Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie

Dit protocol biedt de mogelijkheid om immuunpolarisatie van humane monocyt-afgeleide cellen te volgen op basis van visualisatie en diepe karakterisering van groen fluorescent eiwit-gelabelde Mtb in verschillende macrofaagsubsets met behulp van 10-kleurig flowcytometrie. Dit vertegenwoordigt een efficiënte en reproduceerbare methode om reacties op Mtb-infectie in M1 of M2 gepolariseerde macrofagen te bestuderen, inclusief beoordeling van fenotype en functie vóór en na infectie. Om PBMC uit humane donor buffy coats te isoleren, gebruik een pipet om langzaam 15 milliliter buffy coat bloed over de zijkant van een 50 milliliter buis te leggen op 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium en de cellen te scheiden door centrifugatie.

Gebruik een steriele Pasteur pipet om de bovenste plasmalaag te verwijderen en draag voorzichtig de mononucleaire cellayer over in een nieuwe 50 milliliter buis. Voeg serumvrij RPMI-medium toe aan de cellen tot een eindvolume van 50 milliliter en draai de buis een paar keer voorzichtig om voordat u centrifugeert. Hersuspendeer vervolgens de cellen in 20 milliliter serumvrij medium voor het tellen.

Om macrofaagdifferentiatie te initiëren, verdun de cellen tot een 5 keer 10 tot de 6de cellen per milliliter serumvrij medium concentratie en zaai twee milliliter cellen in afzonderlijke putjes van een zes-putjesplaat. Plaats de plaat in de celcultuur incubator voor twee tot drie uur om de cellen te laten hechten aan de bodem van de putjes. Aan het einde van de incubatie, was de putjes drie keer met één milliliter serumvrij medium per wasbeurt en voeg twee milliliter compleet RPMI medium toe, aangevuld met 50 nanogram per milliliter van GM-CSF of 50 nanogram per milliliter van M-CSF voor respectievelijk M1 of M2 differentiatie aan elke put met adhesieve cellen.

Drie dagen na het begin van polarisatie, vervang voorzichtig één milliliter supernatant van elke put met één milliliter vers compleet medium, aangevuld met de juiste groeifactoren. Op dag zes van de cultuur, voeg 50 nanogram per milliliter van interferon gamma en 10 nanogram per milliliter van LPS toe aan de GM-CSF behandelde putten en 20 nanogram per milliliter van IL-4 aan de M-CSF behandelde putten. Controleer regelmatig de morfologie van de monocyt-afgeleide celculturen door lichtmicroscopie om er zeker van te zijn dat de kleinere monocyten zich differentiëren in grotere macrofaag-achtige cellen.

Om een Mtb-cultuur op te zetten, meng in een bioveiligheidsniveau III faciliteit een milliliter aliquot van ontdooid bacteriënsuspensie met negen milliliter TB compleet medium in een 50 milliliter buis met gefilterde dop voor een 24-uurs incubatie in de buis in de celcultuur incubator. Verzamel de volgende dag de bacteriën door centrifugatie en hersuspendeer het pellet in 15 tot 20 milliliter vers TB compleet medium in een nieuwe 50 milliliter buis met gefilterde dop voordat u de bacteriën terugbrengt naar de celcultuur incubator. Na zeven tot 10 dagen cultuur, was de bacteriën twee keer in 35 tot 40 milliliter steriele wasbuffer per wasbeurt, hersuspendeer de bacteriën in één milliliter serumvrij RPMI medium na de tweede wasbeurt.

Voeg nog eens negen milliliter serumvrij RPMI medium toe aan de bacteriën en soniceer de bacteriën in een waterbad sonicator in Klasse II bioveiligheidskast gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Meet vervolgens de optische dichtheid van één milliliter bacteriënsuspensie bij een golflengte van 600 nanometer in een spectrofotometer geplaatst in de bioveiligheidskast. Om de monocyt-afgeleide cellen te infecteren, verdun de bacteriën tot een concentratie van 5 keer 10 tot de 6de kolonievormingseenheden per milliliter in serumvrij medium en vervang het supernatant in elke put van de zes-putjes celcultuurplaat met één milliliter vers serumvrij medium en één milliliter bacteriënsuspensie per put om een multipliciteit van infectie van vijf te verkrijgen.

Na een vier uur durende incubatie in de celcultuur incubator, was elke put drie keer met één milliliter steriele wasbuffer per wasbeurt, kantelt de plaat voorzichtig om het volledige volume buffer uit de hoeken van de putten te verwijderen na elke wasbeurt. Hersuspendeer vervolgens de Mtb-geïnfecteerde monocyt-afgeleide cellen in twee milliliter compleet medium zonder antibiotica. Om de cellen te kleuren voor flowcytometrie, incubeer de geïnfecteerde cellen met één milliliter FACS buffer aangevuld met 0,5 millimolair EDTA per put gedurende ten minste 30 minuten.

Aan het einde van de incubatie, verzamel de losgemaakte cellen met voorzichtig pipetteren en breng de cellen over in afzonderlijke schroefkapjes microcentrifugebuisjes voor centrifugatie. Hersuspendeer de cellen in ongeveer 50 microliter fluorochroom-geconjugeerd anti-humaan antilichaam cocktail en levensvatbaarheidskleurstof van belang en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. Na wassen, fixeer de cellen met 200 microliter vers bereide fixatiebuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.

Na de fixatie en wassen, hersuspendeer de cellen in 400 microliter FACS buffer en breng de cellen over in één milliliter microcentrifugebuisjes. Gebruik compensatie kralen om het fluorescente signaal voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam in het cocktail te compenseren en gebruik ongekleurde cellen om de poort voor de negatieve celpopulatie in te stellen. Verzamel vervolgens minimaal 50.000 cellen per monster.

Zowel M1 als M2 monocyt-afgeleide cellen vertonen een verticale verschuiving naar een hogere granulariteit en verminderde celgrootte bij Mtb-infectie. Een verhoogde celdood wordt ook waargenomen in Mtb geïnfecteerde M1 en M2 cellen bij een multipliciteit van infectie van vijf in vergelijking met niet-geïnfecteerde M0 cellen. Opmerkelijk is dat een aanzienlijk hogere Mtb GFP-expressie wordt waargenomen in M2 cellen na vier uur infectie in vergelijking met M1 cellen.

Niet-geïnfecteerde M1 en M2 cellen kunnen worden gekenmerkt door hun CD64 en CD86 of CD200 receptor en CD163 co-expressie respectievelijk. Na vier uur Mtb-infectie, wordt een verhoogde frequentie van CD200 receptor positieve cellen waargenomen in de Mtb GFP positieve M1 gepolarise