Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Onze multiplex immunofluorescente, op cellen gebaseerde detectie van DNA, RNA en eiwit benadering stelt ons in staat om gelijktijdig eiwitten en nucleïnezuren van verschillende typen en strengen binnen enkele cellen te visualiseren. Voor het zaaien, incubeer dekglasjes gedurende vijf minuten in ethanol, gevolgd door twee wasbeurten van twee minuten in PBS. Na de tweede wasbeurt, dompel het dekglas volledig onder in 20 microgram per milliliter poly-D-lysine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, verwijder de overtollige matrixoplossing met twee wasbeurten in PBS en verdun de cellen van belang op een concentratie van 1 x 10 tot de zesde cellen per 50 microliters PBS per dekglas. Zaai vervolgens 50 microliters van de cellen van belang op elk poly-D-lysine gecoat dekglas voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in PBS voordat je ze fixeert in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen twee keer in PBS voordat je de cellen permeabiliseert met 500 microliters van 0,1% Tween 20 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was elk dekglas twee keer met 500 microliters vers PBS per wasbeurt. Om het dekglas op een glasplaat te immobiliseren, plaats een kleine druppel heldere nagellak op een gesteriliseerde glasplaat en plaats een rand van de celvrije kant van het dekglas op de druppel nagellak en laat het dekglas met de celzijde naar boven op de glasplaat zakken.

Voeg een paar druppels PBS toe aan het geïmmobiliseerde dekglas om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel te tekenen rond de buitenkant van het dekglas. Wanneer de barrière is getekend, vervang de PBS met 100 microliters van protease III en plaats de glasplaat in een incubator van 40 graden Celsius gedurende 15 minuten. Aan het einde van de incubatie, was de glasplaten twee keer in vers PBS gedurende twee minuten per wasbeurt met schommelen.

Na de tweede wasbeurt, verdun de sonde van belang in 200 microliters hybridisatiebuffer bij 67 graden Celsius gedurende 10 minuten. Aan het einde van de incubatie, voeg 50 microliters van de sondeoplossing toe aan elk dekglas en plaats de glasplaten in een bevochtigde oven van 40 graden Celsius gedurende twee uur. Aan het einde van de incubatie, was de glasplaten twee keer met vers wasbuffer en schommelen gedurende twee minuten per wasbeurt.

Na de tweede wasbeurt, tik op de glasplaten om de overtollige buffer te verwijderen en behandel de dekglasjes sequentieel met één druppel van de versterkers voor de fluorescente kanalen 1, 2 en 3 gedurende 30 minuten, 40 graden Celsius per versterker met twee wasbeurten van twee minuten in vers wasbuffer met schommelen per wasbeurt tussen de behandelingen. Na de laatste wasbeurt, voeg een druppel van de fluorescente kanaal 4 versterker toe aan het dekglas voor een incubatie van 15 minuten in de oven van 40 graden Celsius en was de glasplaat twee keer met wasbuffer en een keer met PBS zoals aangetoond. Voor immunokleuring van de eiwitten van belang, behandel na de laatste wasbeurt elk dekglas met 200 microliters blokkeerbuffer voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, decanteer de blokkeerbuffer en voeg 200 microliters van de primaire antilichaam van belang toe, verdund in PBS plus Tween 20 aangevuld met 1% bovien serumalbumine. Na een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, was de glasplaten met twee wasbeurten van 10 minuten in vers PBS plus Tween 20 met schommelen per wasbeurt voordat je de monsters labelt met een geschikt secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de glasplaten twee keer met vers PBS plus Tween 20 gedurende 10 minuten met schommelen per wasbeurt.

Na de tweede wasbeurt, contrakleur de kernen met een geschikte nucleaire kleurstof gedurende één minuut bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met schommelen. Om de monsters voor beeldvorming te monteren, plaats een druppel antifade oplossing op een nieuwe steriele glasplaat per monster en verspreid de oplossing om een gebied te bedekken dat ongeveer de grootte van de dekglasjes is. Trek de dekglasjes los van hun glasplaten en dompel de dekglasjes onder in PBS.

Gebruik pincetten om eventueel resterend nagellak te verwijderen en droog de achterkant van het dekglas af met een laboratoriumdoekje. Plaats vervolgens elk dekglasmonster voorzichtig met de kant omlaag op de antifade oplossing en laat de monsters een nacht drogen. Als bewijs van concept van deze procedure, werden HIV-1 DNA, RNA en eiwit gelijktijdig gelabeld en microscopisch gevisualiseerd op het niveau van enkele cellen.

In dit voorbeeld kunnen twee HIV-1 DNA-genomen binnen een enkele cel worden gevisualiseerd omdat ze actief de virale RNA aan het transcriberen zijn. Het virale RNA werd geëxporteerd via het nucleaire poriecomplex en het virale eiwit werd gesynthetiseerd in het cytoplasma. Zoals waargenomen, is er zeer weinig tot geen kruisreactiviteit waargenomen tussen de sondesets tussen de twee virussen, ondanks het labelen met twee retrovirussen met een potentieel voor sonde-kruisreactiviteit.

Virale RNA-kleuring kan ook worden geëlimineerd als de cellen tijdens de monstervoorbereiding worden behandeld met RNase. De gemiddelde geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van het antilichaamssignaal per cel in elk beeld kan vervolgens worden gekwantificeerd. Zoals waargenomen, neemt de hoeveelheid HBV pre-genomisch RNA en totaal HBV RNA toe gedurende het verloop van de HBV-infectie.

HCV-infectie beeldvorming kan ook worden uitgevoerd via confocale microscopie met behulp van een 60X olie-immersie objectief om de fluoroforen van belang te detecteren. Deze zeer specifieke benadering maakt ook het vol