxtrudeerd in de intercellulaire ruimtes en de niet-polaire lipiden zoals ceramiden, cholesterol en vrije vetzuren organiseren zich in gestapelde lamellaire lipide tweelagen om de extracellulaire lipidenmatrix te vormen7. In de SC verliezen cellen alle cellulaire organellen, inclusief de kern, als gevolg van enzymatische afbraakprocessen en nemen ze een afgeplatte morfologie aan. Ze zijn omgeven door een gelikte envelop van onderling verbonden eiwitlagen en worden corneocyten8,9genoemd . Desmosomale componenten zijn gekruist aan de cornified envelop om corneodesmosomen te vormen en de corneocyten aan elkaar te binden. Het resulterende epitheel wordt voortdurend vernieuwd uit stamcellen, met een omlooptijd van ongeveer 5-6 weken10. Het differentiatieproces van de keratinocyten, wat resulteert in een volledig gestratificeerd epidermis, is cruciaal voor de vorming van de barrièrefunctie van de huid11.
Tijdens wondvorming en ontsteking induceren keratinocyten veranderingen in adhesiemoleculen en oppervlaktereceptoren en veroorzaken pro-inflammatoire reacties via afscheiding van cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden12. De huid is niet alleen een fysieke barrière tegen exogene stoffen; het fungeert ook als een immuunsensor bij blootstelling aan ziekteverwekkers. Bovendien reguleert het de verspreiding van verschillende stoffen over de lagen, zoals het watergehalte om het menselijk lichaam te beschermen tegen uitdroging. De huid is ook betrokken bij de synthese van vitamine D en heeft verschillende andere metabolische functies3,13,14.
Om de nadelige effecten van exogene stoffen te beoordelen, vertrouwen toxicologen al tientallen jaren op dierproeven, maar tegenwoordig is het niet de voorkeursbenadering. Naast het beperkte voorspellend vermogen voor menselijke toxiciteit, brengen diermodellen tal van ethische kwesties met zich mee. Het verbod op dierproeven in de cosmetische industrie en de aanbeveling om het 3R-beginsel (d.w.z. vervanging, vermindering en verfijning) in onderzoek te volgen, hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve testmethoden op basis van in vitro benaderingen15. De eerste in vitro huidcelmodellen zijn al beschreven in de jaren 90, en een indrukwekkende ontwikkeling van eenvoudige menselijke keratinocyt monoculturen tot volledig gedifferentieerde epidermis- en volledige diktemodellen is bereikt16. Tegenwoordig is huidweefseltechnologie belangrijk geworden op zowel farmaceutisch als dermato-cosmetisch gebied. In de afgelopen twee decennia hebben verschillende bedrijven driedimensionale (3D) gereconstrueerde menselijke epidermis (RhE) gecommercialiseerd die gestandaardiseerde en reproduceerbare hulpmiddelen voor huidgerelateerde studies vertegenwoordigen. Verschillende commerciële RhE-modellen worden geaccepteerd voor in vitro huidtesten van chemische stoffen volgens oeso-richtlijnen voor het testen van huidirritatie17,18 (d.w.z. testrichtlijn 43919) en huidcorrosie20 (d.w.z. testrichtlijn 43121). De in-vitrotest voor huidsensibilisatie22 (d.w.z. SENS-IS-test) bevindt zich momenteel in het goedkeuringstraject en wordt door collega's beoordeeld23. Er zijn ook tal van andere tests ontwikkeld die commerciële RhE-modellen gebruiken, om fototoxiciteit24te evalueren, om medicijnformuleringen25,cosmetische formuleringen en actieve ingrediënten te testen26, om de huidbarrièrefunctie27 te bestuderen en om de biologische reactie op omgevingsstressoren28,29,30,31te testen .
Naast commercieel verkrijgde 3D-huidmodellen hebben meerdere onderzoeksgroepen hun eigen RhEs32,33,34,35,36,37ontwikkeld . In-house RhEs bieden het voordeel voor het beheersen van de cultuuromstandigheden volgens het doel van de studie. In het bijzonder kunnen onderzoekers het type en de bron van de keratinocyten selecteren die moeten worden gebruikt voor de reconstitutie van hun 3D-epidermale model (d.w.z. primair versus vereeuwigd, neonatale versus leeftijd, enkele versus gepoolde willekeurige donoren, geslacht, etniciteit, individuele leefgewoonten zoals roken, enz.). Ze hebben de mogelijkheid om de samenstelling van het kweekmedium te variëren en groeifactoren, vitamines of andere verbindingen op te nemen die de expressie van doeleiwitten of lipiden kunnen moduleren. Met in-house RhEs kunnen onderzoekers ook biologische reacties en biomechanische eigenschappen onderzoeken als functie van de differentiatietoestand van het 3D-model. Naast deze intuïtieve parameters zijn er voortdurende inspanningen om de complexiteit van 3D-huidmodellen te vergroten en fysiologisch relevanter te maken, bijvoorbeeld door andere epidermale celtypen toe te voegen (bijv. melanocyten en immuuncellen)38,39, door de keratinocyten bovenop een fibroblast-bevolkte collageenmatrix40 , 41,42te cultiveren en door componenten van het vasculaire netwerk43,44,45op te nemen .
Hoewel het mogelijk is om de cultuuromstandigheden af te stemmen op specifieke behoeften, zijn er parameters die moeten worden gerespecteerd om zowel de kwaliteit als de relevantie van een RhE te garanderen. Om RhE-weefsels te kweken, worden normale menselijke epidermale keratinocyten (NHEKs) gezaaid in specifieke permeabele kweekinzetstukken waarvan het poreuze synthetische membraan de putten in twee compartimenten scheidt, d.w.z. het apicale en basolaterale compartiment. De porositeit van het membraan (d.w.z. een poriegrootte van 0,4 μm) is zodanig dat het de vorming van een celmonolaag in het apicale compartiment mogelijk maakt zonder migratie van cellen naar de basale insertzijde, en het voeden van de keratinocyten met essentiële voedingsstoffen uit het kweekmedium in het basolaterale compartiment. Aan het begin van het reconstitutieproces worden NHEK's een paar dagen onder water gekweekt om hun hechting op het membraan mogelijk te maken. Het calciumgehalte in beide compartimenten is verhoogd in vergelijking met de calciumconcentratie die wordt gebruikt voor de 2D-cultuur van NHEKs om de proliferatie van cellen te vertragen en in plaats daarvan hun differentiatie te bevorderen46. Een epidermale calciumgradiënt is essentieel om de barrièrevorming en homeostase te reguleren47,48. Hoge calciumspiegels (d.w.z. tot 1,5 mM) bevorderen de vorming van intercellulaire verbindingen en moduleren de vorming van de cornified envelop tijdens terminale differentiatie49. Zodra keratinocyten een continue en nauw hechtende monolaag op het ondersteunende membraan vormen, wordt het medium uit het apicale compartiment verwijderd en gaat het kweekproces verder op de lucht-vloeistofinterface (ALI) om stratificatie te stimuleren en een epidermale barrière vast te stellen50,51. Specifieke kweekomstandigheden zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van een volledig gelaagd epitheel36. Tijdens het reconstitutieproces bij ALI wordt het medium in het basolaterale compartiment aangevuld met keratinocytgroeifactor (KGF), insuline, calcium en ascorbinezuur. Ascorbinezuur speelt een belangrijke rol bij de vorming van een geschikte SC-lipidebarrière, die sterk lijkt op die van de inheemse menselijke huid52. Keratinocyten gekweekt in ascorbinezuur-aangevuld medium tonen een gedifferentieerd fenotype, met een verhoogd aantal keratohyalinekorrels, evenals georganiseerde intercellulaire lipide lamellen in de interstices van de corneocyten52. Een dergelijke suppletie is essentieel om de epidermale barrièrefunctie te verbeteren door het gehalte aan cornified envelope te verhogen en uitputting van hydrofiele antioxidantvoorraden53,54te voorkomen . KGF, een belangrijke paracrinemediator van epidermale proliferatie en differentiatie, wordt gebruikt om de NHEKs55te stimuleren.
De belangrijkste nadelen van interne RhEs zijn het verlies van standaardisatie tussen onderzoeksinstellingen en verhoogde arbeidsintensiteit en tijdsconsumptie (tot 3 weken in vergelijking met de kant-en-klare commerciële modellen). Het doel van dit document is om deze nadelen aan te pakken en de basis voor de productie op grotere schaal te leggen. Naast de bovengenoemde voordelen van interne RhEs, is het huidige protocol gericht op het verminderen van de intra- en intervariabiliteit tussen weefsels, het verminderen van besmettingsrisico's en het stroomlijnen van het teeltproces.
Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en robuuste methode om RhEs te kweken met neonatale NHEKs. Bovendien toont het representatieve resultaten van de karakterisering van de RhEs-morfologie, barrière-integriteit en expressie van eiwitten die specifiek zijn voor epidermale differentiatie. RhEs morfologische structuur werd onderzocht met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Om de barrière-integriteit te evalueren, werden de transepidermaal elektrische weerstand (TEER) en de blootstellingstijd aan Triton X-100 gemeten om 50% van de levensvatbaarheid van het weefsel (ET50) te verminderen. De vorming van desmosomale verbindingen (d.w.z. desmogleine 1) werd geanalyseerd door immunofluorescentie (IF) om de hechting van keratinocyt te evalueren. De vorming van epidermale structurele eiwitten (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) werd geëvalueerd en gedetecteerd met IF. Deze eiwitten zijn betrokken bij de vorming van de sterk gekruiste eiwitschil die SC-corneocyten omringt en zijn als gevolg daarvan belangrijke markers voor epidermale differentiatie in een laat stadium56,57. Bovendien werd IF gebruikt om keratine 10 te analyseren, een eiwit dat werd geïnduceerd in gedifferentieerde cellen in het vroege stadium in SS58 en werd gevonden in alle gedifferentieerde lagen. Ten slotte werd de reactie van de RhE op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa) onderzocht. De niveaus van interleukine 1 alfa (IL-1α) en interleukine 8 (IL-8) werden gemeten in de celkweekmedia, met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Verzuur Eosin-oplossing met 1 mL azijnzuur per 100 mL.</td></tr><tr><td>Antibioticum-antimycoticum (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Waterige Eosin Y-oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110280</td><td>Verzuur Eosin-oplossing met 1 mL azijnzuur per 100 mL.</td></tr><tr><td>Calciumchloride (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich of Merck</td><td>C8106 of 1.02378.0500</td><td>Bereid een stockoplossing van 0,144 M, filter steriliseer en bewaar aliquots bij -20 &deg;C.  Het wordt aanbevolen om elke 6 maanden nieuwe aliquots te bereiden.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Bereid een stock bij 100 &mu;g/mL en bewaar aliquots bij -20 &deg;C. De werkconditie is 1 &mu;g/mL.</td></tr><tr><td>Entellan montagemedium</td><td>Merck</td><td>1.07960.0500</td><td>Montagemedium voor H&amp;E kleuring.</td></tr><tr><td>EpiLife medium (aangeduid als keratinocyten groeimedium)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>MEPI500CA</td><td>Bevat 0,06 mM Ca2+.</td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Elke leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formaline 10%</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800770</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke keratinocyten groeisuplement (HKGS) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>S0015</td><td>Om eindconcentraties van 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/mL menselijke recombinante EGF, 0,18 &mu;g/mL hydrocortison, 5 &mu;g/mL boviene transferrine en 0,01 &micro;g/mL menselijke recombinante insuline-achtige groeifactor-I te bereiken.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Biosolve B.V.</td><td>0016264102BS</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's glycerol gelatine, fenol-vrij</td><td>Merck</td><td>1.08635.0100</td><td>Montagemedium voor IF kleuring.</td></tr><tr><td>Keratinocyten groeifactor (KGF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>251-KG-050</td><td>Reconstitueer KGF-eiwit op 100 &mu;g/mL in steriele 0,1% [w/v] BSA in PBS. Bereid aliquots en bewaar bij -20&deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lactaatdehydrogenase (LDH) assaykit</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesiumzouthydraat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>Bereid een stockoplossing van 25 mg/mL, filter steriliseer en bewaar aliquots bij -20&deg;C. Het wordt aanbevolen om elke 6 maanden nieuwe aliquots te bereiden. Bewaar in het donker.</td></tr><tr><td>Lipopolysacharide (LPS), E.coli-stam O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4524</td><td>Bereid een stock van 1 mg/mL in steriele PBS en bewaar aliquots bij -20 &deg;C. De werkconcentratie is 100 &mu;g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mayer&rsquo;s Haematoxyline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS80</td><td></td></tr><tr><td>Normale humane epidermale keratinocyten (NHEKs)</td><td>Lonza</td><td>00192906</td><td>Humane primaire keratinocyten geïsoleerd uit neonatale voorhuid, gepoold van ten minste drie donoren.</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zoutoplossing</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010056 of 10010-015</td><td>Referentienummers kunnen variëren tussen landen.</td></tr><tr><td>Recombinant tumornecrose factor alfa (TNF-&alpha;)</td><td>ImmunoTools</td><td>11344483</td><td>Bereid een stock van 100 &mu;g/mL in steriele ultrapure water. De werkconcentratie is 40 ng/mL</td></tr><tr><td>Steriele ultrapure water</td><td>Elke leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>Bereid een stock van 5 mg/mL MTT in steriele PBS. De werkconcentratie is 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw (0,4% [v/v])</td><td>Elke leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-remmer</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA (0,05% [v/v])</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Geit Anti-Muis IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>Ab150113</td><td></td></tr><tr><td>Tri-natriumcitraatdihydraat</td><td>Merck</td><td>1.06448.0500</td><td>Voor antigeenretrieval buffer voor IF kleuring.&nbsp;</td></tr><tr><td>Geit Anti-Konijn IgG H&amp;L (Dylight 488)</td><td>Agrisera</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin Muis antilichaam</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-53243</td><td></td></tr><tr><td>Involucrine Konijn antilichaam</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-33742</td><td></td></tr><tr><td>Keratine 10 Muis antilichaam</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-32962</td><td></td></tr><tr><td>Desmoglein-1 Muis antilichaam&nbsp;</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>MAB944</td><td></td></tr><tr><td>Loricrine Konijn antilichaam</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP1-33610</td><td></td></tr></tbody></table>

het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Een driedimensionaal menselijk epidermismodel gereconstrueerd uit neonatale primaire keratinocyten wordt gepresenteerd. Hierin wordt een protocol beschreven voor het teeltproces en de karakterisering van het model. Neonatale primaire keratinocyten worden ondergedompeld op doorlatende polycarbonaatinzetstukken gekweekt en drie dagen na het zaaien naar de lucht-vloeistofinterface gebracht. Na veertien dagen stimulatie met gedefinieerde groeifactoren en ascorbinezuur in een hoog calciumkweekmedium, is het model volledig gedifferentieerd. Histologische analyse onthulde een volledig gestratificeerd epidermis, die de morfologie van de inheemse menselijke huid nabootste. Om het model en zijn barrièrefuncties te karakteriseren, werden eiwitniveaus en lokalisatie specifiek voor keratinocytdifferentiatie in een vroeg stadium (d.w.z. keratine 10), differentiatie in een laat stadium (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) en weefseladhesie (d.w.z. desmogleine 1) beoordeeld door immunofluorescentie. De integriteit van de weefselbarrière werd verder geëvalueerd door transepitheliale elektrische weerstand te meten. Reconstructed menselijke epidermis reageerde op pro-inflammatoire stimuli (d.w.z. lipopolysaccharide en tumornecrosefactor alfa), wat leidde tot een verhoogde afgifte van cytokine (d.w.z. interleukine 1 alfa en interleukine 8). Dit protocol vertegenwoordigt een eenvoudige en reproduceerbare in vitro methode om gereconstrueerde menselijke epidermis te cultiveren als een instrument om milieueffecten en een breed scala aan huidgerelateerde studies te beoordelen.

NHEKs gekweekt in 2D tonen een traditionele morfologie met een consistente veelhoekige vorm (Figuur 2A). Zoals hierboven beschreven, worden NHEKs in kweekinzetstukken gezaaid na het bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 80%. De morfologie van de RhEs werd geanalyseerd met behulp van H&E-kleuring en TEM. Na 15 dagen bij ALI wordt een volledig gelaagd weefsel verkregen zoals aangegeven door de vier belangrijkste epidermale lagen: de SB, de SS, de SG en de SC (Figuur 2B). In de SB-laag hebben de cellen een zuilvormige vorm. Vanaf de tweede laag naar de bovenste lagen van de RhE onderscheiden NHE's zich zoals waargenomen door de veranderingen in de celmorfologie (van een zuilvormige vorm in de SB-laag, naar een stekelige vorm in de SS-laag). In de SG-laag hebben de cellen een meer afgeplatte vorm en vertonen ze keratohyalinekorrels (KG) die worden weergegeven als paarse stippen in het cytoplasma. Hun karakteristieke ronde en stellaire vorm wordt gemarkeerd door witte pijlen op de H&E-afbeelding(figuur 2C). De cellen in de SC, zijn terminaal gedifferentieerd en zijn volledig afgeplat en missen een celkern. De gelaagde RHE's hebben een totale dikte van 84,3 ± 2,4 μm en hun SC heeft een dikte van 19,6 ± 3,2 μm (figuur 2D). Deze waarden zijn vergelijkbaar met die gerapporteerd voor de inheemse menselijke huid, d.w.z. 60-120 μm en 10-20 μm, respectievelijk69. Het aantal levensvatbare lagen is 6-7, wat lager is in vergelijking met dat van de inheemse menselijke huid, namelijk ongeveer 7-1470. Ultrastructurele analyse van RhEs op verschillende tijdstippen in het reconstitutieprotocol (d.w.z. 7, 10, 13 en 15 dagen) onthult het cornificatieproces van de RhEs met een verhoogd aantal corneocytlagen in de loop van de tijd (Figuur 2E). Na 15 dagen bij de ALI wordt de SC van het RhE-weefsel gemaakt van ongeveer 15-25 lagen, wat vergelijkbaar is met de gerapporteerde waarde voor de inheemse menselijke huid (d.w.z. 15-20 lagen)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Figuur 2: Primaire keratinocyten en gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) Fasecontrastmicroscopiebeeld van primaire keratinocyten alvorens op inserts te zaaien. Schaalbalk is 50 μm. (B-C) H&E helder veldmicroscopiebeeld van RhE. Schaalbalk is 50 μm (B) en 25 μm (C). (D) Kwantificering van de dikte van RhE en SC (gemiddelde ± SEM, n=3). (E) Transmissie elektronenmicroscopie beelden van RhE dwarsdoorsneden na 7, 10, 13 en 15 dagen bij ALI. Schaalbalk is 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Volgens hun differentiatiefase vertonen NHEK's die in 3D groeien verschillende eiwitexpressieprofielen op basis van hun differentiatiefase. De expressie van eiwitten die specifiek zijn voor keratinocytdifferentiatie in een vroeg stadium (d.w.z. keratine 10), differentiatie van keratinocyt in een laat stadium (d.w.z. involucrine, loricrine en filaggrin) en keratinocytadhesie (d.w.z. desmogleine 1) in RhEs werd bepaald met behulp van IF-kleuring. Involucrine-expressie lijkt zich meer voornamelijk in deSG-laagte bevinden, omdat de expressie ervan eerder tijdens het differentiatieproces wordt geïnitieerd (figuur 3D), terwijl filaggrin en loricrine worden uitgedrukt in de bovenste lagen (figuur 3B-C ). Keratine 10-expressie werd gevonden in alle levensvatbare lagen, behalve de SB-laag (Figuur 3E). RhEs vertonen functionele desmosomale verbindingen, zoals aangegeven door de expressie van desmogleine 1 in de intercellulaire ruimte van de levensvatbare epidermale lagen (Figuur 3F). Tot slot worden alle vijf markers uitgedrukt en gelokaliseerd in de juiste epidermale lagen en vertalen ze zich naar een gezond epidermale differentiatieproces.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Figuur 3: Epidermale differentiatie, weefseladhesie en weefselintegriteit van gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) H&E bright field microscopie afbeelding van RhE. Confocale fluorescentiemicroscopiebeelden van (B) filaggrin (FLG), (C) loricrine (LOR), (D) involucrine (INV), (E) keratine 10 (K10) en (F) desmogleine 1 (DSG-1) weergegeven in magenta. Nuclei staining (DAPI) wordt weergegeven in blauw. De schaalbalk is 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
De barrière-eigenschappen van het RhE-model werden onderzocht door zowel de levensvatbaarheid als de integriteit van het weefsel te beoordelen. De weefselintegriteit werd na 15 dagen bepaald door de TEER te meten met behulp van een voltohmmeter. De waarden van 2567 ± 415Ω,cm 2 die voor de RhE's zijn geregistreerd, vertalen de vorming van een continue barrière (figuur 4A). Deze waarden liggen binnen het bereik van de waarden die zijn gerapporteerd voor RhE-modellen71,72,73,74. Bovendien werd de vereiste blootstellingstijd voor een cytotoxische referentiestof (d.w.z. Triton X-100) om de levensvatbaarheid van het weefsel met 50% te verminderen (ET50) bepaald met een thiazolylblauw tetrazoliumbromide (MTT) test. De ET50-waarde gemeten voor de RhE was 2,1 uur. Deze waarde valt binnen het acceptatiebereik van andere 3D-epidermale modellen die in aanmerking komen voor een betrouwbare voorspelling van irritatieclassificatie (OESO-richtsnoer 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Figuur 4: Barrière-eigenschappen van gereconstrueerde menselijke epidermis. (A) Weefselintegriteit gemeten met transepitheliale elektrische weerstand (gemiddelde ± SEM, n=6). (B) ET50 bepaald door het meten van de levensvatbaarheid van weefsel (d.w.z. MTT-test) bij topische blootstelling aan 78,3 μL van 1% Triton X-100 (gemiddelde ± SEM, n=3).
Responsiviteit van RhEs werd onderzocht op bekende pro-inflammatoire stimuli. RhEs werden systemisch behandeld, d.w.z. toevoeging van stimuli in het medium van het basolaterale compartiment, met behulp van 100 μg/ml Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) en 40 ng/ml tumornecrosefactor alfa (TNF-α). Na 24 uur prikkels werd het celkweekmedium verzameld. De cytotoxiciteit werd gemeten met behulp van een lactaatdehydrogenase (LDH) test en vergeleken met waarden van een bekende membraanverstoorder, het Triton X-100 reinigingsmiddel (Figuur 5). Een significante toename (p < 0,05, eenrichtings ANOVA, dunnett's meervoudige vergelijkingstest) werd aangetoond in LDH-activiteit in RhEs behandeld met Triton X-100. LPS- en TNF-α behandelingen bleken beide niet cytotoxisch te zijn.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Figuur 5: De cytotoxiciteit gemeten via lactaatdehydrogenase (LDH) test. Gegevens worden gepresenteerd als relatieve waarden voor controle, onbehandelde weefsels (CTRL); gemiddelde ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Significantie werd getest met eenrichtings ANOVA, dunnett's meervoudige vergelijkingstest. Asterisk geeft statistisch significant verschil aan ten opzichte van CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
De afgifte van interleukine 1 alfa (IL-1α) en interleukine 8 (IL-8) in het RhE-medium werd gekwantificeerd met behulp van ELISAs. Figuur 6 toont zowel de gekwantificeerde als relatieve IL-1α en IL-8 release door de RhEs bij uitdaging met LPS en TNF-α. LPS-behandeling resulteerde in een statistisch significante (p < 0,05, ongepaarde Student's T-test) geïnduceerde afgifte van IL-8 (9,6 ± 1,0 voudige toename) en IL-1α (2,7 ± 1,3 voudige toename). TNF-α veroorzaakten geen significant IL-8-afgifte, hoewel een tendens van verhoogde IL-8-niveaus werd waargenomen (2,3 ± 0,8 keer toename). TNF-α echter significant (p < 0,05, onbetaalde Student's T-test) il-1α release (1,8 ± 0,5 keer toename) geactiveerd.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Figuur 6: Pro-inflammatoire reacties in de gereconstrueerde menselijke epidermis. Concentraties van IL-8 worden door de RhE vrijgegeven bij een 24-uurs uitdaging met LPS (A) en TNF-α (B). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van relatieve waarde in vergelijking met controle, onbehandelde weefsels (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). De concentratie van IL-1α-afgifte van de RhE bij een 24-uurs uitdaging met LPS (D) en TNF-α (E). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van de relatieve waarde in vergelijking met CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Significantie werd getest door een ongepaarde Student's T-test. Asterisk geeft statistisch significante verschillen aan ten opzichte van CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

In vitro of geconstrueerd menselijk epidermismodel werd voor het eerst ontwikkeld in de jaren negentig met als primair doel alternatieve testmethoden voor dierproeven te ontwikkelen. Die 3D-epidermale modellen worden nu vaak gebruikt om zowel de veiligheid als de werkzaamheid van cosmetische ingrediënten te testen. Terwijl het bij verschillende weefselleveranciers kan worden gekocht, geeft het kunnen reconstrueren van een 3D-model in een laboratorium meer flexibiliteit tot het eindpunt van het belang.Er zijn verschillende onderzoeksartikelen die kort het reconstitutieprotocol van een 3D-epidermale model beschrijven, maar er was tot op heden geen video beschikbaar die de kritieke stappen van het reconstitutieproces liet zien. Dit is de reden achter de publicatie van dit videodocument. De voorbereiding van interne gereconstrueerde menselijke epidermis zorgt voor veel vrijheid in het cultiveringsproces, zoals veranderingen in de gemiddelde samenstelling van de cultuur, pro-inflammatoire of oxidatieve stresstriggers, het uitschakeling van genen van belang en de remming of stimulatie van bepaalde biologische processen.Om te beginnen ontdooit u een flacon met 1 miljoen cryo-geconserveerde normale menselijke epidermale keratinocyten, of NHEKs, in een waterbad bij 37 graden Celsius door een deel van de flacon in water onder te dompelen. Incubeer de flacon gedurende één tot twee minuten in het waterbad, totdat slechts een klein stukje ijs zichtbaar is. Resuspend de cellen zeer zorgvuldig door pipetting op en neer twee tot drie keer.Breng de celsuspensie over in twee T75-kolven met in totaal 15 milliliter vooraf gewaarschuwd ontdooimedium, wat resulteert in een zaaidichtheid van 6,7 maal 10 tot de vierde cel per vierkante centimeter. Vul 24 putplaten voor met 1,5 milliliter ondergedompeld medium, idealiter met een dispenserpipet. Na het cultiveren van de cellen tot 80% samenvloeiing, zijn ze klaar voor het zaaien in inserts voor de teelt van gereconstrueerde menselijke epidermis, of RHE's.Verwijder het basale medium uit de T75-kolven met de NHEKs. Spoel de cellen af door vijf milliliter voorverwarmde PBS aan elke T75-kolf toe te voegen en verwijder vervolgens het PBS uit de kolven. Voeg aan elke kolf twee tot drie milliliter voorverwarmde 0,05% Trypsine-EDTA toe en zorg ervoor dat de trypsineoplossing gelijkmatig over het celkweekgebied van de kolf wordt verdeeld.Plaats de kolven gedurende vier minuten in de celkweek-incubator en controleer vervolgens of de cellen met behulp van de microscoop bij een vergroting van 10 X loskomen. Rap de kolf om de cellen van het oppervlak van de kolf te helpen loslaten. Zodra alle cellen zijn losgemaakt, voegt u een gelijk volume voorverwarmde trypsineremmer toe aan elke T75-kolf en brengt u de celsuspensie van de kolven over naar een centrifugebuis.Spoel de kolven af met vijf milliliter voorverwarmde PBS en breng deze over op de centrifugebuis met de celsuspensie. Centrifugeer de geoogste cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G. Gooi het grootste deel van het supernatant voorzichtig weg en laat ongeveer 100 tot 200 microliter in de buis achter.Beweeg de buis voorzichtig met uw vingers om de pellet voorzichtig los te maken. Resuspend de pellet van cellen voorzichtig in een laag volume ondergedompeld medium, pipetting op en neer 5 tot 10 keer om een uniforme cel suspensie te garanderen. Begin met een laag volume om de vorming van celaggregaten te voorkomen en voeg tot één milliliter ondergedompeld medium per eerste T75-kolf toe.Tel de cellen in de suspensie met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode. Verdun de celsuspensie met extra ondergedompeld medium om een concentratie van 3.525 keer 10 tot de vijfde cel per milliliter te bereiken, met behulp van de eerste vergelijking in het teksthandschrift. Voer een tweede celtelling van de verdunde oplossing uit en gebruik de tweede vergelijking in het teksthandschrift om het celsuspensievolume te berekenen dat in de kweekinvoeging moet worden gezaaid.Hang de 24 putcultuur inzetstukken in de hoogste positie van de draagplaat en breng de draagplaat over naar de 24 putplaat die voorgevuld is met ondergedompeld medium. Voeg het bepaalde volume van de celsuspensie toe aan elke insert, waarbij u ervoor zorgt dat u de insert niet aanraakt. Na het zaaien, incubeer de 24 putplaten gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur om een randeffect te overwinnen.Verplaats de platen gedurende deze tijd niet. Breng de platen over naar de celkweek-incubator en laat ze drie dagen onder water staan. Na een incubatie van drie dagen in de celkweek-incubator, stel de cellen die zich aan het membraanoppervlak hebben vastgekleefd bloot aan de luchtvloeistofinterface, of ALI, door het ondergedompelde medium uit het apicale compartiment te verwijderen met een aspiratiesysteem en een glazen Pasteur-pipet.Vul nieuwe 24 putplaten met 1,5 milliliter vers voorverwarmd ALI-medium en breng de draagplaten met de kweekinzetstukken over naar de nieuwe multi-well platen. Breng de multi-well platen terug naar de celkweek incubator. Ververs het ALI-medium om de twee tot drie dagen, gedurende 14 dagen.Keratinocyten in 2D-cultuur vertonen een traditionele morfologie met een consistente veelhoekige vorm. Na 15 dagen bij ALI vormt de gereconstrueerde menselijke epidermis een volledig gelaagd weefsel, wat wordt aangegeven door de vier belangrijkste epidermale lagen. Ultrastructurele analyse van de gereconstrueerde menselijke epidermis op verschillende tijdstippen in het reconstitutieprotocol onthult het cornificatieproces, met een verhoogd aantal hoornvliesplaatslagen in de loop van de tijd.Keratinocyten in de epidermis vertonen verschillende eiwitexpressieprofielen volgens hun differentiatiefase. Involucrine-expressie komt meer voornamelijk voor in de SG-laag, terwijl de expressie van filaggrin en loricrine zich in de bovenste lagen bevindt. Keratine-10 expressie werd gevonden in alle levensvatbare lagen behalve de SB laag.De gereconstrueerde menselijke epidermis vertoont functionele desmosomale verbindingen, zoals aangegeven door de expressie van Desmoglein-1 in de intercellulaire ruimte van de levensvatbare epidermale lagen. De barrière-eigenschappen van het gereconstrueerde epidermismodel werden onderzocht door de levensvatbaarheid van het weefsel te beoordelen bij topische behandeling met een bekende barrièreverstoorder en door de weefselintegriteit te beoordelen. De weefselintegriteit werd na 15 dagen bepaald door de TEER te meten met een voltmeter.Responsiviteit van de epidermis op Lipopolysaccharide en Tumor Necrosis Factor alpha werd onderzocht. Zowel LPS- als TNF-alfabehandelingen waren niet giftig. ten opzichte van de Triton X-100 besturing.De afgifte van Interleukine-1 alfa en Interleukine-8 in het RHE-medium werd gekwantificeerd met behulp van IL-lysis. Lps behandeling resulteerde in een statistisch significante up-regulatie in de release van Interleukin-1 alfa en Interleukine-8. TNF-alfabehandeling resulteerde in een statistisch significante up-regulatie in alleen de afgifte van Interleukine-1 alfa.Echter, een duidelijke tendens van verhoogde Interleukin-8 niveaus werd ook waargenomen bij stimulatie met TNF alpha. Volgens dit protocol kan TEER worden gemeten als een waarde voor barrière-integriteit. De levensvatbaarheid of cytotoxiciteit kan bijvoorbeeld worden gemeten aan de hand van een MTT- of LDH-test.Het supernatant kan worden gebruikt om de afscheiding van cytokinen of andere eiwitten te meten. Bovendien kan het weefsel worden gebruikt om de expressie van eiwitten of genen van belang te bestuderen.

cultivating-three-dimensional-reconstructed-human-epidermis-at-large

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit rapport beschrijven we de drie-dimensionale huid te reconstrueren model dat de menselijke huid nabootst in de architectuur en compositie. Melanocyt fysiologie, melanoomprogressie en het lot van dermale stamcellen zijn onderzocht met behulp van de huid te reconstrueren model. Het model is ook bruikbaar als een preklinische hulpmiddel voor drugs beoordeling.

De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

This video describes the detailed protocol for generating in vitro 3D organotypic skin reconstructs to study melanoma progression. This skin model mimics both the architecture and multicellular complexity of organs in vivo.

Generation of Organotypic Full Skin Reconstructs: A Procedure to Establish 3D Skin Model Using Human Skin Samples

This video protocol describes a cassette-based in vitro culture technique to generate human organotypic skin using epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. They mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis

Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.

Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een sferoïde huidmodel voor 3D organotypic melanoom die zowel de architectuur recapituleert en meercellige complexiteit van een orgel/tumor in vivo maar tegelijkertijd herbergt systematische experimentele interventie.

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Hier presenteren we goedkope en eenvoudige procedures om verschillende 3D-huidmodellen te introduceren voor routineonderzoek in een celkweeklaboratorium. Onderzoekers kunnen modellen maken die zijn afgestemd op hun behoeften zonder afhankelijk te zijn van in de handel verkrijgbare modellen.

Opbouw van huidmodellen voor tal van toepassingen - van tweedimensionale (2D) monocultuur tot driedimensionale (3D) multicultuur

Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.

Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem

Leer een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis kweken op grote schaal met normale humane epidermale keratinocyten. Deze methode maakt flexibele experimenten mogelijk voor huidonderzoek zonder dierproeven.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Meer video's verkennen