Ontwikkeling en testen van soortspecifieke kwantitatieve PCR-tests voor milieu-DNA-toepassingen
November 5th, 2020
Milieu-DNA-tests vereisen een rigoureus ontwerp, testen, optimalisatie en validatie voordat het verzamelen van veldgegevens kan beginnen. Hier presenteren we een protocol om gebruikers door elke stap te nemen bij het ontwerpen van een soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-test voor de detectie en kwantificering van dna van een doelsoort uit milieumonsters.
Goed geoptimaliseerde analyses zijn essentieel voor de correcte interpretatie van omgevings-DNA-gegevens. Dit protocol beschrijft de noodzakelijke ontwerp- en teststappen om zo'n analyse te ontwikkelen. Over het algemeen is omgevings-DNA een niet-invasieve methode voor het detecteren van een bepaalde soort of reeks soorten.
Het kan kosten verlagen en gevoeliger zijn in vergelijking met conventionele onderzoeksmethoden. Deze methode kan de instandhouding en wildbeheer ondersteunen door de detectie van DNA van een soort van belang, waardoor men kan concluderen dat die soort aanwezig is in het bemonsterde gebied. Vanwege de grote gevoeligheid van kwantitatieve PCR kan contaminatie gemakkelijk optreden, en negatieve controles zijn nodig om stappen te identificeren waarbij contaminatie is geïntroduceerd.
eDNA is een vakgebied vol jargon en afkortingen. Voor degenen die niet thuis zijn in moleculaire biologie of qPCR, kunnen visuele demonstraties helpen bij het plannen van een experimenteel ontwerp, van conceptualisering tot het genereren van gegevens. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dannise Ruiz Ramos, een biologe uit ons laboratorium, en Trudi Frost, een student-laboratoriumassistent.
Om te beginnen, zoek en download sequenties van meerdere gengebieden voor soorten van belang via NCBI's Nucleotide Database. Selecteer alle sequenties die aan de specificaties voldoen en selecteer Verzenden naar.Kies Volledige Record, Bestand, Download Formaat als GenBank of FASTA en klik vervolgens op Bestand maken. Deze sequenties worden nu opgeslagen op de computer.
Herhaal deze stappen voor alle soorten van belang. Bewaar sequenties voor elk gengebied in een apart bestand, omdat ze apart worden geanalyseerd. Om de sequenties van elk gengebied afzonderlijk uit te lijnen, importeer de gedownloade sequentiebestanden in een sequentie-uitlijningsprogramma, zoals Geneious Prime-software.
Maak aparte mappen voor elk gengebied en selecteer vervolgens alle sequenties binnen een map die sequenties van één gengebied bevat. Gebruik de Multiple Alignment tool om een nucleotide-uitlijning te maken, zoals Geneious of MUSCLE van de geselecteerde sequenties. Kies veelbelovende gebieden voor assayontwerp door het visualiseren van uitgelijnde sequentiegegevens.
Selecteer een gebied dat veel sequentiegegevens bevat voor de soort van belang, hoog divergent is tussen soorten en een lage variantie binnen de soort vertoont. Ontwerp vervolgens de assay-primers en sonde. Gebruik qPCR-assay-ontwerpsoftware om vijf sets qPCR-assays te ontwerpen.
Plak de geselecteerde sequentie in het Sequence Entry-vak. Als er spaties in de uitlijning zijn gemaakt, verwijder deze dan uit de sequentie. Selecteer qPCR 2 primers probe in de Kies uw ontwerp optie en download vervolgens de aanbevolen assays.
Kopieer de sequenties van de voorwaartse primer van de eerste assay en zoek naar deze primersequentie in de eerder gemaakte uitlijning. Als u Geneious Prime gebruikt, gebruik dan de Annotate Predict tool om het primergebied aan de uitlijning toe te voegen. Doe dit voor alle primer- en sondecombinaties.
Inspecteer deze gebieden van de uitlijning op variatie binnen de doelsoort, evenals binnen de mede-optredende soorten. Test primers in silico via NCBI's Primer-BLAST. Plak primers in het gebruik mijn eigen primer vak onder Primer Parameters.
Selecteer in de opties voor Prime Pair Specificity Checking Parameters NR als de Database en typ de taxonomische orde of familie van de organisme van belang in het Organisme vak. Zorg ervoor dat de geselecteerde primers waarschijnlijk geen niet-doelsoorten zullen amplificeren. Test de efficiëntie van de assay in vitro door een standaardcurve te maken en bepaal de efficiëntie en lineaire reikwijdte van de curve.
Test minstens zes tienvoudige verdunningen van een synthetisch DNA-standaard met de doelsequentie, met ongeveer één tot een miljoen kopieën per reactie. Gebruik de qPCR-software om de CQ-waarde van elke standaard op de Y-as en de logaritme op basis 10 van de initiële standaardconcentratie in kopieën per reactie op de X-as uit te plotten. De qPCR-software zou automatisch een lineaire regressie moeten uitvoeren.
Bereken de efficiëntie uit de helling van de regressie. Inspecteer de standaardcurve visueel op vooringenomenheid of voor slechte prestaties, zoals gemeten door efficiëntie en R-kwadraat waarden. Gebruik een interne positieve controle om PCR-remming van daadwerkelijke veldmonsters te testen, wat kan leiden tot een afname van de gevoeligheid en valse negatieven.
Bepaal de detectie- en kwantificeringslimieten voor elke assay. Test assays met niet-doelsoorten om de specificiteit te verifiëren en zorg ervoor dat de assay goed presteert met een IPC multiplexed. Assays met goede gevoeligheid, specificiteit en efficiëntie kunnen doorgaan naar de volgende stappen.
Voer in situ-testen van de assay uit door meerdere watermonsters te verkrijgen en deze te verwerken voor qPCR. Voer de kwantitatieve PCR-assay uit en vergelijk eDNA-concentratie en detectiefrequentie met bekende verschillen in voorkomen en abundantie op de locatie. Bevestig alle detecties door middel van sequentiebepaling.
Beschikbare sequenties van alle Unionidae-soorten in de Clinch River werden gedownload en uitgelijnd. Na het ontwerpen van meerdere assays, werden vijf sets primers en sondes toegevoegd aan de uitlijning voor visuele evaluatie. De primer- en sondesets werden in silico en in vitro getest.
In het laboratorium werden alle assays getest met DNA-extracties van 27 beschikbare soorten om de specificiteit te verifiëren. Eén assay amplificeerde met succes alleen de doelsoort. Een succesvolle assay met goede efficiëntie en R-kwadraat waarden wordt hier getoond.
De LOD en LOQ voor de geselecteerde assay waren beide vijf kopieën per reactie. In tegenstelling hiermee werden assays die een standaardcurve met slechte efficiëntie produceerden, weggegooid. In een goede qPCR versterken de standaardverdunningen bij gelijkmatig verdeelde kwantificeringswaarden van ongeveer 3,3 cycli voor elke tienvoudige concentratieverschil.
In een slechte qPCR kunnen standaarden ongelijkmatige variatie in kwantificeringswaarden tussen verdunningen vertonen. IPC-amplificatie voor onbekende monsters moet worden vergeleken met de resultaten van de negatieve sjablooncontrole IPC. Als er geen remmers in de monsters aanwezig zijn, zou alle IPC-amplificatie een strakke groepering in de plot moeten hebben, met kwantificeringswaarden die bijna
Overzicht
Dit protocol beschrijft het ontwerp en de optimalisatie van soortspecifieke, sonde-gebaseerde qPCR-assays voor het detecteren van omgevings-DNA (eDNA). Het benadrukt het belang van rigoureuze assayontwikkeling om nauwkeurige data-interpretatie te garanderen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Omgevings-DNA-analyse
- Kwantitatieve PCR (qPCR)
- Conservatiebiologie
Achtergrond
- Omgevings-DNA is een niet-invasieve methode voor soortdetectie.
- Het kan gevoeliger en kosteneffectiever zijn dan traditionele onderzoeksmethoden.
- Contaminatie is een belangrijke zorg, wat strikte controles vereist.
- Visuele hulpmiddelen kunnen het begrip van assayontwerp voor niet-experts verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een uitgebreid protocol te bieden voor het ontwikkelen van qPCR-assays.
- Om de detectie van DNA van doelspecies uit omgevingsmonsters te vergemakkelijken.
- Om behoud- en wildbeheerpraktijken te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Sequencie-opvragen uit NCBI's Nucleotide Database.
- Sequentie-uitlijning met software zoals Geneious Prime.
- Ontwerpen van qPCR-primers en sondes op basis van uitgelijnde sequenties.
- Testen van assay-efficiëntie en specificiteit door middel van in silico en in vitro methoden.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle amplificatie van DNA van doelspecies met hoge efficiëntie.
- Bepaling van detectie- en kwantificeringsgrenzen voor assays.
- Verificatie van assay-specificiteit tegen niet-doelspecies.
- Demonstratie van effectieve eDNA-detectie in veldmonsters.
Conclusies
- Goed ontworpen qPCR-assays zijn cruciaal voor nauwkeurige eDNA-analyse.
- Assays moeten rigoureus getest worden op efficiëntie en specificiteit.
- Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers op dit gebied.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Species-specific qPCR assay development enables precise, non-invasive detection of target organisms from environmental samples, supporting early-stage biological hypothesis testing in conservation and toxicology contexts. Rigorous assay validation provides quantitative, reproducible data that improves predictive confidence in species presence/absence calls, reducing false positives and negatives in field monitoring. This approach strengthens translational continuity from discovery to application by delivering scalable, standardized tools for biodiversity assessment and ecological risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of species-specific genetic markers to clarify target presence in complex environmental matrices.
- Operational Value: Supports functional validation of ecological targets through sensitive, quantitative detection of low-abundance DNA.
- Predictive Value: Establishes confidence in biomarker-like signals for species occupancy, informing go/no-go decisions in environmental monitoring programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated primer-probe sets with defined limits of detection and quantification for reliable eDNA quantification.
- Operational Value: Ensures assay specificity through empirical testing against non-target species, minimizing cross-reactivity in multiplexed formats.
- Scalability: Standard curve generation enables normalization across batches and sites, supporting longitudinal and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular detection outputs to ecological outcomes, enabling correlation of eDNA levels with species abundance and distribution.
- Disease-Relevant System: Applicable to pathogen or invasive species surveillance in aquatic systems, supporting early-warning monitoring frameworks.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in environmental sampling by linking DNA signal to biological origin through sequencing confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay development workflow fits within early discovery to translational validation, providing a standardized path from sequence data to field-deployable detection tools for species-specific monitoring.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding species presence, distribution, and ecological interactions through targeted genetic interrogation.
- Screening: Delivers ready-to-use, optimized qPCR assays with defined dynamic range and sensitivity for high-throughput environmental sample analysis.
- Analytics: Generates quantitative Cq data convertible to DNA copy numbers, enabling statistical comparison across conditions and time points.
- Translational Research: Supports extrapolation from lab validation to field application via IPC controls and sequencing verification of positives.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay development pipeline applicable to multiple species or gene targets across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic confidence in species detection by linking qPCR signal to specific genetic targets.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows with built-in contamination controls and inhibition monitoring.
- Strategic Value: Improves decision-making in environmental programs by reducing uncertainty in species detection data.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of sampling sites or conservation actions based on validated eDNA signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, sequence alignment, and qPCR optimization.
- Dependent on access to qPCR instrumentation, bioinformatics tools, and synthetic DNA standards.
- Necessitates standardized SOPs for sample processing, DNA extraction, and negative control inclusion.
- Must account for environmental inhibitors through IPC multiplexing in field sample analysis.
- Limited by availability of reference sequences and potential for primer-dimer or off-target amplification in complex backgrounds.
