Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel

Dit model kan worden gebruikt om cellulaire mechanismen te bestuderen die betrekking hebben op de pathogenese van immuungemedieerde menselijke posterieure uveïtis. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de translationele studie van menselijke uveïtis bij het monitoren van de werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen en voor het bieden van mechanistisch inzicht in de progressie van chemische ziekten. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit model is de betrouwbaarheid van ziekte-inductie en het gebruik van niet-invasieve endoscopische technieken waarmee we de progressie van de ziekte kunnen volgen.

Hier beschrijven we hoe de ziekte te induceren en de pathologie te beoordelen met behulp van verschillende uitlezingen Om IRBP 1-20 compleet Freund's Adjuvans of CFA te bereiden, resuspendeert u een berekende hoeveelheid van het peptide in een minimumvolume van 100% DMSO. Wanneer het poeder volledig is opgelost, voegt u kleine volumes PBS toe aan de buis totdat u het uiteindelijke berekende volume PBS bereikt op basis van het aantal muizen dat moet worden geïnjecteerd met behulp van zachte agitatie om de oplossing te mengen. Na het bereiden van het volledige Freund's Adjuvans, pipetteer de oplossing voorzichtig en regelmatig om een viscus en gelijkmatig verdeelde emulsie te vormen terwijl u de DMSO PBS-peptideoplossing druppelsgewijs toevoegt in een één-op-één verhouding met de suspensie.

Om de oplossingen te beluchten, gebruikt u een pipet van 1000 microliter op 700 microliter om de oplossing herhaaldelijk te pipetteren totdat een dikke, romige emulsie is verkregen. Voordat u de peptidesuspensie injecteert, plaatst u elke muis die moet worden geïnjecteerd in een aparte kooi en gebruikt u een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 23 gauge om intraperitoneaal 1,5 microgram Bordetella kinkhoesttoxine af te leveren in 100 microliter RPMI 1640-medium aangevuld met 1% muizenserum aan elk dier. Wanneer kinkhoesttoxine-oplossing is geïnjecteerd, moet de muis in een nekvelachtige positie worden gehouden en de huid worden samengeknepen om een tentachtige structuur aan de achterkant van de nek te vormen.

Rijg de naald aan de ruimte tussen de vinger en duim en injecteer 200 microliter van de IRBP-emulsie op de tenthuid, handhaaf de druk na de injectie en draai de naaldkop om de huid te sluiten voordat deze wordt ingetrokken. Om de klinische ziekte te scoren, bevestigt u op dag 21 na injectie een gebrek aan respons op de bloembladreflex in de verdoofde peptide geïnjecteerde muis en houdt u het dier in een nekvel. Breng topisch 1% tropicamide en 2% fenylefrine aan op het hoornvlies van elk oog onmiddellijk na injectie.

Wanneer de pupillen volledig zijn verwijd, plaatst u de muis op een speciaal gebouwd microscoopstadium. Plaats de microscoop voor volledige toegang tot het netvlies. Pas het oogstuk tijdens het beeldvormingsproces indien nodig aan om de optische schijf en het netvlies te zien en beelden van het hele netvliesgebied te verkrijgen, waarbij alle hoeken van de periferie worden aangepast en bedekt.

Om vaatlekkage te meten, dient u 100 microliter 2% fluoresceïne subcutaan toe aan de achterkant van de nek en verplaatst u de muis zodanig dat het netvlies zich in het midden van het live beeld bevindt. Stel de fundoscoop in op een excitatiefilter voor blauw licht op 465 tot 490 nanometer voordat u een beeld van elk krijgt op 1,5 en zeven minuten na fluorescerende injectie. Wanneer alle beelden zijn verkregen, levert intraperitoneaal een anti-sedatie-injecteerbaar voor herstel en plaatst de muis in een kooi op een voorverwarmde mat met toegang tot nat geweekt dieet met monitoring totdat de muis weer bij bewustzijn komt.

Voor klinische ziektescores van de beelden, baseer de klinische beoordeling op de ernst van de optische schijfontsteking, retinale vaatmanchetten, retinaal weefselinfiltraat en structurele schade. Scoor elk van deze parameters op een schaal van één tot vijf. Het collectieve totaal is representatief voor de klinische ziekte voor het hele oog met een maximale score van 20 per oog.

Na fundusbeeldvorming voor het uiteindelijke klinische eindpunt van het onderzoek, euthanaseert u de muis. Voor histologische analyse, prijs de oogleden uit elkaar voor toegang tot het hele oog, plaats vervolgens gebogen tangen achter de bol om het orbitale bindweefsel en de oogzenuw te grijpen en het oog te enucleeren. Plaats het enucleated oog in één tot vijf milliliter 4% glutaaraldehyde gedurende minimaal 15 minuten voordat u het orgaan gedurende ten minste 24 uur overbrengt naar één tot vijf milliliter 10% formaldehyde.

Na histologische weefselkleuring, volgens standaardprotocollen, toegewezen scores op een schaal van nul tot drie op basis van het niveau van immuuncelinfiltratie en de mate van retinale schade. Fundoscopische veranderingen worden tijdens ziekteprogressie geclassificeerd als inflammatoire veranderingen die retinale weefsel- en vasculaire en optische schijfontsteking en retinale structurele schade omvatten, naast histologische veranderingen op basis van infiltrerende immuuncellen en structurele stoornissen. Deze klinische en histopathologische veranderingen kunnen worden beoordeeld en gescoord om de progressie van de ziekte te beoordelen en de werkzaamheid van therapeutische interventies te evalueren.

Vasculaire lekkage is ook een pathologisch kenmerk van het model en van menselijke uveïtis. Zoals geïllustreerd in deze analyse, kan fluoresceïne worden gebruikt om vasculaire lekkage te visualiseren als een andere uitlezing van dit model. Het is essentieel voor onderzoekers om ervoor te zorgen dat de emulsie correct wordt voorbereid zonder tekenen van scheiding tussen de oplossingen.

Ze moeten grondig worden gemengd en het eindproduct moet glad van textuur zijn. Deze procedure kan worden gecombineerd met andere toedieningsmethoden voor geneesmiddelen en met voor cytometrie voor fenotypering infiltrerende retinale immuuncelpopulaties.